对癌发生具有抑制作用的可可豆和可可豆壳的提取物

摘要

本发明涉及可可豆和可可豆壳的提取物和级分，它们抑制属于癌发生助长和进展阶段过程中发生的病理现象的GJIC(缺口连接细胞通讯)抑制和癌细胞DNA的合成。

说明书

发明领域

本发明涉及对癌发生具有抑制作用的可可豆和可可豆壳的提取物，且更具体地说，本发明涉及可抑制属于包括肝癌在内的各种类型癌症发展过程中的病理现象GJIC(缺口连接细胞通讯)抑制以及癌细胞DNA的合成的可可豆和可可豆壳的提取物和级分，由此抑制癌细胞的增殖。

发明背景

巧克力和可可的活性组分可可(可可)表示不可思议的上帝的食品的含义。看起来可可的原始来源出现在中美洲到南美洲北部范围内的区域。在中美洲的几个国家已经将可可与玉米一起看作是有价值的食品之一，这种情况从史前时代已经有很长的栽培历史且目前已经被世界上绝大多数人所广泛钟爱、无论是种族、年龄和性别。

巧克力的活性组分可可豆通常含有大量酚类植化成分和可可碱以及食物纤维，不过，其组成随栽培地不同而改变。在生产巧克力的过程中，将剥去皮的可可豆的豆肉部分用作巧克力或可可的原料，而随后将产生的其壳的大部分(约可可豆总重的15wt％)作为副产品丢弃。例如，目前世界范围内的可可豆的产量约为250万吨，它们中约有400,000吨可可豆壳被丢弃。根据1990年韩国海关管理局(Office ofCustoms Administration of Korea)公布的年度贸易统计，在韩国约有600吨可可豆壳作为废物被抛弃。然而，就可可豆而言，目前已知可可豆壳中含有大量酚类植化成分和可可碱以及食物纤维。

从此以后，对可可豆的功能应用的研究首先集中到可可豆中的多酚类、矢车菊苷配质上。本发明者(Mars Inc.)预先公开了可可豆中唯一的矢车菊苷配质级分能够杀灭白血病、前列腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等的癌细胞并抑制拓扑异构酶II的活性(韩国专利申请号198-707952)。然而，本发明者尚未证实可可豆对肝癌和胃癌的作用且另外在上述专利中含有可可碱的级分不同于含有矢车菊苷配质的级分而对癌症没有作用。

在上述发明前，本发明的发明者公开了从生产巧克力中获得的作为副产品的可可豆壳在经济上是可利用的且其含有矢车菊苷配质A和矢车菊苷配质C-1的化学聚合物组合物可有效地抑制导致龋齿的主要原因的葡糖基转移酶，由此通过混合可可豆壳的可溶性提取物而制成了用于预防龋齿的口香糖(韩国专利KR1991-45179和美国专利US4,908,212)。

本发明的发明者预先还公开了一种对葡糖基转移酶具有改善的抑制活性的可可豆壳级分的制备方法，该方法通过增加多酚含量来进行(美国专利US6,159,451)。

如上所述，可可豆和可可豆壳含有各种具生理活性的成分，诸如食物纤维、酚类植化成分和可可碱。因此，可可豆和可可豆壳的生理活性不能仅由单独的某一结构的矢车菊苷配质代表且另外看起来对某一结构的矢车菊苷配质的商业利用因高生产成本而并不切实际。因此，更为实际的是应用通过如美国专利US6,159,451中公开的单纯分离方法制备的具有许多改善的生理活性的级分。

尽管在过去的几十年有外科手术、放疗和化疗，但是包括肝癌、胃癌和结肠癌在内的大部分上皮细胞癌的发生率和由上述癌症导致的死亡率并没有显著下降(Sporn，M.B.，Lancet，347：1377-1381，1996)。看起来这种情况是过去30年来针对癌症的手段大部分集中在治疗观点而非预防观点上所导致的。正如已知的，摄取含有可有效抑制或延缓癌症多个发展阶段的成分的某一食品或药物有助于降低癌症的发生和随后由它导致的死亡率且已经进行了大量研究(Kang等，Chemica1 prevention of cancer，Korea Medicine，2000；Surh，Y.J.，Mutat.Res.，428：305-327，1999；Sporn，M.B.，Lancet，347：1377-1381，1996；Caragay，A.B.，Food Technol.，65-68，1992)。

