一种从卷柏中提取穗花杉双黄酮提取物的生产工艺

摘要

本发明涉及一种穗花杉双黄酮提取物的提取工艺。所述的提取工艺为：干燥卷柏全草，回流提取，真空浓缩，然后进行柱吸附纯化即得。穗花杉双黄酮提取物可以广泛应用在化妆品和药物制备上。本发明具有原料来源丰富、工艺合理、收率高、成本低等优点。

说明书

技术领域

本方法属于天然产物提取方法，特别涉及一种从卷柏中提取穗花杉双黄酮提取物的生产工艺。

背景技术

卷柏全草为卷柏科植物卷柏(Selaginella tamariscina)的全草(中药大词典【M】，上海科学技术出版社，2000.1472-1473)，卷柏中含有多种黄酮类化合物，包括芹菜素(Apigenin)、穗花杉双黄酮(Amentoflavone)、扁柏双黄酮(Hinokiflavone)和异柳杉素(Isocryptomerin)，穗花杉双黄酮又名阿曼托双黄酮，在很多种中草药如银杏叶、贯叶连翘中均存在(Jane R.Hanrahan，Mary Chebib，Neil L.M.Davucherron，et al.Semisynthetic preparation of amentoflavone：anegative modulator at GABA receptors[J].Bioorganic & medicinal chemistry letters，2003，13：2281-2284.)，而卷柏中穗花杉双黄酮的含量又远远高于其他中草药，如贯叶连翘中穗花杉双黄酮的质量百分含量在0.01％-0.05％，而卷柏中穗花杉双黄酮的含量却高达0.8％(Jiri patocka.The chemistry，pharmacology，andtoxicology of the biologically active constituents of the herb Hyperitum perforatumL.[J].Journal of applied biomedicine，2003，1：61-70.)。双黄酮类化合物具有抗菌性，能增进血液循环、控制皮炎，在发蜡或发乳中加入双黄酮类化合物，能刺激毛发的生长，在护肤用品中加入双黄酮具有活血调理作用(王建新，天然活性化妆品【M】，中国轻工业出版社，1997.27-229.)。

本发明以前，国内外各种文献及专利对穗花杉双黄酮的提取仅局限于实验室中，并未在工业化生产中应用，所提取的也都是穗花杉双黄酮的单体。例如，郑兴等(垫状卷柏化学成分研究[J].中草药，2001，32(1)：17-18.)介绍提取分离方法是：1.0kg垫状卷柏，粉碎，用工业乙醇热回流提取，减压回收溶剂后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分别减压浓缩，回收溶剂，得到石油醚部分和乙酸乙酯部分，然后分别进行硅胶柱层析，得到4种结晶化合物。

戴忠等(中华卷柏的化学成分研究[J].中草药，2001，32(9)：784-785.)介绍提取分离方法是：中华卷柏的干燥全草5kg，用10倍量95％乙醇回流提取3次，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓缩物置水浴上挥尽乙醇，得中华卷柏浸膏。分别用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，各萃取部分浓缩后用硅胶柱层析，得到4种结晶化合物。

上述方法得到的是单一化学成分，适用于化合物鉴定与研究，而本发明应用沉降法和大孔吸附树脂脱除杂质，利用冷冻干燥法干燥产品，得到以穗花杉双黄酮为主要有效成分的混合提取物，产品中穗花杉双黄酮含量在10～50％，可用于化妆品和药品，产品产率高达1～5％，适用于工业化生产。

本发明的具体内容是：干燥卷柏全草，乙醇提取后，通过控制乙醇浓度使叶绿素等脂溶性杂质沉降出来而穗花杉双黄酮等有效成分溶解在乙醇溶液中，然后过滤去除叶绿素等脂溶性杂质；利用苯乙烯型大孔吸附树脂吸附解析溶解有穗花杉双黄酮等有效成分的乙醇溶液，从而进一步去除脂溶性杂质；富含穗花杉双黄酮等有效成分的解析液通过调节pH值沉降出穗花杉双黄酮等有效成分，过滤得滤饼，从而与水溶性杂质分离；最后利用冷冻干燥确保穗花杉双黄酮避免受热发生化学转化，得到穗花杉双黄酮含量10～50％、产率1～5％、颜色棕黄色至浅黄色的卷柏提取物。

本发明工艺操作简便、重复性好，能有效去除叶绿素等脂溶性杂质，产品色泽好、不发粘，冷冻干燥有效保护了穗花杉双黄酮不受破坏，产品穗花杉双黄酮含量高，可达40％～50％。

