公开/公告号CN1444598A
专利类型发明专利
公开/公告日2003-09-24
原文格式PDF
申请/专利权人 纽约大学;
申请/专利号CN01810005.8
申请日2001-05-22
分类号C07K14/47;A61K38/17;A61P25/28;C07K16/18;A61K39/395;
代理机构上海专利商标事务所;
代理人徐迅
地址 美国纽约州
入库时间 2023-12-17 15:01:15
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2009-07-22
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
2006-04-05
授权
授权
2003-12-17
实质审查的生效
实质审查的生效
2003-09-24
公开
公开
相关文献的交叉参考
本申请要求2000年5月22日提交的美国临时申请60/016,233的优先权，本文将该申请的全部内容纳入作为参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及β淀粉状肽的领域，和诱导针对β淀粉状肽和淀粉状蛋白沉积的免疫反应的方法。
背景技术的描述
阿尔茨海默氏病(AD)是成年人中最常见的老年性痴呆形式(Soto等，1994)，该病在美国是导致死亡的第4大杀手。65岁以上的人群中大约有10％的人受到这种渐进性退化疾病的影响，这种疾病表现为记忆丧失、混乱以及各种各样的认知障碍。从神经病理学的角度来说，AD的特征在于4种主要的损害：a)神经原纤维缠结(NFT)在神经元内和胞质中的沉积；b)实质淀粉状蛋白沉积，称为神经炎斑；c)脑血管淀粉样变性；和d)突触和神经元损失。AD的一个主要事件是淀粉状蛋白作为不溶的纤维物质的沉积(淀粉状蛋白产生)，导致细胞外的神经炎斑和大脑血管壁周围的沉积。神经炎斑和嗜刚果的(congophilic)血管病的主要构成是β淀粉状蛋白(Aβ)，虽然这些沉积还含有其它的蛋白质，如糖胺聚糖和载脂蛋白。
Aβ是4.1-4.3kDa的疏水肽，它在第21号染色体上编码，作为较长的淀粉状蛋白前体蛋白APP的一部分(Muller-Hill等，1989)。APP以一条前导序列(信号肽)开始，接着是富含半胱氨酸的区域、富含酸性氨基酸的区域、蛋白酶抑制子基元、推定的N-糖基化区域、跨膜区域，最后是小的胞质区。Aβ序列从细胞外侧接近膜的位置开始，结束于膜内。Aβ的2/3在细胞外空间，1/3被埋在膜中(Kang等，1987；Dyrks等，1988)。几种证据表明，淀粉状蛋白在AD的早期发病中可能起主要作用。
淀粉状蛋白可能在AD的早期发病中起重要作用的证据主要来源于对受家族式AD(FAD)或唐氏综合症影响的个体的研究。唐氏综合症患者具有3个拷贝的APP基因，他们在小的时候发展了AD神经病理学(Wisniewski等，1985)。对家族的遗传性AD进行的遗传学分析揭示，除了在早老素1号和2号基因中有突变外，在第21号染色体上接近或在Aβ序列中也有突变(Forsell等，1995)。而且，据报道，表达高水平的人突变体APP的转基因小鼠在大脑中逐渐地发展淀粉样变性(Games等，1995)。这些发现似乎暗示在AD的病理生理学中的淀粉状蛋白产生。此外，Aβ原纤维在神经元培养物中是毒性的(Yankner等，1989)，并且，在注射到动物大脑内时，在一定程度上也是有毒性的(Sigurdsson等，1996和1997)。
此外，几个其它方面的证据也表明，Aβ的沉积是AD发病中的主要触发事件，它接着导致了NFT形成和神经元损失。AD中的淀粉状蛋白沉积与所有其它大脑淀粉样变性(如朊病毒蛋白相关的淀粉样变性)以及全身性淀粉样变性具有许多特征。这些特征是：1)相对不溶解；2)具有高的β-折叠次级结构，这与它们倾向于聚集或聚合相关；3)在超微结构上，这些沉积物主要是原纤维的；4)存在某些淀粉状蛋白相关的蛋白质，如淀粉状蛋白P成分、蛋白聚糖和载脂蛋白；5)在刚果红染色后，在偏振光下观察时，沉积物显示出特征性的苹果绿双折射。