癌发生是由刺激、助长和发展3个阶段组成的多阶段过程。在研究可有效预防或抑制癌症的活性剂的过程中，近期的研究更多地涉及到鉴定可以抑制助长和发展阶段而非刺激阶段的物质，刺激阶段是一个短期且不可逆转的阶段(Kang等，Chemical prevention of cancer，Korea Medicine，2000；Surh，Y.J.，Mutat.Res.，428：305-327，1999；Sporn，M.B.，Lancet，347：1377-1381，1996)。特别地，用食物提取物和级分预防和抑制癌症不同于药物而成为更有效的手段，条件是它们以癌发生助长阶段为靶，这一阶段一般发展了20年以上且还可逆转(Kang等，Chemical prevention of cancer，KoreaMedicine，2000；Yamasaki，H.等，Carcinogenesis 11：1051-1058，1990；Kelloff.G.J.等.，Eur.J.Cancer，35：1755-1762，1999；Surh，Y.J.，Mutat.Res.，428：305-327，1999)。缺口连接细胞通讯(GJIC)对通过调节多细胞生物体内细胞增殖和分化来调节内环境平衡来说是必不可少的。将抑制GJIC看作在癌发生时、特别是在癌助长阶段观察到的关键生化指标；因此，预计可以抑制这类过程的物质可抑制癌发生的助长阶段，由此预防并抑制癌症的发展。此外，将由DNA合成导致癌细胞增殖看作癌发生发展阶段时观察到的关键生物指标；因此，预计可以抑制这类过程的物质可抑制癌发生的发展阶段，由此预防并抑制癌症的发展。(Kang等，Chemical prevention ofcancer，Korea Medicine，2000；Surh，Y.J.，Mutat.Res.，428：305-327，1999；Holder.J.W.等Cancer Res.，53，3475-3485，1993)。

发明概述

本发明的发明者在研究基于安全原因的来自天然食物的抗癌剂的有潜力候选物的过程中进行了广泛研究并发现可可豆和可可豆壳的提取物具有抗癌活性，诸如抑制癌发生助长阶段过程中发生的GJIC抑制、在体内环境稳定中起重要作用和通过抑制癌细胞的DNA合成来抑制增殖。此外，通过下列步骤获得的可可豆和可可豆壳级分对癌症的发展具有极佳的抑制作用：通过溶剂提取制备可可豆和可可豆壳的提取物；将其装填入吸附树脂；用40％乙醇进行分级分离并用60％乙醇对残余物重新进行分级分离。此外，已经作为废物丢弃的可可豆壳的利用可以增加经济价值。

因此，本发明的目的是提供一种包括可可豆和可可豆壳提取物和级分作为活性组分的抗癌剂。

附图描述

附图1是表示可可豆和可可豆壳的级分对大鼠肝脏上皮细胞中由H₂O₂产生的GJIC抑制的抑制作用的一组图，其中H₂O₂是人体内的癌症助长剂和最强活性氧种类(ROS)之一(a：对照组；b：使用400∏M H₂O₂治疗的组；c：使用10∏M/ml可可豆级分+400∏M H₂O₂治疗的组；d：使用10∏M/ml可可豆壳级分+400∏M H₂O₂治疗的组)。

附图2是表示可可豆和可可豆壳对大鼠肝脏上皮细胞中由H₂O₂产生的控制GJIC的主要蛋白质连接蛋白43的超磷酸化抑制作用的图(a：对照组；b：使用400∏M H₂O₂治疗的组；c：使用10∏M/ml可可豆级分+400∏M H₂O₂治疗的组；d：使用10∏M/ml可可豆壳级分+400∏MH₂O₂治疗的组)。

附图3是表示可可豆和可可豆壳级分通过抑制一种肝癌细胞HepG2的DNA合成对肝癌细胞增殖抑制作用的示意图。

附图4是表示可可豆和可可豆壳级分通过抑制一种胃癌细胞SNU1的DNA合成对肝癌细胞增殖抑制作用的示意图。

附图5是表示可可豆和可可豆壳级分通过抑制一种结肠癌细胞SNUC2A的DNA合成对肝癌细胞增殖抑制作用的示意图。

本发明的详细说明

本发明涉及一种包括可可豆和可可豆壳的级分或提取物作为活性组分的抗癌剂。

本发明具体描述如下。

本发明的可可豆和可可豆壳的提取物和级分用于预防并抑制癌发生，这一过程不仅通过抑制GJIC的抑制、而且通过抑制癌细胞DNA的合成来进行，所抑制的这些现象是癌发生助长和发展阶段过程中发生的特征现象。因此，本发明还涉及含有可可豆和可可豆壳的级分或提取物作为活性组分的药物或食品添加剂。

