一种以贾第鞭毛虫病毒作基因表达载体的真核表达系统

摘要

本发明提供一种以贾第鞭毛虫病毒作基因表达载体的真核表达系统，利用贾第鞭毛虫(Giardia)dsRNA病毒(virus)作为基因转染载体，采用DNA转染方式的真核表达系统和以RNA转染方式的真核表达系统两种。蓝氏贾第虫病毒基因组小(6273bp)，稳定，易纯化，能在体外有效地感染贾第虫滋养体，且具有较小的细胞毒性，贾第虫病毒基因复制的拷母数多，而且其病毒的衣壳蛋白是在贾第虫体内合成的优势蛋白。贾第虫为真核生物，外源基因在贾第虫体内表达出的蛋白具有活性。贾第虫在体外易培养，随着贾第虫的传代培养，外源基因可无限制地在体外大量制备。克服现用真核基因表达系统表达效率低，易出现基因污染等问题。

说明书

技术领域：

本发明提供一种以贾第鞭毛虫dsRNA病毒作基因表达载体的真核表达系统，属于基因工程技术领域。

背景技术：

基因工程的最终目的是在一个合适的系统中使外源基因高效表达，从而生产有重要价值的蛋白质产品。基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。而要进行外源基因在原核或真核细胞中表达首先必须构建基因表达载体。现在使用的原核表达载体很多，如非融合型表达蛋白载体PKK223-3，分泌型克隆表达载体PINIII和融合蛋白表达载体PGEX等。真核细胞表达载体有SV40载体、腺病毒载体以及痘苗病毒载体等，然而目前存在问题是原核表达载体形成的表达产物可能没有蛋白活性，使用的真核表达系统表达效率低，易出现基因污染等问题。

发明内容：

本发明提供一种以贾第鞭毛虫dsRNA病毒作基因表达载体的真核表达系统，克服现用真核基因表达系统表达效率低，易出现基因污染等问题。

贾第鞭毛虫简称贾第虫为真核生物，外源基因在贾第鞭毛虫体内表达出的蛋白具有活性。贾第鞭毛虫在体外易培养，随着贾第鞭毛虫的传代培养，外源基因可无限制地在体外大量制备。克服现用真核基因表达系统表达效率低，易出现基因污染等问题。

本发明利用贾第鞭毛虫(Giardia)dsRNA病毒(virus)作为基因表达载体，在贾第鞭毛虫体内进行外源基因的真核表达。如：采用DNA转染方式的真核表达系统和以RNA转染方式的真核表达系统两种：

1、以DNA转染方式的真核表达系统

将装在质粒载体上的贾第虫病毒全长cDNA的5’端非翻译区前连接贾第虫基因的启动子和信号肽基因(亦可不连接信号肽基因)，后在5’端367至800bp间和3’端637至2017bp间分别用NcoI和XhoI酶切，并在此处插入外源基因，构建含外源基因的重组质粒，然后将该质粒通过电穿孔等方法转染贾第虫，利用贾第虫的启动子和信号肽，通过病毒的同源重组表达外源基因。

2、以RNA转染方式的真核表达系统

在贾第虫病毒全长cDNA的5’非翻译区前端加入T7启动子，并在5’端非翻译区后的367至800bp间和3’端637至2017bp间插入外源基因，后用RNA聚合酶进行体外转录，并将其转录体电穿孔至含病毒的贾第虫体内。通过病毒的同源重组表达外源基因。

