检验牛乳中抗生素残留量的微生物制剂制备方法及其应用

摘要

一种检验牛乳中抗生素残留量的微生物制剂的制备方法及其应用。本发明制备方法包括：标志菌液的高浓度培养，浓缩，添加保护剂，干燥，加入填充剂，充分混合后真空包装制得。其应用包括待用测试菌液配制，待检乳样加入上步中待用测试菌液，水浴培养，检样呈乳的原色时为阳性，呈红色为阴性。本发明在保持了TTC检测法可靠性的基础上解决了菌种保藏和活力不稳的问题；制成微生物制剂，节省了原实验中“菌液制备”步骤；减少了菌种保藏和传代过程中资金、设备和人员的投入，使原检测实验的总体时间从20小时缩短至5小时左右，并且使检测过程易于控制和管理，检测结果更加稳定可靠，便于乳品企业和广大消费者对牛奶中抗生素的快速检测。

说明书

【技术领域】：本发明涉及一种检验牛乳及其制品中抗生素残留量的高活性干微生物制剂的制备，及其在牛乳及其制品中抗生素残留量快速检验中的应用。

【背景技术】：自被发现以来，抗生素给人类和动物防治疾病做出了很大的贡献，但同时又给人类带来了很多的副作用，例如药物残留引起的耐药菌株在人体内潜在的危害已相当大。

牛乳中抗生素残留的主要危害有：

(1)对人类健康的危害：使人被动地接受、积累抗生素，对抗生素产生耐药性，患者用抗生素治疗的效果下降。有些过敏体质的人食用含抗生素的乳制品后会引起不良反应，严重时可危及生命。此外，经常食用抗生素残留超标的乳制品会破坏人体内肠道菌群的自然平衡，对人体产生直接或间接损伤，甚至有致癌、致畸和致突变的作用。

(2)对乳制品生产的危害：没有优质的原料乳就无法生产出优质的乳制品。原料乳中抗生素残留物严重干扰发酵乳制品的生产，影响发酵乳、奶酪、黄油等的起酵和后期风味的形成，破坏了牛乳的纯净和加工价值，造成原料乳的大量浪费，致使企业遭受巨大的经济损失。

世界各地区或组织机构对牛乳中抗生素都加以严格的控制和管理。我国的相关规定中也明确指出原料乳中的抗生素不得检出。

目前检测鲜牛乳中抗生素残留的主要方法有：

(1)理化分析法：色谱技术；准确，但需要特殊的检测设备和药品，检测成本高，样品的预处理过程繁杂。

(2)免疫受体试验法：放射免疫法、荧光免疫法、酶联免疫法等；方便快捷，但特异性很强，检测成本较高。

(3)微生物受阻检测法：TTC法、混浊度实验等；可靠性高，操作简单，费用低，但是整体检测时间较长，检测结果对标识微生物的活性有一定依赖性。

目前我国国家标准(GB4789.27-94)中只规定了TTC法为法定的检测乳品中抗生素残留的方法。根据国标，在正式检测之前，需要对菌种进行长达15小时的活化过程，然后稀释一倍待用；在实际操作中，经常由于保藏不当造成菌种衰退、活化不当引起菌种活力下降，或由于过早活化导致实际测定时菌种老化等因素引起实验结果的偏差。

【发明内容】：本发明的目的就是解决TTC法检测牛乳中抗生素残留实验中检测时间长和标识微生物活性不稳定的问题，有效地避免菌种保藏、传代和活化等过程中的菌种性能退化的现象，提供一种检验牛乳及其制品中抗生素残留量的微生物制剂的制备方法及其应用。

本发明提供的检验牛乳中抗生素残留量的微生物制剂的制备方法，是通过以下步骤实现的：

——a标识菌液的高浓度培养：以去离子水为溶剂，按重量体积百分比(g/100mL)依次加入脱脂乳粉9～11％，乳清粉0.5～2％，酵母膏0.5～2％，磷酸氢二铵0.20～0.4％，配制培养基；按3～5％接入嗜热乳酸链球菌母种，培养温度为40～45℃，培养过程中按重量体积百分比补加2～4％乳糖，控制培养基的pH值为5.8～6.3，控制溶氧浓度为0.1～1.0mg/L，培养时间5～7小时，至菌数达到20～40亿/mL，得到嗜热乳酸链球菌高浓度培养物；

——b浓缩：将上述高浓度培养物经3000～5000转离心10～25min，得到活性嗜热乳酸链球菌的浓缩物；

——c添加保护剂：向上述嗜热乳酸链球菌的浓缩物中加入保护剂，用量为离心浓缩前菌液体积的10～20％，制成菌悬液；

——d干燥：将添加保护剂的菌悬液置于-80～-60℃冰箱中，冷冻1.5～3小时后，放入冷冻干燥机中，调冷阱温度-50～-40℃，真空度20～30pa，经5℃/30min缓慢升温，3.5～6小时后取出，得到高活性的干发酵剂菌粉；

