从包膜病毒中回收酶活性

摘要

本发明描述了一种从存在于含非保护性酶的生物样品中的包膜病毒(如HIV)中回收酶活性(例如逆转录酶(RT)活性)的方法。一种半胱氨酸改性物质用于破坏所述非保护性的酶活性，接着取出所述包膜病毒体或用化学物质灭活所述半胱氨酸改性物质。然后裂解所述病毒包膜并回收释放的酶。本发明还公开了商业包装盒，该包装盒含有用于从包膜病毒回收酶活性的实验步骤的书面说明书和/或数据载体说明书以及一些化学试剂。

说明书

本发明涉及一种从包膜病毒中回收酶活性的方法，例如测定包装于包膜病毒中的酶。所述方法特别开发用于除包膜病毒外还含有非保护性酶的生物样品。

背景

在这一领域中一个传统问题实例是在细胞抽提物或细胞培养液中测定逆转录病毒的逆转录酶(RT)时遇到的。在逆转录期间RT产生病毒RNA的DNA拷贝。常规的RT活性测定通过利用一个人造的模板-引物结构和氚化的三磷酸脱氧核苷酸作为核苷酸底物来完成。该模板/引物对多聚(rA)/寡聚(dT)是最有效和最多使用的组合来测定HIV和其它逆转录病毒的RT(Baltimore-71，Lee等人-87)。早期已认识到一些细胞DNA聚合酶使得这类依靠产生可测量的产物数量的测定系统的结果不明确。

在真核细胞中已鉴别出至少9种不同类型的DNA聚合酶。聚合酶α在细胞分裂期间负责DNA的复制，聚合酶β是涉及DNA修复的主要聚合酶，聚合酶λ负责线粒体中的DNA合成。每种细胞聚合酶以不同的形式出现并与不同的蛋白结合。它们的酶特性随它们的分子形式和细胞类型来源不同而不同(参见评论Hübscher等人2000)。此外，细胞可以包含来自感染病毒或编码病毒DNA聚合酶的内源病毒基因的酶。细胞DNA聚合酶中，DNA聚合酶α最少倾向于利用prA作模板，但是有某些分子类型的这种酶可以有效拷贝prA(Goulian & Grimm 1990，Yoshida等人1981)。

实际上不同的聚合酶在定量逆转录病毒RT时，存在特异性问题。围绕这一问题的许多方法可以在文献中看到。最显而易见的方法是分离病毒与细胞蛋白质。各种方法如离心法或病毒体吸附到特异性受体或抗体上在这种情况均有使用。当纯化材料包含大量的细胞组分和微量病毒时存在的一个普遍问题是不能排除同时纯化的少量细胞聚合酶。此外，从应用角度来看，用比较麻烦的分离步骤处理大量样品是没有吸引力的。

另一种方法是设计同工酶特异性酶测定条件来或多或少从检测中排除细胞聚合酶，如λ聚合酶。这可以通过使用抑制剂、交替金属离子或模板/引物对来完成。例如众所周知聚(2’-O-甲基-rC)_n寡聚(dG)_12-18是逆转录病毒RT的高特异性底物。然而经这种方法获得的增强特异性通常受到酶反应速度相应降低和随后对需要检测的酶的灵敏度降低的限制。

我们近来开发了一种用于定量感染人群血浆样品中的HIV RT的方法。该方法基于病毒结合到一种具有固定化离子交换剂的凝胶上。抗体和干扰物质经冲洗去除而具有酶活性的RT通过用非离子去污剂裂解固定化病毒回收(Gatu等人2000)。回收的RT量用基于预先用odT固定化prA的一种灵敏RT测定来最终定量。当用这个系统处理来自健康血液捐献者的对照血浆时，我们发现了纯化组分中的少量RT活性。

进一步研究发现来自健康人的天然EDTA血浆包含比较大量的RT活性，RT活性还主要存在于提取自相同类型样品的淋巴细胞组分提取物。这种未分类的酶的一些性质描述于表1。在“病毒固定化”后用我们的分离系统回收的活性量小于血浆总活性的千分之一，但足以使少量HIV RT的检测不明确。