可可豆和可可豆壳提取物和级分的制备方法如下。

首先，从干燥的可可豆中除去可可油并将1重量份剩余的可可豆部分(可可质量)或可可豆壳加入到4-10重量份的50％丙酮、50％乙醇或50％甲醇的水溶液中。然后对该混合物进行搅拌提取，同时在40-70℃下回流4-6小时。在将所得提取物离心后回收上清液并再次重复提取剩余的量。将提取物干燥、过滤且然后获得可可豆和可可豆壳的提取物。使由此获得的提取物吸附在基于苯乙烯的多孔树脂上、用40％乙醇洗涤且然后用60％乙醇进行溶剂分级分离而最终得到可可豆和可可豆壳的级分。

研究由此获得的可可豆和可可豆壳提取物和级分对GJIC抑制和癌细胞增殖的抑制活性。所得的结果表明可可豆和可可豆壳的提取物和级分不仅可以抑制癌细胞DNA的合成、而且可以抑制属于癌发生助长和发展阶段过程中发生的特征现象的GJIC抑制。

本发明还涉及包括可可豆和可可豆壳的级分或提取物作为活性组分的药物或食品添加剂且所述药物或所述商品名添加剂的制备方法是一种公知方法。

可以将可可豆和可可豆壳的级分单独用作药物。不过，也可以将其与药物上可接受的载体、成形剂、稀释剂等混合而制成粉剂、颗粒、胶囊和注射剂的形式。

本发明的可可豆已经长期用作可食用的食品且相对于对其提取物和级分的医疗用量而言没有特别的限制，不过医疗用量可以随患者身体吸收率、体重、年龄、性别和健康情况、给药时间长度、给药方法、排泄率、疾病的严重性等的不同而改变。一般来说，优选每1kg体重给予0.1-10mg的可可豆和可可豆壳级分。因此，制备包括本发明活性组分的药物应考虑到所述提取物和级分的有效范围。可以在专家的监督下按照特定的医疗方案给予由此制备的给药用单位制剂或根据患者的需求给药或在规定时间间隔给药几次。

可以将可可豆和可可豆壳级分用作饮料、胶质软糖、糖果等的食品添加剂。包括可可豆和可可豆壳提取物或级分作为活性组分的药物或食品添加剂在预防癌症和抑制癌症发展方面具有极佳的抑制作用。

在下文中使用下列实施例来具体描述本发明，不过，不应将这些实施例看作用来限定本发明的范围。

实施例1：具有抗癌作用的可可豆级分的制备

步骤1：通过溶剂提取制备具有抗癌作用的提取物

从可可豆中除去可可油，每1重量份剩余的部分(可可质量)加入6重量份的50％丙酮溶液(Duksan Co.，Ltd.，Korea)并在60℃下进行搅拌提取5小时，同时回流。在4℃下以8,000rpm的速率(Vision Co.，Ltd.，Korea)将该提取物离心30分钟并收集所得的上清液。将残余物重复提取1次并合并全部提取物。将由此收集的提取物通过滤纸(Whatmann41)过滤、蒸发、冷冻干燥且最终得到可可豆的提取物。

步骤2：通过吸收柱层析法制备具有抗癌作用的级分

基于美国专利US6,159,451中公开的方法，通过使用上述步骤1中制备的提取物经吸收柱层析法来制备可可豆级分。更具体地说，使上述步骤1中制备的提取物吸附在疏水树脂XAD-4(Sigma Co.，Ltd.，U.S.)或HP-20(Mitsubishi Co.，Ltd.，Japan)上并使用20％、40％、60％、80％、100％的乙醇依次进行分级分离。