——e微生物制剂的制备：以脱脂乳粉或乳清粉为填充剂，用量为菌粉的1～2倍，充分混合后真空包装，活菌数为600～800亿/克。

上述c步中的保护剂为蔗糖、果胶、脱脂乳、乳清、海藻糖、甘油、维生素中的一种或多种。

一种检验牛乳中抗生素残留量的微生物制剂的应用，即对牛乳中抗生素残留量的快速检测，具体步骤如下：

——取上述制备方法中生产的微生物制剂菌粉1g，以无菌操作倒入20～30mL无菌水中，充分混匀，40～45℃保温30～50分钟，作为测试菌液待用；

——取待检乳样9mL于无菌试管中，80℃水浴加热5min后冷却至37℃以下，加入上步中待用测试菌液1mL，36±1℃水浴培养2h，加TTC 0.3mL，36±1℃水浴培养30min，根据显色状态判定试验结果：检样呈乳的原色时为阳性，呈红色为阴性，见表1。——总体检测时间为4～6h。

             表1  显色状态判断标准

显色状态                        判断

未显色者                        阳性

微红色者                        可疑

桃红色—红色                    阴性

判断方法：准确培养30min观察结果，如为阳性，再继续培养30min作第二次观察。观察时要迅速，避免光照过久发生干扰。乳中有抗生素存在，则检样中虽加入菌液培养物，但因细菌的繁殖受到抑制，因此指示剂TTC不还原，不显色。与此相反，如果没有抗生素存在，则加入菌液即行增殖，TTC被还原而显红色，也就是说检样呈乳的原色时为阳性，呈红色为阴性。

本发明的优点及效果：本发明在保持了TTC检测法可靠性的基础上解决了该方法中的菌种保藏和活力不稳的问题，将检测菌种制成活性微生物制剂，节省了原实验中“菌液制备”步骤；减少了菌种保藏和传代过程中资金、设备和人员的投入，使原检测实验的总体时间从20小时缩短至5小时左右，并且使检测过程易于控制和管理，检测结果更加稳定可靠，便于乳品企业和广大消费者对牛奶中抗生素的快速检测。

【具体实施方式】：

实施例1：

在500mL三角瓶中加入去离子水300mL、脱脂乳粉30g、乳清粉3g、酵母膏1.5g、磷酸氢二铵0.9g。灭菌后加入5％(重量体积百分比)嗜热乳酸链球菌母种，控制培养基的pH值为5.8～6.3，摇床转速80rpm，培养温度为43℃，培养过程中按重量体积百分比分三次间歇补加2％乳糖，培养时间6～7小时，至菌数达到20～30亿/mL，得到嗜热乳酸链球菌的高浓度培养物；经转速4000rpm/20min离心浓缩，弃去上清液，在沉淀中加入3％脱脂乳粉为保护剂，用量相当于离心前高浓度培养液体积的20％；将添加保护剂的菌悬液置于-60℃冰箱中，冷冻3小时后，取出放入冷冻干燥机中，调冷阱温度-45℃，真空度20～30pa，经5℃/30min缓慢升温，5.5～6小时后取出，得到高活性干发酵剂菌粉，加入脱脂乳粉或乳清粉(上步菌粉的1～2倍)作为填充剂，充分混合后真空包装，1克/袋，活菌数为600～800亿/袋。

实施例2：

在5L全自动发酵罐中加入去离子水3000mL、脱脂乳粉270g、乳清粉60g、酵母膏30g、磷酸氢二铵7.5g。灭菌后加入嗜热乳酸链球菌母种3％，培养过程中按重量体积百分比流加4％乳糖，控制培养基的pH值为5.8～6.3，控制溶氧浓度为1.0mg/L，培养温度为45℃，培养时间5～6小时，至菌数达到30～40亿/mL，得到嗜热乳酸链球菌的高浓度培养物；离心浓缩后以10％脱脂乳粉+2.7％甘油为保护剂，总用量为离心前高浓度培养液体积的10％，进行冷冻干燥。其它参数同实施例1。

实施例3：

取菌粉一袋，以无菌操作倒入30mL无菌水中，充分混匀，43℃保温30分钟，活菌数达到40～80亿/毫升，作为测试菌液待用。

取待检乳样9mL，置15mm×15mm试管内，80℃水浴加热5min冷却37℃以下，加入待测菌液1mL，36±1℃水浴培养2h，加TTC 0.3mL，36±1℃水浴培养30min，观察如为阳性，再于水浴中培养30min作第二次观察，每份检样作二份。另外再作阴性和阳性对照各一份，阳性对照管用无抗生素的乳8mL加抗生素及菌液和TTC。阴性对照管用无抗生素乳9mL加菌液和TTC。

4％2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)水溶液：称取1g TTC，融于5mL灭菌蒸馏水中，装褐色瓶内于7℃冰箱保存，临用时用灭菌蒸馏水稀释至5倍。如遇溶液变为玉色或淡褐色，则不能再用。