以贾第虫病毒全长cDNA基因序列或大于50bp的该基因序列作基因表达载体。

蓝氏贾第虫病毒全长cDNA基因序列：

   1 ggaaggagtg ccaggccatt accctccgcc cctgcctaac aaaactggct taccagaggc

  61 gggggggcgt ggtagacggt atgtctaggt ccagagaaag cggtcgctgt taagccgctg

 121 gacttcgcca cgcttacacc atcgagaaca cataagtggt gtaatattat gtgtttggct

 181 gcgtgtgtca cgagcacgac ccatggagga atctaaccca ggtggtgttg tgtatgataa

 241 ggtacaagcc cgtcaacacc acaggtggag agggacagga gtcccatttc ccctctagaa

 301 aacagcagtg gtccgcccct catgccctat gaaacgttag ggggccgaca ctagtgggca

 361 agcccgatgg tgtgggggac tggatatggg aacaccagtc cgttaaaccc gtacggcttc

 421 gccagcctac accggggggg gcttaatccc cttattttgg cacctgaaaa tattactttt

 481 gacactttga acacacagaa tgaccacgag gagacctacg gagagtctcc agaggttcct

 541 aaggcctcga tcgcgcctgc cgggaggcag aatgtcccgg ttctccaaca aaaacaagaa

 601 aacgaagata atcacgcgct gggcggcagc gaggacgcca aagacgagcg cgaaatacag

 661 ttttcagcta taaaaactct ctacaattat tactcagaag gtccttcgat cccaattatg

 721 ccacatttag tcaacaggtt acgaggatta gatgctctag ccaaggtaga cgcgacgctg

 781 agcaaggtgg atatgaacgc ggcctacata ttcgccctga gaccgacttt tccgtattcg

 841 tatgggtata aacaacgttt cagtaacagg agattgacca ctagtgcgct ttgctacgca

 901 aggacaggcc tatcctcatt tctgacagtc gacaaaacgt acacgtccaa ctctccatta

 961 aaagggggct ctagagggtg gcccattttt aacataggtg tttcgccaca cgtggcggag

1021 cctcacatga ggacattgtc acctatcggt cttgaagtat tcaatctggc tacttctcag

1081 ttttcgaaaa ctctattaac tgcatcatcg aaagtcttca cgcagtcact ctacactgct

1141 gacatactat cgatctttgg tgaggtgttc ctgccacacg tgatgcaacc ggtctcaaac

1201 tacactccaa tacttgtgag ggcgctattg gccttgatcc acatactggg gccaggatct

1261 ggtaattgct cactttcatc gtctatcttt gagagttcaa ttccacaatt cttaacgata

1321 agccatagta caaacatgtc gaacagaacg aggtactgct tacatacatg gtctgcttac

1381 aaggatatgt tcagaaacgg tatcccacct cagtcgacgt ttccaccgac gctcgcgcca

1441 gaggggtcct ctgctcggat tctaatccca gcggccctag tgaccagccc tatgtttcca

1501 tggttacttg tattagtctc gagcggccca cagttcttct tgtattcaaa ggacgctagt

1561 attaataccg tacacatcgg ttcgaggggg aggattacat caccaatctc tgacgtcgcc

1621 caccttgatc tccacagact ctggaatctc ttccgttttg atggttaccg ctatatcgac

1681 gtggtcatag tgggcgtagg tagagattat gtgtggccct atcaaaatgg cgtgtatgta

1741 cacggcggta agggacccaa aggtactgac aactacgaga atgctgacgt tcacgacgga

1801 atagggacga tattttcgtc ctttaataac aatgttaacg tgcaaacgtc cgacctcctg

1861 ctaggcttat cgaccctgtg gaatcacata gcgactacgt acgctactga ggaggaggtt

1921 accatggcga ttaagattgc agcggctttt gccctcgtct acccagtaca gcctattgtc

1981 tactctggct gttcgagcgc ttttcataat cacacgtcat atttccagcc ctcatcggag

2041 aactgctaca caaccgatac ggctgaagtg aagagcacgt gggatacggt cgagcttagt

2101 gtacaggtta acgacgctat ggtactaggt atgacactac cgtttggcca acctacagtt

2181 agcagtgcac gatggtttaa taacatcgat aaggccgaga tctctatgtt taaggtcggt

2221 aatctaccgt tacagaacct cgattatcta tctctcgaca tgatggaatt ctacgctcct

2281 acgacgggac aattgtacga catacgtagt gataacctga tctcgagcgc ccataggacg