实施例2：具有抗癌作用的可可豆壳级分的制备

步骤1：通过溶剂提取制备具有抗癌作用的提取物

从可可豆中除去可可油，每1重量份剩余的部分(可可质量)加入6重量份的50％丙酮溶液(Duksan Co.，Ltd.，Korea)并在60℃下进行搅拌提取5小时，同时回流。在4℃下以8,000rpm的速率(Vision Co.，Ltd.，Korea)将该提取物离心30分钟并收集所得的上清液。将残余物重复提取1次并合并全部提取物。将由此收集的提取物通过滤纸(Whatmann 41)过滤、蒸发、冷冻干燥且最终得到可可豆壳的提取物。

步骤2：通过吸收柱层析法制备具有抗癌作用的级分

基于美国专利US6,159,451中公开的方法，通过使用上述步骤1中制备的提取物经吸收柱层析法来制备可可豆壳级分。更具体地说，使上述步骤1中制备的提取物吸附在疏水树脂XAD-4(Sigma Co.，Ltd.，U.S.)或HP-20(Mitsubishi Co.，Ltd.，Japan)上并使用20％、40％、60％、80％、100％的乙醇依次进行分级分离。

对由此获得的可可豆和可可豆壳提取物以及随后获得的级分检验它们对通过由H₂O₂抑制GJIC和对癌细胞DNA合成的抑制作用的抗癌作用，所抑制的现象属于癌发生助长和发展阶段过程中发生的特征现象。

实施例3：可可豆和可可豆壳提取物和级分对由H₂O₂抑制GJIC的作用

正如下面进一步所解释的，通过按照Scrape Loading/DyeTransfer(SL/DL)测定法(Upham，B.L.，Kang，K.S.，Cho，H.Y.，&Trosko，J.E.，Carcinogenesis，18：37-42，1997)的公知方法测定肝细胞的GJIC来检验可可豆和可可豆壳提取物和级分的抗癌作用。

将WB-F344大鼠肝脏上皮细胞用于测定GJIC。在37℃和5％CO₂下的培养箱(Forma Scientific Co.，Marjetta，OH，USA)中将WB-F344与10％FBS一起在添加了100IU/ml青霉素和100∏g/ml链霉素的MEM培养基中培养。用于上述培养物的培养基组成商购自GIBC0BRL(Grand Island，NY，U.S.)。将由此培养的肝细胞转入各为2ml的培养皿(1×10⁵个细胞/mL)并培养44小时。在该步骤后4小时用不同浓度的可可豆和可可豆壳提取物和级分与400∏g人体内公知癌助长剂和最强活性氧种类之一的H₂O₂一起处理细胞，同时仅用新鲜培养基替换对照组。上述处理后1小时通过聚焦显微镜(BioRad，Hercules，CA，USA)、使用荧光黄染色观察可可豆和可可豆壳提取物和级分对由H₂O₂抑制缺口连接通道的抑制水平。将可可豆提取物和级分对GJIC抑制的作用列在下面的表1和附图1中。将可可豆壳提取物和级分对GJIC抑制的作用列在表2和附图1中。通过测定图中显示出的荧光亮度和长度、参比100％的对照组和单独用0％的H₂O₂处理的组来计算GJIC的增加率，其中将低于20％的活性表示为几乎没有活性。

                     表1可可豆提取物和级分对GJIC增加的作用

类别   GJIC增加率(％)   1∏g/mL   5∏g/mL   10∏g/mL    20∏g/mL提取溶剂 水   ＜20   ＜20   ＜20    ＜20 50％甲醇   ＜20   ＜20   ＜20    100 50％乙醇   ＜20   ＜20   50    100 50％丙酮   ＜20   ＜20   60    100通过用50％丙酮将提取物吸附在基于苯乙烯的多孔树脂上进行的溶剂分级分离 用20％乙醇获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20    ＜20 用20％乙醇分级分离后用40％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   30    100 用40％乙醇分级分离后用60％乙醇溶剂获得的级分   60   100   100    100 用60％乙醇分级分离后用80％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   40    100 用80％乙醇分级分离后用100％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20    ＜20

                表2可可豆壳提取物和级分对GJIC增加的作用

类别   GJIC增加率(％)   1∏g/mL   5∏g/mL   10∏g/mL   20∏g/mL提取溶剂水   ＜20   ＜20   ＜20   ＜2050％甲醇   ＜20   ＜20   ＜20   10050％乙醇   ＜20   ＜20   50   10050％丙酮＜20＜2030100通过用50％丙酮将提取物吸附在基于苯乙烯的多孔树脂上进行的溶剂分级分离用20％乙醇获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20   ＜20用20％乙醇分级分离后用40％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   60   100用40％乙醇分级分离后用60％乙醇溶剂获得的级分   70   100   100   100用60％乙醇分级分离后用80％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   30   100用80％乙醇分级分离后用100％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20   ＜20