还发现AD大脑中形成淀粉状蛋白沉积的相同肽的可溶形式(sAβ)，这种形式通常在人体液中环流(Seubert等，1992；Shoji等，1992)。Zlokovic等(1994)报道，血脑屏障(BBB)具有控制脑血管隔离和运输环流的sAβ的能力，并且将sAβ与载脂蛋白J(apoJ)的复合物灌注给豚鼠时，sAβ跨BBB的运输明显增加了。在正常的脑脊髓液(CSF)中发现sAβ-apoJ复合物(Ghiso等，1994)，并且，体内研究表明，sAβ在正常的人血浆中与apoJ一起作为高密度脂蛋白(HDL)的成分而被运输(Koudinov等，1994)。Zlokovic等(1996)还报道，当apoJ受体gp330被阻断时，sAβ的跨BBB运输几乎被消除。可认为sAβ向不溶的原纤维的转化是由2-3氨基酸较长可溶形式的构象改变引起的。已建议淀粉状蛋白的形成是成核依赖性的现象，其中最初不溶的“晶种”使淀粉状蛋白选择性沉积(Jarret等，1993)。
含有Aβ的1-40或1-42序列和较短的衍生物的肽可在没有其它蛋白质的情况下形成淀粉状蛋白样原纤维，这表明形成淀粉状蛋白残基的潜力主要在Aβ的结构中。通过改变该肽的序列，分析了Aβ的主要结构及其形成淀粉状蛋白样原纤维的能力之间的关系。在内部Aβ疏水区域(第17-21个氨基酸)中用亲水的残基取代疏水残基，削弱了原纤维的形成(Hilbich等，1992)，表明Aβ的装配部分是由疏水相互作用驱动的。实际上，含有两个或三个额外的疏水C末端残基的较大的Aβ肽(Aβ1-42/43)更易产生淀粉状蛋白(Jarrett等，1993)。第二，Aβ肽采用的构象对于淀粉状蛋白形成是关键性的。在不同的pH、浓度和溶剂中培育的Aβ肽可能具有主要的α-螺旋、随机的螺旋，或者β-折叠次级结构(Barrow等，1992；Burdick等，1992；和Zagorski等，1992)。具有α-螺旋或随机螺旋结构的Aβ肽缓慢地聚集；具有β-折叠构象的Aβ迅速地聚集(Zagorski等，1992；Soto等，1995；Soto等，1996)。通过比较其它淀粉状蛋白源性蛋白的序列，也表明了疏水性和β-折叠次级结构对淀粉状蛋白形成的重要性。
采用浊度测量对Aβ聚集的分析表明，Aβ的C末端区域长度通过加速核的形成影响Aβ装配的速率(Jarrett等，1993)。因而，Aβ的C末端区域可调节原纤维生成。但是，Aβ淀粉状蛋白形成的体外调节子，如金属阳离子(Zn、Al)(Bush等，1994；和Exley等，1993)、硫酸肝素蛋白聚糖和载脂蛋白E(Strittmatter等，1993)与Aβ的12-28区域相互作用。而且，Aβ区域的N末端中APP基因的突变产生更易于产生原纤维的类似物(Soto等，1995；Wisniewski等，1991)。最后，当Aβ的C末端区域在水溶液中总是β-链结构时，环境参数决定了AβN末端区域中另一构象的存在(Barrow等，1992；Soto等，1995；Burdick等，1992)。因此，该N末端可以是抑制原始的随机螺旋变为β-折叠构象的潜在的靶位点。
使用合成肽进行的研究获得的图表明，Aβ淀粉状蛋白形成依赖于采用反平行β-折叠构象的Aβ肽的疏水性相互作用，以及N末端和C末端区域对于淀粉状蛋白形成都是重要的。原纤维形成的基本单元似乎是采用反平行β-折叠的构象子，该构象子由包括该肽的10-24区域和29-40/42区域的链组成(Soto等，1994)。淀粉状蛋白形成由几种单体的β-链间的分子间相互作用进行，形成原纤维的β-交叉构象的寡聚的β-折叠结构前体。Wood等(1995)报道，将阻断聚集的脯氨酸插入淀粉状蛋白和肽中，以阻止这些蛋白质和肽的聚集。在这种方式中，这些作者建议，为避免聚集的问题，可设计新颖的蛋白质作为针对它们产生的屏障，而不影响天然蛋白质的结构或功能。从而，Wood等通过将阻断聚集的脯氨酸插入这些新颖的肽中，寻求在重组蛋白质生产和纯化期间产生不聚集的新颖的蛋白质。