发明详述

本发明针对上文揭示的具体问题提供一种解决方案，但它也普遍适用于检测包膜病毒包含的所有的酶。包膜病毒家族以及该家族中一些在人类传播的包膜病毒的实例包括痘病毒科病毒(如牛痘和天花)、虹彩病毒科疱疹病毒科(如单纯疱疹病毒、水痘病毒、细胞巨化病毒和Eppstein-Barr病毒)、披膜病毒科(如黄热病毒、蜱传(thick-borne)脑炎病毒、风疹病毒和热带脑炎病毒)、冠状病毒科(如人冠状病毒)、副粘病毒科(如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸合胞体病毒)、弹状病毒科(Rabdoviridae)(如水泡性口膜炎病毒和狂犬病病毒)、纤丝病毒科(如马尔堡病毒和埃博拉病毒)、正粘病毒科(如流感A和B病毒)、本扬病毒科(Bunyaviridae)(如Bwamba病毒、加利福尼亚脑炎病毒、白蛉热病毒和里夫特山谷热病毒)、沙粒样病毒科(如LCM病毒、拉沙热病毒和Juni病毒)、肝脱氧核糖核酸病毒科(如乙型肝炎病毒)、逆转录病毒科(如HTLV和HIV)。

本发明方法基于使用修饰蛋白的化学物质来破坏非保护性的溶解酶活性，即游离酶以及与例如蛋白质、细胞成分或细胞器结合但不受病毒包膜保护的酶。化学物质穿透病毒包膜的能力与它的疏水性有关。如果病毒包膜对选定的化学物质产生保护，那么有可能去除或者灭活活性化学物质，裂解病毒体并定量释放的病毒酶活性量。有许多具有或多或少位点特异性的试剂可用于蛋白修饰(见综述seMeans & Feeney 1990)。

对于本发明方法，已选择修饰半胱氨酸的物质作为蛋白修饰化学物质来破坏非保护性酶的活性。对N-乙基顺丁烯二酰亚胺的敏感性已广泛用于细胞DNA聚合酶的分类。通常将该试剂直接加入反应混合物中，它有效“抑制”所有哺乳动物DNA聚合酶，DNA聚合酶β除外。在不同的逆转录病毒RT的共有氨基酸序列中半胱氨酸的数量具有显著差异，即HIV 1 RT仅有2个半胱氨酸，HIV 2有3个半胱氨酸，小鼠白血病病毒(MULV)有8个半胱氨酸，而禽类成髓细胞瘤/肉瘤病毒在β亚基上有12个半胱氨酸。因此可预料病毒RT对半胱氨酸修饰的敏感性存在显著的差异。修饰HIV RT中的半胱氨酸残基的作用已有研究，并且至少HIV 1和HIV 2 RT的DNA聚合酶活性是相当稳定的(Hizi等人1992)。考虑到已记载的不同HIV株中的巨大变异，这不见得对全部HIV分离株都成立。

更具体地讲，本发明涉及一种从包含非保护性酶的生物样品中的包膜病毒中回收酶活性的方法，该方法包括以下步骤

a)将所述生物样品和半胱氨酸改性物质温育以破坏非保护性酶的活性而保留病毒包膜内的病毒酶活性，

b1)从所述温育混合物中取出包膜病毒体，或

b2)用一种使病毒包膜不被裂解的灭活物质灭活半胱氨酸改性物质，

c)用一种裂解缓冲液裂解所述病毒包膜来释放病毒酶，

d)从所述裂解缓冲液中回收所释放的病毒酶。

在本发明方法的一个实施方案中，包膜病毒选自逆转录病毒科家族，特别选自慢病毒属、HTLV/BLV病毒、哺乳动物D-型逆转录病毒和哺乳动物C-型逆转录病毒。

在优选实施方案中所述慢病毒属是人类免疫缺陷性病毒(HIV)。

在另一实施方案中回收的病毒酶活性是逆转录酶(RT)活性。

在本发明方法的又一实施方案中生物样品是一种体液样品。体液的实例有尿、唾液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、腹水液，特别是血液、血浆和血清。