正如上述表1和2中所示，可可豆和可可豆壳的提取物在高于20∏g/mL浓度下对由H₂O₂抑制GJIC具有理想的抑制作用。因此，证实可可豆和可可豆壳的提取物可以通过抑制属于癌症助长和发展阶段过程中特征现象的GJIC抑制来预防癌症。

此外，通过下列步骤获得可可豆和可可豆壳的级分：通过溶剂提取对可可豆和可可豆壳的提取物进行分级分离；将其装填入吸附树脂；用40％乙醇进行分级分离并用60％乙醇对残余物重新进行分级分离；所获得的可可豆和可可豆壳级分在1∏g/mL浓度下对GJIC抑制表现出超过60％的抑制作用，而用50％丙酮和50％乙醇制备的提取物在10∏g/mL浓度下对GJIC抑制表现出约30-60％的抑制作用，由此证明了按照本发明获得的可可豆和可可豆壳级分的极佳抗癌作用。

附图1是表示可可豆和可可豆壳的级分对大鼠肝脏上皮细胞中由H₂O₂产生的抑制GJIC的抑制作用的一组图，其中H₂O₂是人体内的癌症助长剂和最强活性氧种类(ROS)之一(a：对照组；b：使用400∏MH₂O₂治疗的组；c：使用10∏M/ml可可豆级分+400∏MH₂O₂治疗的组；d：使用10∏M/ml可可豆壳级分+400∏MH₂O₂治疗的组)。

正如下面进一步解释的，另外通过使用蛋白质印迹分析的公知方法(Upham，B.L.，Kang，K.S.，Cho，H.Y.，&Trosko，J.E.，Carcinogenesis，18：37-42，1997)检验可可豆和可可豆壳的级分对控制看作是H₂O₂抑制GJIC时发生的主要现象的缺口连接通道的主要蛋白质连接蛋白43超磷酸化的抑制作用。

通过使用含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的20％SDS从与GJIC测定中相同方式培养的细胞中提取蛋白质。使用DC测定试剂盒(BioRadCorp.，U.S.)测定蛋白质含量。使各约15∏g的提取的蛋白质上12.5％SDS-PAGE凝胶并通过凝胶电泳分离。在与单克隆抗体(Zymed，U.S.)反应后通过使用ECL试剂盒(Amersham，Life Science，U.S.)检测连接蛋白43。

附图2是表示可可豆和可可豆壳对大鼠肝脏上皮细胞中由H₂O₂产生的控制GJIC的主要蛋白质连接蛋白43的超磷酸化抑制作用的图(a：对照组；b：使用400∏MH₂O₂治疗的组；c：使用10∏M/ml可可豆级分+400∏MH₂O₂治疗的组；d：使用10∏M/ml可可豆壳级分+400∏MH₂O₂治疗的组)。

正如表1和2以及附图1和2中所示，经证实可可豆和可可豆壳的提取物和级分通过经抑制由H₂O₂产生的Cx43超磷酸化来抑制GJIC抑制而具有抗癌作用，其中H₂O₂是人体内公知的癌症助长剂和最强ROS之一，所述的GJIC抑制是包括肝癌在内的几种癌症癌发生中出现的病理现象。

实施例4：可可豆或可可豆壳的提取物和级分对癌细胞增殖(DNA合成)的抑制作用

正如下面进一步所解释的，通过使用³H胸苷吸收测定法(Marshall，E.S.等European J.Cancer，30A：1370-1376，1994)来检验可可豆和可可豆壳的提取物和级分对癌细胞DNA合成的抑制作用。所用癌细胞的实例是作为肝癌细胞的HepG2、作为胃癌细胞的SNU1和作为结肠癌细胞的SNUC2A。