2341 gtgaacctcg gaataggcta cacagccctg gcagatttct tcgcctatct agcttcagtt

2401 cctgcccaga gtttttacca cgacaggatg gtcacctcac cgatttcaaa gcaggcgtac

2461 tccgtctatg aacgttttat tgaacgtttt attgatgact tcgtgggctg gggcagatgt

2521 gacctgttca accttgatac attgttacat gcaaaacaca tagtcggggt accctcatct

2581 ctaatcccgt ggcactgctc gctacagaga tgtccactac ccataatcat gcattacaca

2641 ggcctacatt tcggccagga gcatataaca gtcagggacg tcgccggggt tgaaggctta

2701 cagcagattg tgttgaggaa cgaccagggt agtatcgtac tagacgcctt gggcactgct

2761 gcaccatcta gacttgcagt caaattagac tggtctaagc ttagcgcctg gtactcagat

2821 acaacctgcg ccatcccttt atccgatcgt gtgatggaga tcgtcaatta cgcagcaata

2881 tgggatccta cgcaggaaag acgcgcacag gtttcgtgta cacatacttt agccccaact

2941 tcctttcgag ctttaacgtg tctgagccta tattccacaa ggccatcaac cttacaccac

3001 cttacgatga cacgagccaa actgtaattc aaaatttgtc catgccacag atgctcagct

3061 tcgatcccta ctacgagtct acgttctatg tggtctccgc ggataacgag tggataccga

3121 cttcagggcc tgcttggaag gtaccatacc tggaaaacgt agttaagcgg tctggcaggc

3181 gcttgctggc ggagctcagg atagcatcca ataacgggtc tggagaccgt accttcttga

3241 cgacgtgtaa gacaagaaaa ggaaggcatt atgcctattt ctctgctgct ttggggggca

3301 agatcctgga attcgtatgc gctccactgt cgagtatcag tctccagggc gggcaaacga

3361 tctacgctcc gattcagctc caagacgcca taccagtacg tagagaagat ccagtgccag

3421 ggagcatata cgcagtcttt aagtttttct cagaaccaaa ggcttgggag atacgtgcac

3481 ttaagtccta caaagttagg ttccaagatc tcccaagcca catagtgatt agtgagctaa

3541 aagagagagc ggcgagaagt tatatcgggt cgaggggtta tgtcgataca ggttttaagg

3601 ctttggacat ttatatagat attctttccc aaatggagct gccaaagtac atacacgagt

3661 tcttagtttt actcagaggc aaggtgtgtg aagtttcgag gttgtacaag aaggaacagg

3721 tattcataat actactaacc gtattctctg agctcacagc catagttcgc catagaggta

3781 acaagtccac ggggtcgatg gggaggatgt ggactttgtt atcagacttc gagaccctgc

3841 ttgggaaggt gagctataag aacccgagta tcattgagga gcaggttgtt ccctggctaa

3901 cctcagatcc tataccacgt acccctgatt tctactctac gtatttcaag atggcggttc

3961 agtttatgca caggacattc gttcctgtca ctctcagaag tgcccctccg ttaacatttt

4021 acgagtactg tgcgaggtcg gagctctggg gaaccacggg atccggctac atcggctatg

4081 gcaagcgcag tttcaacaaa tggtcgatct acggagctta tcctaccgag gagatttatc

4141 ggctagcact ctatggagat aatccacccc tcaagccgct ggaaaaaccc gaacttacga

4201 aggtacgtgc tgtaatctcc gcctctttcc aatcgtacat attgatgtcc tacctcgagt

4261 acatcatggc agacacctta gttgacaaag cattcactac aactctgatg aacgacaggc

4321 agttagagaa ccttgagcgc cacatgatga ccatgaccgg aggagtcagg gttccagtgg

4381 accagtccaa ttttgatcgt cagcctgact tggtccaaat aggcatctgg caacagttac

4441 tatttcacct agcatctgcg tcagccccgt acagggcccg cgacagtgtc tcactagtca

4501 tatcacgttt agcctcaact acgaccttcc cgaacctaaa ggtacggatg tcggacggtg

4561 ataaacgtgt gctacacggc ctcccctcgg ggtggaagtg gactgctctg ctgggggctc

4621 tcatcaatgt gacacaactt ctaaccatgg cggaattgtc caacactctg gcctcgttga

4681 ggtcaacggt ggtacagggc gacgatatcg ctctaagtat gactgaccgg gagcaggcca

4741 cacagttagt tgacacttat gcacgtcaag ggttcgaggt caacccgaag aagttctgga