目前，对减少患者的淀粉状蛋白负荷或阻止AD中的淀粉状蛋白沉积还没有治愈或有效的治疗，即使是AD的明确诊断，也仅仅是在大脑组织死后对标记神经质纤维缠结和神经炎斑的检测中进行的。但是，有越来越多的出版物提出了治疗阿尔茨海默氏病的策略。淀粉状蛋白相关的治疗策略包括使用影响淀粉状蛋白-β前体蛋白(APP，Dovey等，2001)的加工的化合物，该化合物干扰原纤维的形成，或促进原纤维的分解(Soto等，1998；Sigurdsson等，2000；Findeis，2000)。
硫酸肝素(糖胺聚糖)或硫酸肝素蛋白聚糖——基底膜聚糖已被鉴别为所有淀粉状蛋白的成分，并且和炎症相关的淀粉状蛋白诱导的最早期阶段有牵连。Kisilevsky等(1995)描述了使用低分子量(135-1,000Da)的阴离子磺酸盐或硫酸盐化合物，这些化合物干扰硫酸肝素与炎症相关的淀粉状蛋白前体和AD的β-肽的相互作用。硫酸肝素特别影响可溶的淀粉状蛋白前体(SAA2)采取增加了淀粉状蛋白的蛋白质折叠模式的β-折叠结构特征。这些阴离子磺酸盐或硫酸盐化合物抑制肝素加速的阿尔茨海默氏病的Aβ原纤维的形成，并且使用电子显微镜可监测到它们能在体外分解预成形的原纤维。而且，当以相对高的浓度(20或50mM)口服时，在急性和慢性模型中，这些化合物基本上在体内阻止了鼠脾炎症相关的淀粉状蛋白进展。但是，最有效的化合物聚-(乙烯基磺酸酯)则是剧毒的。
已在临床上观察到蒽环类4′-碘-4′-脱氧-阿霉素(IDOX)能诱导免疫球蛋白轻链淀粉样变性(AL)患者再吸收淀粉状蛋白。Merlini等(1995)阐述了它的作用机制。已发现IDOX通过疏水相互作用强烈地与5种不同的测试淀粉状蛋白原纤维中的两种不同的结合位点(Scatchard分析)结合，抑制原纤维生成以及随后的淀粉状蛋白沉积的体外形成。预先培育IDOX与淀粉状蛋白增强因子(AEF)也可减少淀粉状蛋白沉积的形成。IDOX对体内淀粉状蛋白沉积的特异性靶向在急性鼠模型中得到证实。这种结合与硫酸肝素结合不同，不同之处在于用肝素酶从抽提的淀粉状蛋白原纤维中除去糖胺聚糖并没有改变IDOX结合。所有的淀粉状蛋白的共有结构性特征是β-折叠构象。但是，IDOX不与天然的淀粉状蛋白前体轻链结合，这表明单独的β-折叠骨架并不足以形成用于IDOX结合的最佳结构，要产生最大的IDOX结合，需要原纤维交联-β-折叠四级结构。还已发现。从脾中抽提得到的IDOX的量与淀粉状蛋白负荷相关，而与循环的血清前体淀粉状蛋白水平不相关。但是，IDOX也是剧毒的。
在美国专利第5,385,915号和WO 9427603中也已研究了通过抑制或调节APP控制蛋白的磷酸化而对淀粉状蛋白前体蛋白(APP)进行的调节和加工。在AU9338358和EP 569777中也已经检测了对APP进行蛋白水解加工，使其变成AD的成核形式。WO 95046477公开偶联于载体的组合物X-X-N-X的合成肽(SEQ IDNO：69)，其中X是阳离子性氨基酸，N是中性氨基酸，该肽抑制Aβ与糖胺聚糖的结合。在WO 9203474中公开了含有抑制α-1-抗胰凝乳蛋白酶与Aβ偶联的阿尔茨海默氏的Aβ序列的肽。
从本发明者的实验室中进行的实验来看，WO 96/39834公开了参与淀粉状蛋白样沉积形成的、能与蛋白质或肽(如Aβ)上的疏水部分相互作用的肽，可用于抑制和从结构上阻断这些蛋白质和肽异常折叠成淀粉状蛋白或淀粉状蛋白样沉积物。阻断Aβ异常折叠成淀粉状蛋白沉积物的肽具有疏水部分，该部分含有β-折叠断裂氨基酸残基，如脯氨酸，这些残基减少该肽采取β-折叠构象的倾向。本发明者的实验室在后期的报道中已证明，与Aβ具有序列同源性的非淀粉状蛋白源性肽LeuProPhePheAsp(SEQ ID NO：14)阻断原纤维的形成(Soto等，1998)，并在体内诱导原纤维Aβ沉积物的分解(Sigurdsson等，2000)。