在本发明方法的更进一步实施方案中所述半胱氨酸改性物质是一种水溶性非亲脂物质，如N-乙基顺丁烯二酰亚胺、硫柳汞、对羟基汞基苯甲酸酯、5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，2-氨乙基2’-氨基乙烷硫代磺酸酯，2-硝基-5-硫氰基苯甲酸和甲基甲烷硫代磺酸酯。

再一个实施方案中所述灭活物质是一种温和的低分子量还原剂，如半胱氨酸、半胱胺、巯基琥珀酸或谷胱甘肽。

本发明还涉及一种商业包装盒，其包括从存在于生物样品中的包膜病毒中回收酶活性的实验步骤的书面说明书和/或数据载体说明书以及一种半胱氨酸改性物质，如N-乙基顺丁烯二酰亚胺、醋酸苯汞、硫柳汞、对羟基汞基苯甲酸酯、或5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。所述商业包装盒也可任选包含病毒结合基质，如阴离子交换基质，或一种灭活所述半胱氨酸改性物质而保持病毒包膜不被裂解的物质，如半胱氨酸、半胱胺、巯基琥珀酸、或谷胱甘肽，以及一种裂解缓冲液，如包含去污剂的适合酶测定的缓冲液。

现在通过对各种实验、实施例和附图的全面描述来说明本发明，但应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案。

实验概述

下列方法是用来说明本发明而不是限制它的使用。本发明的两个不同的实施方案可用做不同的目的。方案I)主要用于含有酶活性封闭性抗体的样品(如HIV病人血清阳转后的血浆)，它在测定病毒酶活性前必须先除去。下面方案中的聚合酶灭活步骤可用单独温育步骤完成。也可以选择在病毒体结合于凝胶上的同一步骤中完成。这可以通过直接加半胱氨酸改性物质到血浆/凝胶浆混合物中或通过所述物质先结合到凝胶上、然后再加入血浆样品来实行。所需的改性物质浓度可以随方法而变化。方案II)可用于基本没有干扰因子如酶封闭性抗体的样品，如HIV急性期血清。

I)用于测定含RT封闭性抗体的材料的逆转录病毒RT的方案，所述方案以破坏可溶性的细胞酶继之以从微型柱分离病毒RT为基础

1)标记所需使用的5ml塑料管。将它们放于Nalgene盒子中。加1ml样品(如HIV感染个体的EDTA血浆)到每种标记的管中。加入100μl66mM的5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)缓冲水溶液，涡旋混合并于室温下温育样品1小时。

在这个过程中游离的血浆酶活性被破坏而病毒体内包含的酶仍保持完整。然后通过几个分离步骤从5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、酶活性封闭性抗体以及其它可能干扰病毒RT定量的物质中纯化病毒体。以下的方案以使用FractogelEMD TMAE Hicap凝胶为基础。

2)仔细悬浮所述分离胶并向每个样品的预处理管中转移1500μl凝胶浆。

3)将所述试管放入轨道式摇床上于室温温育样品和凝胶浆1小时。

4)标记所需数目的15ml塑料微型柱，以鉴定要分析的样品。将所述柱管安装在一个柱型洗涤装置中，如Supelco Visiprep固相提取真空歧管。转移上述结合管中的内容到它们相应的柱中。转移前短暂涡旋所述塑料管以均匀分散凝胶。