发明内容

本专利发明所要解决的技术问题是，提供一种从卷柏中提取穗花杉双黄酮的生产工艺，它是对卷柏全草进行提取分离，目的是通过简单的工艺得到收率较高的穗花杉双黄酮提取物。

本发明的技术方案是：从卷柏中提取穗花杉双黄酮提取物的生产工艺，其方法的步骤为：

(1)原料准备：采集卷柏全草后，洗净，晾干或晒干；

(2)提取：粉碎干燥的卷柏全草，萃取液回流提取两次。提取液过滤，合并提取液；

(3)浓缩：提取液真空浓缩，回收萃取溶剂；

(4)沉降过滤：冷却沉降后过滤，去除杂质；

(5)吸附解析：沉降过滤液倒入大孔树脂柱上，控制吸附时流速，然后用纯水洗涤。再用解析溶剂进行解析；

(6)二次浓缩：解析液真空浓缩；

(7)调pH沉降过滤：调pH值为酸性，冷却沉降后过滤，得滤饼；

(8)冷冻干燥：滤饼使用冷冻干燥，得产品。

本发明的有益效果是：

本发明与现有技术相比体现的优异在于：

(1)工艺操作简便、重复性好，产率高，适用于工业化生产。

(2)工艺过程未使用有毒有害溶剂，全部使用安全卫生的纯水和食用乙醇为溶剂。

(3)工艺使用调醇浓度、调pH值、大孔吸附树脂吸附解析的方法充分脱除叶绿素等脂溶性杂质，确保产品纯度高、不发粘。

(4)采用冷冻干燥，保持有效成分不受破坏，产品颜色浅。

穗花杉双黄酮提取物的应用：

本发明的穗花杉双黄酮提取物可以单独作为活性成分与表面活性剂制备成功能性化妆品，也可以和其他活性成分组合与表面活性剂制备成功能性化妆品，例如洗发香波、洁面乳、洗面奶、护手霜、洗手液。

(1)穗花杉双黄酮提取物功能性香波：水55g，加温至70℃，搅拌的同时加入AES 8g，AESA 12g，K₁₂A 5g，OA 5g，甜菜碱5g，6501 2g。温度降至室温时，搅拌的同时加入单硬脂酸乙二醇酯3g，SP680 2g，聚丙烯酰胺1g。均匀后，加入甘宝素0.15g，穗花杉双黄酮提取物0.5g，柠檬香精0.05g，柠檬酸若干。穗花杉双黄酮提取物功能性香波具有抗菌性，能增进血液循环、控制皮炎，刺激毛发的生长、改善头发结构使头发柔顺有光泽。

(2)穗花杉双黄酮提取物功能性洁面乳：氢化羊毛酯1.5g，甘油6g，柠檬酸0.01g，增溶剂0.1g，香精0.1g，穗花杉双黄酮提取物0.5g，纯水加至100g。穗花杉双黄酮提取物功能性洁面乳具有活血调理功能，使皮肤保湿、嫩白、有光泽、有弹性。

本发明的穗花杉双黄酮提取物还具有多种药理活性，经过实验证明，穗花杉双黄酮提取物药物具有抑菌、止血的功效。

(1)抑菌消炎作用：

穗花杉双黄酮提取物在抑菌作用实验：取5个直径为9cm的无菌平面皿加入1ml待试菌，倒入冷却到50℃的溶化琼脂培养基15ml中充分混匀，待琼脂凝固后，用外径为5mm的无菌扎孔器在琼脂上等距离打3个孔，并挖出孔内琼脂培养基，于每孔内加入卷柏生品、穗花杉双黄酮提取物和生理盐水，置入37℃恒温箱内培养12小时、24小时和48小时，结果证明对绿脓杆菌具有抑制作用，实验数据见表1。

表1：穗花杉双黄酮提取物对绿脓杆菌的抑制作用

    样    品抑菌环直径大小  (mm)，12h抑菌环直径大小  (mm)，24h抑菌环直径大小  (mm)，48h卷柏生品穗花杉双黄酮提取物生理盐水     5     10     -     12     18     -      14      21      -

(2)止血作用：

穗花杉双黄酮提取物的止血实验：取健康小鼠，雌雄兼用。测试样品以0.35mL/10g体重的药液量灌胃。1h后用内径为1mm的毛细玻璃管插入小鼠内眦球后静脉中取血，至毛细管内血柱达4-5cm。每隔30s折断一小段毛细玻璃管，检验有无血凝。计算从采样到出现凝血的时间作为凝血时间。测试样品为卷柏、垫状卷柏、穗花杉双黄酮提取物与生理盐水。另外，用同样的方法，取健康小鼠，雌雄兼用。测试样品以0.35mL/10g体重的药液量灌胃。1h后用剪刀在小鼠尾尖3-5mm处横断，使鼠尾浸没于37℃恒温水中，待血液自行溢出开始计时，直至血液自行停止为止，即出血时间。测试样品为卷柏、垫状卷柏、穗花杉双黄酮提取物与生理盐水。

小鼠的止血和出血结果见表2：

表2：小鼠对卷柏及其提取物的止血作用(x±s，s)