最近，Pallitto等(1999)在设计抗-β折叠肽或Aβ原纤维生成抑制物时，提出将赖氨酸残基连接到肽上，所述抑制物具有Aβ-结合识别序列和六聚体赖氨酸聚集中断元件。
体外研究显示，针对Aβ的N末端区域产生的单克隆抗体可解集Aβ原纤维，维持Aβ的可溶性，并阻止细胞培养物中的Aβ毒性(Solomon等，1996和1997)。
WO 96/25435公开了使用单克隆抗体的可能性，该抗体在阻止Aβ1-42的聚集中，对Aβ1-42肽而非Aβ1-43肽的游离C末端是端特异性的。给予这种Aβ端特异性单克隆抗体，其结果进一步揭示这种抗体与Aβ1-42的游离C末端残基相互作用，从而干扰并中断了可能导致AD发病的聚集。
WO 98/44955采取一种不同的方法来避免与重复给予药剂相关的问题，公开了一种通过对淀粉状β肽具有端特异性的重组抗体在大脑中的稳定的异位表达，阻止阿尔茨海默氏病的发病或抑制阿尔茨海默氏病发展的方法。
最近，Schenk等(1999)证明，用淀粉状-β进行免疫减弱了PDAPP转基因小鼠中的阿尔茨海默氏病样病理学，这种小鼠用作淀粉状蛋白-β沉积作用和阿尔茨海默氏病样神经病理学的动物模型。他们报道，在年轻的动物发生阿尔茨海默氏病型神经病理前，先对其进行免疫，可基本上阻止β-淀粉状蛋白斑形成的发展、神经炎性营养不良和星形胶质细胞生成(astrogliosis)，而对于年长动物，在其发生阿尔茨海默氏病型神经病理后才进行治疗，结果观察到这些神经病理的程度和进展得到减少。这种结果被认为是由抗体介导的，因为外周给予的针对Aβ的抗体已显示出能减少大脑中的实质淀粉状蛋白负荷(Bard等，2000)。此外，用新制的溶液化Aβ1-40鼻内免疫，可减少大脑的淀粉状蛋白负荷(Weiner等，2000)。最近的两项研究证明，疫苗诱导的大脑中淀粉状蛋白沉积物的减少导致认知上的改善(Morgan等，2000；Janus等，2000)。
虽然Schenk等报道的结果提供了使用免疫调节作为治疗阿尔茨海默氏病的一般方法的希望，但是根据他们的提法，用完整的淀粉状蛋白-β进行免疫出现了使其不适用于人的问题。首先，Schenk等的试验使用了表达突变的人蛋白质的转基因小鼠，该蛋白质对于小鼠来说是外源的，但在小鼠中不产生生理学功能(小鼠和人的Aβ肽序列有很大差异)。但是，对于人，前体蛋白质(βAPP)是一种具有正常功能的外源蛋白质。因此，在具有人Aβ肽的人中采用这种方法，其结果很有可能会导致自身免疫疾病或者可能使问题变得更糟糕而非更好的疾病的发展。其次，B.Zlokovic(1997)和本发明者已得出证明Aβ肽、Aβ1-42和Aβ1-40可通过实验动物的血脑屏障的结果。因此，对于人，可以预见Schenk等用来免疫的Aβ1-42可通过血脑屏障，并在任何已存在的淀粉状蛋白斑上共沉积，从而导致毒性增加，并且可能事实上促进斑的形成。这在用于研究AD的PDAPP转基因小鼠模型中并未产生，因为人Aβ1-42对于小鼠的毒性较小；即使在人Aβ1-42有大量的沉积，转基因小鼠中也没有一只显示出有明显的神经元损失。再次，Schenk等使用毒性佐剂来诱导免疫应答。
本文所引用的任何文献都不能认为是本发明者承认这些文献是相关的现有技术，或者认为它们对本申请的任何权利要求的专利性起实质性作用。关于内容的任何申明或者任何文献的日期都是以申请人在提交时所获得的信息为基础，本发明者对这样一种申明的正确性不负责任。
发明概要
本发明提供一种合成的免疫源性的但非淀粉状蛋白源性的肽，该肽与淀粉状蛋白β同源，它可用于诱导针对淀粉状蛋白β肽和淀粉状蛋白沉积物的免疫应答，并可克服或避免现有技术中遇到的麻烦和问题。