5)当所有微型柱被填充后，用真空吸干凝胶。关闭真空并开始用9ml缓冲液A填充每一微型柱进行洗涤。当所有的微型柱被填充后，用真空吸干凝胶。

6)再重复步骤5三次，总共洗涤4次。每次洗涤后吸干凝胶。在第4次洗涤后吸干凝胶后，关闭真空并继续第7步。

所述洗涤步骤从系统中除去了未结合的RT封闭性抗体和5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。

7)向所有干胶中加入9ml调节缓冲液(B)。用真空吸干凝胶。

8)重复步骤7。在关闭真空控制前所有的调节缓冲液(B)已从凝胶中去除。

9)卸下柱状洗涤装置的上部分。将具有标记塑料管的管架安装入一个干净的容器中。重新安装装置的上部分。控制所述小管从每一柱管沉入其相应的塑料管中。

10)加300μl裂解缓冲液(C)到每一柱管中。让所述缓冲液位于柱管中5分钟。然后，用真空慢慢吸干凝胶。这样每管将含有大约300μl病毒裂解产物。

从第10步的裂解产物中回收的RT活性基本上没有RT封闭性抗体和细胞聚合酶活性，而且可以用灵敏的RT活性测定方法，例如基于Ekstrand等人1996年描述的方法Cavidi-HS-kit Lenti RT，定量测定所述RT活性。

注意：RT酶对半胱氨酸改性物质不敏感，例如野生型HIV 1 RT，任选在有高达5mM 5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)存在的情况下测定。

另一方面，敏感性酶如MuLV RT和来自于某些治疗抗性HIV 1病毒株的RT，需要添加巯基还原剂(如半胱氨酸或半胱胺)到裂解缓冲液中。

II)用于测定样品中基本没有酶封闭性抗体的RT活性的方案，如HIV急性期血浆或病毒培养上清夜，所述方案以可溶的细胞酶灭活接着以5，5′-二硫代双(2-确基苯甲酸)灭活为基础。

1)将200μl样品(如HIV急性期血浆)与20μl 33mM 5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)缓冲水溶液混合。于室温下将样品在轨道式摇床上温育1小时。

2)加入巯基还原剂，如20μl 33mM半胱胺，于室温下将样品在轨道式摇床上再温育30分钟。

3)用含去污剂如triton X-100的适合RT测定的缓冲液四倍系列稀释样品。现在所述病毒体裂解并且每一稀释液的RT活性可以用灵敏的RT测定如Cavidi-HS-kit Lenti RT来测定。

4)如果样品稀释度和形成的产物量之间呈线性关系，则最初样品中的RT活性量根据稀释度范围内数值来计算。

实施例

材料

分离胶：如FractogelEMD TMAE或FractogelEMD TMAE Hicap在200mM(2-(N-吗林代)乙磺酸)(MES)pH5.4，275mM碘化钾和肝素80IU/ml中的分离胶。

微型柱如Biorad Poly-Prep(7311553)

微型柱洗涤装置如Supelco Visiprep固相提取真空歧管。

塑料管如Nunc4.5ml冷冻管。

半胱氨酸改性剂，例如66mM 5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)于0.4M三(羟乙基)氨基甲烷的缓冲水溶液中(pH6.8)。

温和的巯基还原剂，如33mM半胱胺水溶液。

洗涤缓冲液(A)：20mM MES pH6.0，500mM醋酸钾(KAc)。

调节缓冲液(B)：一种适合RT测定的缓冲液，如10mM(N-(2-羟乙基-哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(Hepes)pH7.6，25mM KAc，20mM氯化镁(MgCl₂)，0.2mM乙二醇双(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)，2mM精胺和0.5mg/ml加热灭活的牛血清白蛋白。

裂解缓冲液(C)：一种适合RT测定的缓冲液，包括一种去污剂如1％t-八苯氧基聚乙氧基乙醇(triton X-100)、一种酶稳定剂如13ng/ml寡聚(dT₂₂)、0.025mg/ml硫酸葡聚糖以及与调节缓冲液(B)同样的组分。由于RT对SH氧化/修饰敏感，所以在处理含RT的病毒时可任选添加一种巯基还原剂，如0.2mM半胱胺。

附图简述

图1显示了用硫柳汞预保温对血清/血浆中不同聚合酶活性的作用。重组野生型HIV 1 RT(■)，来自一种HIV 1突变体(Y181C)的重组RT(◇)，Jaagsiekte病毒RT(▲)，FIV RT(○)，牛白血病病毒(BLV)RT(◆)，猪内源逆转录病毒(PERV)RT(●)以及来自健康血液捐献者的血浆样品(□)。