在37℃和5％CO₂下的培养箱(Forma Scientific Co.，Marjetta，OH，USA)中分别将HepG2肝癌细胞、SNU1胃癌细胞、SNUC2A结肠癌细胞与10％FBS、100IU/ml青霉素和100∏g/ml链霉素一起在RPMI-1640培养基中培养。该培养基商购自GIBCO BRL(Grand Island，NY，U.S.)。将由此培养的癌细胞转入96孔平板，其中各自含有2×10⁴个细胞并加入获自参比实施例1-2的不同浓度的可可豆和可可豆壳提取物和级分且培养72小时。在回收上述细胞前6小时向各孔中加入1∏Ci的³H-胸苷(Sigma，St.Louis，MO，USA)。在培养完成后，通过使用回收仪器(Cambridge Scientific Inc.，cambridge，MA，USA)将细胞回收入玻璃纤维滤器(Brandel Inc.，Gaithersburg，MA，USA)。用液体闪烁计数器(Wallac，Turku，Finland)检测与3mL闪烁混合物溶液(Wallac，Turku，Finland)混合后回收细胞中导入的³H-胸苷。按照上述方法将整个过程重复3次。

分别与100、200、400、800∏g/mL浓度下的可可豆和可可豆壳提取物和级分一起培养癌细胞且然后进行³H胸苷吸收试验。计算可可豆和可可豆壳提取物和级分对癌细胞增殖的抑制率且列在下面的表3-8中。

正如下表3-8中所示，通过下列步骤获得的可可豆和可可豆壳提取物和级分对癌细胞增殖表现出极佳的抑制作用：通过溶剂提取制备可可豆和可可豆壳的提取物；将其装填入吸附树脂；用40％乙醇进行分级分离并用60％乙醇对残余物重新进行分级分离。可以将与对如上所述的GJIC抑制具有极佳抑制作用的可可豆和可可豆壳级分一致的可可豆和可可豆壳的这些级分用作对癌症发展具有预防和抑制用的极佳抗癌剂。

            表3可可豆提取物和级分对肝癌细胞增殖(DNA合成)的作用

类别          对肝癌细胞的抑制率(％) 100∏g/mL   200∏g/mL   400∏g/mL   800∏g/mL提取溶剂水 ＜20   ＜20   ＜20   ＜2050％甲醇 ＜20   ＜20   ＜20   6950％乙醇 ＜20   ＜20   37   8950％丙酮 ＜20   ＜20   52   93通过用50％丙酮将提取物吸附在基于苯乙烯的多孔树脂上进行的溶剂分级分离用20％乙醇获得的级分 ＜20   ＜20   ＜20   43用20％乙醇分级分离后用40％乙醇溶剂获得的级分 ＜20   ＜20   32   76用40％乙醇分级分离后用60％乙醇溶剂获得的级分 68   81   91   95用60％乙醇分级分离后用80％乙醇溶剂获得的级分 ＜20   ＜20   36   73用80％乙醇分级分离后用100％乙醇溶剂获得的级分 ＜20   ＜20   ＜20   32

             表4可可豆壳提取物和级分对肝癌细胞增殖(DNA合成)的作用

 类别                   对肝癌细胞的抑制率(％)   100∏g/mL   200∏g/mL   400∏g/mL   800∏g/mL提取溶剂水   ＜20   ＜20   ＜20   ＜2050％甲醇   ＜20   ＜20   ＜20   7950％乙醇   ＜20   ＜20   26   8950％丙酮   ＜20   ＜20   39   87通过用50％丙酮将提取物吸附在基于苯乙烯的多孔树脂上进行的溶剂分级分离用20％乙醇获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20   44用20％乙醇分级分离后用40％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20   71用40％乙醇分级分离后用60％乙醇溶剂获得的级分   41   79   87   92用60％乙醇分级分离后用80％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20   93用80％乙醇分级分离后用100％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20   33

              表5可可豆提取物和级分对胃癌细胞增殖(DNA合成)的作用

类别                   对胃癌细胞的抑制率(％) 100∏g/mL   200∏g/mL   400∏g/mL   800∏g/mL提取溶剂水 ＜20   ＜20   ＜20   ＜2050％甲醇 ＜20   ＜20   ＜20   5450％乙醇 ＜20   ＜20   53   8150％丙酮 ＜20   ＜20   49   86通过用50％丙酮将提取物吸附在基于苯乙烯的多孔树脂上进行的溶剂分级分离用20％乙醇获得的级分 ＜20   ＜20   ＜20   37用20％乙醇分级分离后用40％乙醇溶剂获得的级分 ＜20   ＜20   68   88用40％乙醇分级分离后用60％乙醇溶剂获得的级分 68   71   92   91用60％乙醇分级分离后用80％乙醇溶剂获得的级分 ＜20   ＜20   43   92用80％乙醇分级分离后用100％乙醇溶剂获得的级分 ＜20   ＜20   ＜20   41