    组别     凝血时间(s)    出血时间(s)      卷柏    垫状卷柏穗花杉双黄酮提取物    生理盐水    345.5±35.21    246.3±21.18    186.12±17.25    381.69±41.55    95.46±38.26    74.39±25.31    59.12±19.38    268.56±126.39

n＝20，与空白对照比^*P＜0.05^***P＜0.001

结果证明，穗花杉双黄酮提取物能显著缩短出血时间和缩短凝血时间。

本发明的穗花杉双黄酮提取物还可以制备成临床药物制剂，例如：片剂、胶囊剂、口服液体制剂等。因此，本发明还提供了含有穗花杉双黄酮提取物的药物组合物，该组合物含有治疗有效量的穗花杉双黄酮提取物，优选每天摄入量大于5mg、少于1000mg。

穗花杉双黄酮提取物片剂制备过程是，穗花杉双黄酮提取物和辅料(药用淀粉、微晶纤维素)以1∶4比例，加入70％酒精，混匀，带搅拌的干燥过程自然形成颗粒，40目过筛，用压片机压成片重250mg。

本发明的药物组合物作为药物制剂，优选每天摄入5mg～1000mg穗花杉双黄酮提取物，进一步优选每天摄入20mg～500mg穗花杉双黄酮提取物，更好优选每天摄入50mg～300mg穗花杉双黄酮提取物，最好优选每天摄入100mg～200mg穗花杉双黄酮提取物。

具体实施方式

下面结合实施例来更详细的说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。

实施例1：干燥垫状卷柏全草200g，65-95％乙醇回流提取两次，每次1-3小时、600-1800ml。合并提取液，真空浓缩，真空度控制在-0.40--0.99Mpa，浓缩后控制乙醇浓度30-70％，沉降后过滤以去除叶绿素等脂溶性杂质，然后倒入HPD100型大孔树脂柱上，吸附柱内装200-600ml树脂，吸附时流速控制在1-3倍树脂体积/小时，然后用2-4倍树脂体积的纯水洗涤树脂柱，流出液和水洗液排污。用2-6倍树脂体积的60-90％(v/v)的乙醇水溶液解析。解析液真空浓缩，真空度控制在-0.40--0.99Mpa，浓缩至0.1-0.4g/ml左右，冷冻干燥。冻干产品为棕黄色，穗花杉双黄酮含量10％～30％。

实施例2：干燥垫状卷柏全草200g，65-95％乙醇回流提取两次，每次1-3小时、600-1800ml。合并提取液，真空浓缩，真空度控制在-0.40--0.99Mpa，浓缩后控制乙醇浓度30-70％，沉降后过滤以去除叶绿素等脂溶性杂质，然后倒入HPD100型大孔树脂柱上，吸附柱内装200-600ml树脂，吸附时流速控制在1-3倍树脂体积/小时，然后用2-4倍树脂体积的纯水洗涤树脂柱，流出液和水洗液排污。用2-6倍树脂体积的60-90％(v/v)的乙醇水溶液解析。解析液真空浓缩，真空度控制在-0.40--0.99Mpa，浓缩回收乙醇后调pH值在1～6，沉降后过滤得滤饼，取滤饼冷冻干燥。冻干产品为浅黄色，穗花杉双黄酮含量20％～50％。

实施例3：干燥中华卷柏全草200g，65-95％乙醇回流提取两次，每次1-3小时、600-1800ml。合并提取液，真空浓缩，真空度控制在-0.40--0.99Mpa，浓缩后控制乙醇浓度30-70％，沉降后过滤以去除叶绿素等脂溶性杂质，然后倒入D101型大孔树脂柱上，吸附柱内装200-600ml树脂，吸附时流速控制在1-3倍树脂体积/小时，然后用2-4倍树脂体积的纯水洗涤树脂柱，流出液和水洗液排污。用2-6倍树脂体积的60-90％(v/v)的乙醇水溶液解析。解析液真空浓缩，真空度控制在-0.40--0.99Mpa，浓缩回收乙醇后调pH值在2～4，沉降后过滤得滤饼，取滤饼冷冻干燥。冻干产品为浅黄色，穗花杉双黄酮含量20％～50％。

实施例4：干燥垫状卷柏全草20kg，65-95％乙醇回流提取两次，每次1-3小时、60-180L。合并提取液，真空浓缩，真空度控制在-0.40--0.99Mpa，浓缩后控制乙醇浓度30-70％，沉降后过滤以去除叶绿素等脂溶性杂质，然后倒入HPD100型大孔树脂柱上，吸附柱内装20-60L树脂，吸附时流速控制在1-3倍树脂体积/小时，然后用2-4倍树脂体积的纯水洗涤树脂柱，流出液和水洗液排污。用2-6倍树脂体积的60-90％(v/v)的乙醇水溶液解析。解析液真空浓缩，浓缩回收乙醇后调pH值在2～4，沉降后过滤得滤饼，取滤饼冷冻干燥。冻干产品为浅黄色，穗花杉双黄酮含量20％～50％。

产品质量指标：穗花杉双黄酮含量10～50％，产率1～5％，颜色棕黄色至浅黄色，熔点在200℃以上。