4801 tatcacccga ccgggacgaa ttcctccgga gggtagcaac ccctggtata gtcgcggggt

4861 acccagctag aatgatgatt aaattgttat atcagttgac ggaacctgaa gagccctcac

4921 actacatctc catgttgcca aagctagcga aggtgcctaa catggtccgg gagtatgtaa

4981 gcccccggtc tgatgtgcca tggtcggaga ccgtcgaaga acttgattgg cgcgaagctc

5041 tcgctatact gaggcatagg cctgcccgta catcagaact ggtgactcaa tggctgcaac

5101 tgattggtag gtttacagct gctcatcctg ataagcgagc cttaactctt ctttaccatt

5161 ggttcgtgag agacttgacg catgctacaa aaataaaaaa aagaaatctt ctggtcctgt

5221 tacagcagcc gggcttctgg ggaggttatt cccagagcct ggttggcttg ttaaggacca

5281 ctcacctcgc agatatgata gttagcgaac tagacatagg actgccaggt cctcgggcca

5341 cgtctaatcg ctttgggaca tcccctactt cactggcccc gcactacctc actctgatag

5401 ttccgagtag cgtgcatgtg cagtcgcaaa aggaactgga tttgtggggg ctgtgcagat

5461 ccagtatata tgctaagcac tattcaaaca tatttcgata ctacaaactg actcttccta

5521 cgttggtgct ttgggcccaa cggctaggtg ataaacacgt caccgatttc attagatctg

5581 tcaccctggg ttcagaaata ccaaaatatg acccgcatac gcgtctattc acaagtaacg

5641 gggtgtcagt aggaacgtta ataaggataa gagtacgaca ttttacccac agagtgcttc

5701 gaagagagac acctaagtgt atccccgtaa tcgtcgggct atatcgggag cagacactat

5761 ccgttccgga gagtgttcgt ctatcggaac ctgacaagat actatcaagc ctacaacggg

5821 cgtcgggtta ctcactgagt ctagttaaga agatattaca gatcactagg aaaccagtgg

5881 accatccggt ggacgcgagg ttctcacagg cattccctaa caactggagc gacttggcta

5941 gaacggctgg cacctttttg ttaactgtac cggcttagga ggtttcagga gacaatgcta

6001 gccttgtcgc tgagcgtttg ggcttcaacc atagcagccg gcttcacgca atttttaggt

6061 caaggaaatt tctcctttgc gtagtagcgt agctgctcaa agaaaagaaa atactagtaa

6121 ttactgcaca cgatcggtgg gtcggccagc atagggtggt gtgcggtccg agaacgggac

6181 tggccttagt accgtcataa cacctggaca cgtgttgaaa ctgtcccccc tgtagactcc

6241 gttggctgta ggaggcagcg tacgaggggg tcg

本发明的积极效果在于：贾第虫病毒基因组小，稳定，易纯化，能在体外有效地感染贾第虫滋养体，且具有较小的细胞毒性，贾第虫病毒基因复制的拷母数多，而且其病毒的衣壳蛋白是在贾第虫体内合成的优势蛋白。贾第虫为真核生物，外源基因在贾第虫体内表达出的蛋白具有活性。贾第虫在体外易培养，随着贾第虫的传代培养，外源基因可无限制地在体外大量制备。

附图说明：

图1.转染用编码GLVcDNA-gp40基因的嵌合RNAs的构建。

A：蓝氏贾第虫病毒全长cDNA；

B：编码GLVcDNA-gp40基因的嵌合RNA；

T7启动子，GLVcDNA非翻译区，gp40基因，”

终止密码子。

图2为ppoly2/sfinot GLV-GP40重组质粒构建图。

蓝氏贾第虫的启动子和信号肽基因；“GL”蓝氏贾第虫；

隐孢子虫GP40基因；蓝氏贾第虫病毒全长cDNA。

具体实施方式：

实施例1

以RNA转染方式的真核表达系统。

如图1所示，将蓝氏贾第虫病毒(Giardia lamblia)全长cDNA的5’端连接T7启动子，然后在5’端670bp处和3’端2017bp处，用体外诱变试剂盒诱变产生NcoI和XhoI酶切位点，分别用NcoI和XhoI酶切，同时将隐孢子虫gp40基因两端产生NcoI和XhoI酶切位点，用NcoI和XhoI酶切，在T4DNA连接酶的作用下，将隐孢子虫gp40基因与蓝氏贾第虫病毒基因进行连接，然后在T7RNA聚合酶的作用下进行体外转录，将转录体100μg在电压1000V/cm，电容50μF条件下电击，转染含病毒的蓝氏贾第虫滋养体内，电击后将电转杯放在冰浴中10min，后进行37℃培养，用PCR等方法鉴定外源基因在蓝氏贾第虫体内的表达。

实施例2

以DNA转染方式的真核表达系统

如图2所示，将装在ppoly2/sfinot质粒载体上的蓝氏贾第虫病毒(GLV)的全长cDNA(ppoly2/sfinot GLV)5’端连接蓝氏贾第虫a微管启动子基因和信号肽基因，后在其5’端670bp和3’端2017bp处，用体外诱变试剂盒诱变产生NcoI和XhoI酶切位点，分别用NcoI和XhoI酶切，同时将隐孢子虫gp40基因两端产生NcoI和XhoI酶切位点，用NcoI和XhoI酶切，在T4DNA连接酶的作用下构建重组质粒ppoly2/sfinot GLV-gp40，将该质粒50μg在电压400V/cm，电容800μF条件下电击，转染含病毒的蓝氏贾第虫滋养体内，电击后将电转杯放在冰浴中10min，后进行37℃培养，通过PCR及Western blotting检测gp40基因在蓝氏贾第虫体内的表达。