              表6可可豆壳提取物和级分对胃癌细胞增殖(DNA合成)的作用

类别                 对胃癌细胞的抑制率(％) 100∏g/mL   200∏g/mL   400∏g/mL   800∏g/mL提取溶剂水 ＜20   ＜20   ＜20   ＜2050％甲醇 ＜20   ＜20   ＜20   6850％乙醇 ＜20   ＜20   72   7950％丙酮 ＜20   ＜20   61   85通过用50％丙酮将提取物吸附在基于苯乙烯的多孔树脂上进行的溶剂分级分离用20％乙醇获得的级分 ＜20   ＜20   ＜20   32用20％乙醇分级分离后用40％乙醇溶剂获得的级分 ＜20   ＜20   71   86用40％乙醇分级分离后用60％乙醇溶剂获得的级分 49   76   92   91用60％乙醇分级分离后用80％乙醇溶剂获得的级分 ＜20   ＜20   59   94用80％乙醇分级分离后用100％乙醇溶剂获得的级分 ＜20   ＜20   ＜20   30

                  表7可可豆提取物和级分对结肠癌细胞增殖(DNA合成)的作用

类别                   对结肠癌细胞的抑制率(％)   100∏g/mL   200∏g/mL   400∏g/mL   800∏g/mL提取溶剂水   ＜20   ＜20   ＜20   ＜2050％甲醇   ＜20   ＜20   ＜20   7150％乙醇   ＜20   ＜20   49   8350％丙酮   ＜20   ＜20   65   82通过用50％丙酮将提取物吸附在基于苯乙烯的多孔树脂上进行的溶剂分级分离用20％乙醇获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20   ＜20用20％乙醇分级分离后用40％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   52   79用40％乙醇分级分离后用60％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   66   89   92用60％乙醇分级分离后用80％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   45   92用80％乙醇分级分离后用100％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20   31

               表8可可豆壳提取物和级分对结肠癌细胞增殖(DNA合成)的作用

类别             对结肠癌细胞的抑制率(％)   100∏g/mL   200∏g/mL   400∏g/mL   800∏g/mL提取溶剂水   ＜20   ＜20   ＜20   ＜2050％甲醇   ＜20   ＜20   28   5450％乙醇   ＜20   ＜20   44   7550％丙酮   ＜20   ＜20   49   88通过用50％丙酮将提取物吸附在基于苯乙烯的多孔树脂上进行的溶剂分级分离用20％乙醇获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20   ＜20用20％乙醇分级分离后用40％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   49   57用40％乙醇分级分离后用60％乙醇溶剂获得的级分   32   61   86   91用60％乙醇分级分离后用80％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   43   88用80％乙醇分级分离后用100％乙醇溶剂获得的级分   ＜20   ＜20   ＜20   ＜20

正如附图5-7中所示，肝癌、胃癌和结肠癌的细胞的增殖率依赖于可可豆和可可豆壳级分的浓度。因此，通过下列步骤获得的可可豆和可可豆壳级分对癌症发展表现出极佳的抑制作用：通过溶剂提取制备可可豆和可可豆壳的提取物；将其装填入吸附树脂；用40％乙醇进行分级分离并用60％乙醇对残余物重新进行分级分离。

实施例5：片剂的制备

活性组分      10g

乳糖          70g

结晶纤维素    15g

硬脂酸镁    5g

总计        100g

通过粉碎成小碎块且将上述组分混合且然后通过直接压片法制备。制备含有总量为100mg的各片且每片中活性组分的量为10mg。

实施例6：粉剂的制备

活性组分    10g

玉米淀粉    50g

羧基纤维素  40g

总计        100g

通过粉碎成小碎块且将上述组分混合并制备成粉剂。将100克粉末装填入每粒软胶囊而制成最终的胶囊制剂。

实施例7：毒性试验

如下对可可豆和可可豆壳的提取物和级分测试毒性：将上述可可豆和可可豆壳的提取物和级分溶于50％乙醇水溶液、用水稀释且然后以1g/kg的浓度对大鼠给药并观察7天。结果证明全部大鼠均存活。