图2显示A和B两个图表，表明了从掺入FIV的血浆回收的病毒RT活性和选择性破坏内源性RT活性。来自健康血液捐献者的已破坏淋巴细胞的EDTA血浆(左侧柱)和灭活胎牛血清稀释的FIV(右侧柱)与A)5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，和B)硫柳汞温育。回收的RT活性对物质浓度做图。

图3显示了消除来自健康血液捐献者的血浆样品中的聚合酶活性的图。

图4显示了按照本发明回收自人血浆的HIV RT与用RNA PCR测量的病毒RNA之间的相关性。

图5显示了用替代方案处理来自HIV感染患者的血浆样品的图。在方案I中聚合酶灭活步骤如下进行：A)单独温育；B)在病毒结合到凝胶的同一步骤中进行；C)同B，但是凝胶和所述物质一起贮藏；D)同C，但是凝胶用之前进行洗涤。血浆RT活性(◆)，HIV RT活性(●)。

图6显示了未经纯化的具有高内源性RT活性的样品中病毒RT的定量。来自健康血液捐献者的EDTA血浆(A)，灭活FCS中的FIV病毒(B)和细胞培养基中的FIV病毒(C)。

实施例1.来自人血浆的DNA聚合酶的一些性质。

研究在缺乏引物的RT反应混合物(Cavidi HS-kit Lenti RT)中添加指示成分的作用。来自两个健康血液捐献者的EDTA血浆(1μl/测定)、重组HIV 1 RT或细胞培养来源的FIV RT用作酶。结果列于表1。

人血浆聚合酶活性依赖于引物，对通过ddNTP与模板互补的抑制作用敏感，但对焦磷酸盐类似物不敏感。

实施例2.各种半胱氨酸-改性剂破坏人血浆聚合酶活性的能力。

50μl人EDTA血浆样品和50μl系列稀释每种物质样品混合。将所述样品在轨道式摇床上温育一小时。然后将每种样品稀释20倍，用CavidiHS kit Lenti RT测量残余的聚合酶活性。每一物质浓度下的聚合酶活性换算成没有改性物质存在下温育血浆的对照的百分比，以物质浓度作图，50％酶活性降低所需的物质浓度从图中获得。

缺少内源性RT活性的人血浆HIV病毒按照“用于测定来自含RT封闭性抗体的材料的逆转录病毒RT的方案”用5mM所示物质处理。用CavidiHS kit Lenti RT测定回收的HIV RT。结果列于表2。

实施例3.用硫柳汞温育对血清/血浆中不同聚合酶的作用。

将重组野生型HIV 1 RT(■)，来自Nevirapine抗性HIV 1突变体(Y181C)的重组RT(◇)，来自绵羊肺癌的Jaagsiekte病毒(JSV)RT(▲)，猫白血病病毒(FIV)RT(○)，牛白血病病毒(BLV)RT(□)和来源于细胞培养的猪内源性逆转录病毒(PERV)RT(●)稀释于加热灭活的胎牛血清。将所述不同的病毒酶制剂和来自健康血液捐献者的EDTA血浆样品(□)用指定浓度的硫柳汞于室温(22℃)温育60分钟。将所有样品用适合RT测定的缓冲液稀释100倍，然后测定每种样品中的残余RT活性。三种RT测定，每种适合测量的RT类型：HIV 1、JSV、和FIV RT用CavidiHS kit Lenti RT测量。BLV RT用CavidiHS kit HTLV RT测量，PERV和人血浆RT用CavidiHS kit Mn²⁺RT测量。结果列于图1。

所研究的7种酶显示了对硫柳汞处理的敏感性存在显著差异。HIV 1 Y181C突变体RT和FIV RT是最敏感酶。在人血浆RT、BLV RT和PERV RT中需增加硫柳汞浓度才能有效破坏酶活性。两种酶即野生型HIV 1 RT和JSV RT是完全抗性。

