海南鹤顶兰的早期胚无菌播种和组织培养方法

摘要

本发明涉及海南鹤顶兰(Phaius hainanensis)的早期胚无菌播种和组织培养方法。其特征在于采用人工营养液利用早期胚的无菌播种的方法获得大量试管苗，并利用无菌实生苗进行原球茎的增殖，通过生根培养能形成完整植株。本发明具有投入少，产出高的特点，能成功地进行海南鹤顶兰种苗的无菌播种和组织培养快速繁殖，苗壮，种苗品质好，抗性强，并可为鹤顶兰属植物其它种、属内或与其它属间进行杂交育种所得杂种的早期胚无菌播种和组织培养提供方法。

说明书

技术领域

本发明涉及海南鹤顶兰的早期胚无菌播种和组织培养方法。

技术背景

海南鹤顶兰(Phaius hainanensis)为多年生草本，原产我国海南省。植株较高大，叶阔披针形，有纵向扇状褶。花茎直立，总状花序，着花10-20朵，花被和花瓣两面象牙白色，花大，花期春末夏初，花期长可达1月。由于海南鹤顶兰生长茂盛，花葶直立，花形优美，色泽鲜艳，具有很高的观赏价值。温暖的地方可种于庭院树丛下、棚架之侧、石旁及溪边做园林观赏；冷凉之地可盆栽，供室内装饰用。另外，海南鹤顶兰的假鳞茎可供药用，有清热止咳、祛痰活血、止血等功效。海南鹤顶兰具有很好的市场开发潜力。

海南鹤顶兰的常规繁殖主要以分株进行，繁殖速度慢，而其种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发，特别是在杂交育种时，属间种能杂交，但是有些不亲和的杂交种果实发育60-70天时会脱落死亡。

目前，国内外未有海南鹤顶兰的早期胚无菌播种和组织培养及大规模生产和专利申请的报道。

发明内容

本发明的目的在于解决海南鹤顶兰种子在自然状态下难萌发以及杂交不亲和，杂交种果实未成熟就脱落的问题，开发一种可大规模繁殖海南鹤顶兰种苗的方法。

本发明采用人工营养液利用早期胚的无菌播种的方法能获得大量试管苗，并可利用无菌实生苗进行原球茎的增殖，通过生根培养能形成完整植株，实现了本发明的目的。

本发明的技术特征在于，包括下列步骤：

(1)材料选择：将发育60-70天的果实取下做外植体；

(2)无菌播种：用70％-80％的酒精浸泡20-40秒后置于8％-15％的次氯酸钠溶液中消毒15-25分钟，无菌水冲洗4-5次后切开果实，用接种针将近绿色的未成熟胚接种到培养基中，所述的培养基每升中含有6-苄基嘌呤1-3毫克，萘乙酸0.1-0.5毫克，椰子水150毫升，琼脂7克，蔗糖30克，其余的成分为MS；

(3)组织培养：为获得更多的种苗，利用上述步骤生长的无菌实生苗或其原球茎在培养基上进行原球茎的增殖并分化出小苗，所述的培养基每升中含6-苄基嘌呤1-3毫克，萘乙酸0.1-0.5毫克，椰子水150毫升，2，4-二氯苯氧乙酸0.5-1.0毫克，琼脂7克，蔗糖30克，其余的成分为MS，再把未分化出小苗的原球茎转移到培养基上出芽并形成完整植株，所述的培养基每升中含有萘乙酸0.5-1.0毫克，香蕉汁10克，琼脂7克，蔗糖30克，其余的成分为MS；

(4)试管苗移栽：当试管苗能长至3-4厘米高时，转移到自然光下炼苗7-10天，再打开瓶塞炼苗2天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移栽入体积1∶1的泥炭和粗椰壳混合基质中；

在上述所有步骤中所述的培养基pH5.4-5.6，培养温度(26±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天。

在所述的材料选择的步骤中，选取生长健壮的海南鹤顶兰母株开花时进行人工自粉、或与其它种进行种间杂交、或与虾脊兰等进行属间杂交，大部分品种授粉后，果实120-150天左右基本成熟，有些不亲和的杂交种发育到60-70天时会脱落死亡，将发育60-70天的果实取下做外植体。

在所述的无菌播种的步骤中，加入椰子水能提高胚的萌发率并促进小苗生长，120-150天左右胚萌发，150-180天左右形成完整植株，

在所述的组织培养的步骤中，所述的香蕉汁是由香蕉去皮后用榨汁机打碎而成的。

在所述的组织培养的步骤中，原球茎的增值可达3-5倍，未分化出小苗的原球茎的出芽率可达90％-95％。

在所有的步骤的培养基中，所述的椰子水是从新鲜的椰子中取出的椰子水经多层纱布过滤所得，加入琼脂可固化培养基，加入蔗糖来提供碳素营养，所述的MS为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看谭文澄、戴策刚主编，《观赏植物组织培养技术》，北京：中国林业出版社，1991。

在所述的试管苗移栽的步骤中，保持足够的湿度和适当通风，移栽的成活率均可达90％以上。由于海南鹤顶兰叶片宽大，如果不进行炼苗，移栽时，叶片极易失水干枯而影响移栽成活率。

本发明的最佳的实验条件和培养基配方见具体实施方式。

本发明具有如下优点：

(1)增值倍数高：原球茎的增值可达3-5倍；

(2)移栽的成活率高：成活率可达90％以上；

(3)设备简单：只需要简单的植物组织培养设备即可进行；

(4)出苗快，稳定性高，苗壮，种苗品质好，抗性强，生长良好

(5)可作为鹤顶兰属植物其它种、属内或其它属间进行杂交育种所得杂种的早期胚无菌播种和组织培养提供方法。

具体实施方式

实施例

海南鹤顶兰的早期胚无菌播种和组织培养繁殖

1.将发育65天的果实取下做外植体；

2.用75％的酒精浸泡30秒后置于10％的次氯酸钠溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗4次后切开果实，用接种针将近绿色的未成熟胚接种到培养基中，所述的培养基每升中含有6-苄基嘌呤2毫克，萘乙酸0.3毫克，椰子水150毫升，琼脂7克，蔗糖30克，其余的成分为MS，130天胚萌发，160天形成完整植株；

说明：所述的椰子水是从新鲜的椰子中取出的椰子水经多层纱布过滤所得。所述的培养基pH5.5，培养温度(26±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天。

3.利用上述步骤生长的无菌实生苗或其原球茎在培养基上进行原球茎的增殖5倍并分化出小苗，所述的培养基每升中含6-苄基嘌呤2毫克，萘乙酸0.3毫克，椰子水150毫升，2，4-二氯苯氧乙酸0.8毫克，琼脂7克，蔗糖30克，其余的成分为MS。再把未分化出小苗的原球茎转移到培养基上出芽并形成完整植株。所述的培养基每升中含有萘乙酸0.8毫克，香蕉汁10克，琼脂7克，蔗糖30克，其余的成分为MS；

说明：所述的椰子水是从新鲜的椰子中取出的椰子水经多层纱布过滤所得。所述的香蕉汁是由香蕉去皮后用榨汁机打碎而成的。所述的培养基pH5.5，培养温度(26±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天。

4.当试管苗能长至3-4厘米高时，转移到自然光下炼苗10天，再打开瓶塞炼苗2天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移栽入体积1∶1的泥炭和粗椰壳混合基质中。

5.结果：移栽的成活率为95％。