实施例8

通过使用包括20wt％胶质软糖基质、76.9wt％的糖、1wt％食用香料、2wt％的水和0.1wt％获自上述实施例的可可豆和可可豆壳级分的组合物、按照常规方法生产口香糖。

实施例9

通过使用包括60wt％糖、39.8wt％淀粉浆、0.1wt％食用香料和0.1wt％获自上述实施例的可可豆和可可豆壳级分的组合物、按照常规方法生产糖果。

实施例10

通过使用包括50wt％糖醇、49.8wt％麦芽糖、0.1wt％食用香料和0.1wt％获自上述实施例的可可豆和可可豆壳级分的组合物、按照常规方法生产口香糖。

实施例11

通过使用包括下列成分的的组合物、按照常规方法生产饼干：25.59wt％的一级筋力弱的面粉、22.22wt％的一级中等面粉、4.80wt％的糖、0.73wt％的盐、0.78wt％的葡萄糖、11.78wt％的棕榈起酥、1.54wt％的碳酸氢铵、0.17wt％的碳酸氢钠、0.16wt％的焦亚硫酸钠、1.45wt％的米粉、0.0001wt％的维生素B₁、0.0001wt％的维生素B₂、0.04wt％的奶粉、20.6998wt％的水、1.16wt％的全脂奶粉、0.29wt％的干乳粉替代品、0.03wt％的磷酸二氢钙、0.29wt％的雾化盐、7.27wt％的雾化乳和1wt％的获自上述实施例的可可豆和可可豆壳级分。

实施例12

通过使用包括下列成分的组合物、按照常规方法生产饮料：0.26wt％的蜂蜜、0.0002wt％的硫辛酸酰胺、0.0004wt％的烟酸酰胺、0.0001wt％的核黄素-5’-磷酸钠、0.0001wt％的HCl吡哆素、0.001wt％的肌醇、0.002wt％的原酸、98.7362wt％的水和1wt％的获自上述实施例的可可豆和可可豆壳级分。

实施例13

通过使用包括下列成分的组合物、按照常规方法生产饮料：3.5wt％的水果提取物、4.8wt％的果泥、7.78wt％的糖、0.11wt％的柠檬酸、82.71wt％的纯水和1wt％的获自上述实施例的可可豆和可可豆壳级分。

实施例14

通过使用包括下列成分的组合物、按照常规方法生产香肠：65.18wt％的猪肉、25wt％的鸡肉、3.5wt％的淀粉、1.7wt％的大豆蛋白、1.62wt％的盐、0.5wt％的葡萄糖；1.5wt％的甘油和1wt％的获自上述实施例的可可豆和可可豆壳级分。

实施例15

通过使用包括下列成分的组合物、按照常规方法生产片型的保健食品：55wt％的spirurina、10wt％的胍尔豆胶的酶降解产品、0.01wt％的盐酸维生素B₁、0.01wt％的盐酸维生素B₆、0.23wt％的DL-甲硫氨酸、0.7wt％的硬脂酸镁；22.2wt％的乳糖、1.85wt％的玉米淀粉和10wt％的获自上述实施例的可可豆和可可豆壳级分。

实施例16

通过使用包括下列成分的组合物、按照常规方法生产胶囊型的保健食品：11.26wt％的壳寡糖、0.2wt％的大蒜粉、0.2wt％的银杏提取物粉、0.9wt％的E-胡萝卜素(30％混悬液)、1.2wt％的A-生育酚、1.2wt％的卵磷脂；4.5wt％的精制棕榈油、1.6wt％的黄蜂蜡、18.994wt％的大豆油、37.83wt％的明胶、16.51wt％的甘油、0.09wt％的乙基香草醛、0.076wt％的二氧化钛、0.44wt％的食用色素和10wt％的获自上述实施例的可可豆和可可豆壳级分。

如上所述，可以将获自上述实施例的可可豆和可可豆壳提取物和级分看作食品等同物且由此可以安全地作为抗癌剂给予而不再使用另外除去毒性的纯化步骤。此外，通过单纯分离方法生产可可豆和可可豆壳提取物和级分制剂的方法能够比那些常规抗癌剂的生产方法降低单位生产成本；特别从经济的观点来看，已经作为废物丢弃的大量可可豆壳的再循环利用可能极有价值。