实施例4.从掺入FIV的血浆回收病毒RT活性和选择性破坏内源性RT活性。

将来自健康血液捐献者的已破坏淋巴细胞的EDTA血浆和稀释于灭活胎牛血清的FIV(完全缺乏血浆RT活性)与指定浓度的以下组分于室温温育1小时：A)5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，B)硫柳汞。所述样品按照“用于测定来自含RT封闭性抗体的材料的逆转录病毒RT的方案”进行分离。用一种RT测定(Cavidi HS kit Lenti RT)来确定回收的RT活性。将每一活性值换算成由不含任何巯基活性物质温育制备的相同步骤的对照的百分比。相对于该对照的FIV RT的回收率是最初样品活性的74％，人血浆RT的对应数字是0.015％。见图2，其中左侧柱是血液捐献者血浆，右侧柱是胎牛血清中的FIV病毒。

用浓度大于0.4mM的5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)温育完全消除了人血浆RT活性但不减少FIV病毒体相关性RT的回收。

需要高浓度的硫柳汞(＞3mM)对血浆RT达到类似的效果。这一浓度范围的硫柳汞显著降低了FIV RT的回收。

实施例5.来自健康血液捐献者的血浆样品中聚合酶活性的消除。

将两套来自21个健康血液捐献者的1ml EDTA血浆样品按照“用于测定来自含RT封闭性抗体的材料的逆转录病毒RT的方案”进行处理。5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)处理(步骤A)对一套样品省略而用于另一套样品。采用CavidiHS kit Lenti RT，在过夜RT测定中测定从每种样品中回收的RT活性的量。见图3，其中左手组表示按所述方案进行的未处理的样品。右手组是处理后按同样方法进行的样品。分离对照，如适合样品分离的缓冲液给出的值在每小时262rfu和1100rfu之间。荧光计的检测范围高达大约1800 000rfu。

实施例6.按照本发明从人血浆回收的HIV RT活性和用RNA PCR测定的病毒RNA之间的相关性。

将来自HIV感染个体的1ml EDTA血浆样品按照“用于测定来自含RT封闭性抗体的材料的逆转录病毒RT的方案”进行处理，并且采用CavidiHS kit Lenti RT在过夜RT测定中测定从每种样品中回收的RT活性的量。按照标准曲线，将所获得的RT活性换算成pgHIV 1 RT。通过标准HIV 1 RNA PCR(Roche，Amplicore)测定每个样品中HIV 1 RNA的量。图4中给出的曲线限于PCR值＞500拷贝/ml的样品。

发现按照本发明回收的血浆RT的量和用PCR测定的HIV RNA的量之间密切相关(r＝0.93，n＝33，p＜＜0.001)。

实施例7.用于处理来自HIV感染患者的血浆样品的替代方案。

在“用于测定来自含RT封闭性抗体的材料的逆转录病毒RT方案”中聚合酶灭活步骤以四种方式进行：A)将血浆和物质单独温育。B)病毒体结合于凝胶的同时进行温育。C)贮藏期间凝胶浆中包括所述物质并且将所述预处理的凝胶用于RT分离。D)所述物质首先结合于凝胶，未结合物质通过洗涤除去并且经处理的凝胶按照所述方案来使用。结果列于图5。血浆RT活性(◆)，HIV RT活性(●)。

发现所有四种替代方案都有效，如灭活了血浆RT活性而不影响HIV RT活性，但是需要定量消除人血浆聚合酶活性的物质量是不同的。

实施例8.用不同的半胱氨酸改性剂处理后血浆聚合酶活性的恢复。

首先将一套人血浆样品(60％血浆溶液)和3mM指定的半胱氨酸-改性物质或水(对照)于室温温育1小时。然后加入5种潜在的再活化物的系列稀释物，并且将样品再温育1小时。每种样品最终以1∶20稀释并用CavidiHS kit Lenti RT测定残余RT活性。在样品温育和RT测定之间物质浓度共减少200倍。回收的RT活性换算成两步温育期间由不存在添加物的温育血浆对照的活性百分比。结果列于表3。

三种测试的半胱氨酸改性剂都有能力完全灭活血浆RT活性。然而在需要恢复活性的聚合酶中用不同试剂处理的情况存在明显差异。用硫柳汞处理的酶非常容易恢复活性而用5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)或氯胺T处理的酶需要硫醇类低分子量强还原剂来活化。

从表3可明显看出，有必要避免使用很强的拮抗剂来灭活聚合酶改性剂。因为存在恢复血浆聚合酶活性的危险！

实施例9.不用纯化的具高内源性RT活性的样品中病毒RT的定量。

将A)来自健康血液捐献者的EDTA血浆，B)以加热灭活的FCS稀释的FIV病毒(缺乏RT活性)或C)含5％FCS的Dulbeco必需培养基以1∶1稀释并与指定浓度的5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)于室温(20℃)温育1小时。然后将每种样品以调节缓冲液(B)连续稀释四倍。然后向所有样品中加入半胱胺至终浓度为20mM，将该套样品于室温再温育1小时。接着用CavidiHS kit Lenti RT测定每种样品的RT活性。向135μl反应混合物中加入15μl的每种样品，使得测定中半胱胺的终浓度为2mM。经RT测定相当于7.5，1.9和0.5μl的三个初始样品稀释物中回收的RT活性，换算成不存在物质温育对照的百分比并对物质浓度作图，见图6。

用浓度大于0.47mM的5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)温育后消除了人血浆聚合酶活性。用浓度小于1.88mM的物质温育对FIV病毒RT的回收没有不利影响。因此天然样品中的FIV RT可以用浓度范围在2mM左右的5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)温育后进行选择性测定。

           表1.人血浆中未鉴定RT的一些性质

                    odT    RT测定所示酶的活性(％)

加入指定成分

                    量(ng)    HIV    FIV   血浆1   血浆2

无                   0         0      0      0       0

无                   3         95     93     47      51

无^*                 12        100    100    100     100

KCl(0.1M)^a          12        87     110    17      20

ddTTP(2.5 10^-6M)^a  12        18     28     7       9

ddCTP(2.5 10^-6M)^a  12        89     75     94      103

ddGTP(2.5 10^-6M)^a  12        94     93     103     109

ddATP(2.5 10^-6M)^a  12        90     79     94      105

PFA(1mM)^a           12        1      ND     92      94

^*100％RT活性的对照条件

^a在RT测定中的终浓度

PFA＝磷酸甲酸三钠(trisodium phosophonoformate)

          表2.能够破坏人血浆RT活性的物质

                                             HIV病毒体

                                对血浆RT的作

物质名称                                     RT的回收率

                                用ED₅₀(mM)^*

                                              (％)^a

醋酸苯汞                            0.11       69

硫柳汞                              0.25       130

对羟基汞基苯甲酸酯                  0.12       72

N-乙基顺丁烯二酰亚胺                0.18       157

5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)       0.018      120

2-氨乙基2’-氨基乙烷硫代磺酸酯      0.18       112

2，2’-二硫代吡啶                   0.04       100

2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸             0.2        72

甲基甲烷硫代磺酸酯                  0.1        84

^*ED₅₀有效剂量50。减小血浆RT活性50％所需的物质浓度。^a用5mM指定的物质温育并按方案I纯化从人血浆病毒体中回收的HIV RT。

           表3.用半胱氨酸-改性剂处理后血浆聚合酶活性的恢复

首次温育中       用指定物质第二次温育后的聚合酶活性(对照^a的％)

的破坏试剂  浓度(mM)  半胱氨酸  半胱胺  DTT^b MSA^c 谷胱甘肽  水

无            30        198       6      860    7      13     100

              10        145       6      767    64     80     100

              3.3       82        9      613    110    78     100

              1.1       72        15     260    109    72     100

3mM硫柳汞     30        68        1      448    3.4    7      0

              10        37        2      377    7.3    37     0

              3.3       14        0      248    19     21     0

              1.1       4         0      84     17     12     0

3mM DNBA^d    30        7         1      122    0      2      0

              10        0         0      143    0      1      0

              3.3       1         0      1      0      0      0

              1.1       0         0      0      0      0      0

3mM氯胺T      30        9         0      94     0      0      0

              10        4         0      80     1      3      0

              3.3       2         0      51     0      0      0

              1.1       1         0      2      6      0      0

^a没有破坏试剂温育的对照。^b二硫苏糖醇。^c巯基琥珀酸。^d5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)

参考文献：

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