与淀粉状蛋白β同源的该合成的免疫源性而非淀粉状蛋白源性的肽包括Aβ1-42(SEQ ID NO：1)的前面30个氨基酸残基，较佳还包括4-10个Lys或Asp残基的N末端和/或C末端片段，其中，第17-21个残基中有0、1或2个被Lys、Asp或Glu取代。
本发明还提供一种共轭物，其中，所述肽与免疫刺激聚合物分子交联。
本发明的另一方面涉及免疫组合物/疫苗，该组合物/疫苗含有免疫有效量的合成性非淀粉状蛋白源性但与淀粉状蛋白β同源的免疫源性的肽，或者一种共轭物。
本发明的又一方面涉及一种免疫疗法，该方法诱导针对淀粉状蛋白β肽和淀粉状蛋白沉积物的免疫应答。
本发明还有一方面涉及一类分子，这类分子包含针对本发明的合成性非淀粉状蛋白源性但为免疫源性的肽产生的抗体的抗原结合部分。还提供含有这种结合肽的分子的药物组合物，和减少淀粉状蛋白原纤维和沉积物的形成的方法。
附图的简要说明
图1显示硫黄素T荧光试验的结果。在37℃培育后，在体外测量Aβ1-42、Aβ1-30-NH2和K6Aβ1-30-NH2(SEQ ID NO：6)的原纤维形成。K6Aβ1-30-NH2是在任何时间点上都没有形成原纤维的唯一的肽。
图2A和2B显示，由MTT试验测得Aβ40和Aβ42对培养物中的人成神经细胞瘤细胞(SK-N-SH)有毒性，而2天内K6Aβ30-NH2则没有影响(图2A)，在第6天则是稍微地有营养(图2B)。与VEH组(单一ANOVA)相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图3A-3D显示Tg对照小鼠(图3A)和K6Aβ1-30处理的Tg小鼠(图3B)的海马和皮层的经针对Aβ用6E10染色的冠状部分(×50，原始倍数)。图3C和3D是用识别小胶质细胞的白介素-1以及Aβ双重染色的邻近部分(×100)。注意到与对照小鼠相比(图3A，3C)，免疫小鼠中淀粉状蛋白负荷减少(图3B)，相同小鼠中围绕Aβ斑的分支小胶质细胞缺乏(图3D)。图3A和3C中的杆代表100μm。缩写词：hip＝海马；cx＝皮层；cc＝胼胝体。
图4A-4C显示在用K6Aβ-30-NH2治疗7个月后，皮层(图4A)和海马(图4B)中淀粉状蛋白负荷(6E10)的减少。皮层中的淀粉状蛋白负荷减少89％(*p＝0.0002，t＝测试；每组n＝4)，在海马中的淀粉状蛋白负荷减少81％(*p＜0.0001)。在接种小鼠的大脑内可溶的Aβ1-42的水平(图4C)减少了57％(*p＝0.0019)。
图5显示硫黄素T荧光试验的结果。在37℃培育后，在体外测量Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-30-NH2、Aβ1-30K6、Aβ1-30-NH2(EE18，19)和Aβ1-30-NH2(DD18，19)的原纤维的形成。
图6A和6B显示MTT细胞毒性试验的结果。在处理人成神经纤维瘤细胞(SK-N-SH)2天(图6A)和6天(图6B)后，测定Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-30-NH2、K6Aβ1-30-NH2、Aβ1-30K6、Aβ1-30-NH2(EE18，19)和Aβ1-30-NH2(DD18，19)的神经毒性。与VEH(单一ANOVA)相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
本发明的详细描述
本发明已设计与淀粉状蛋白β(Aβ)同源的合成性非淀粉状蛋白源性肽，这些肽不仅具有减少其采取作为抗原来源的β-折叠构象的能力，而且对人产生任何毒性影响的风险还非常低。通过在免疫组合物中使用这些合成性非淀粉状蛋白源性肽或其共轭物，本发明提供一种给予免疫系统Aβ肽和淀粉状蛋白沉积物作为靶标的方法。因此，本发明的一种重要目标是提供一种免疫方法，该方法使与注射的Aβ肽相关的毒性减少到最小，而使针对Aβ肽和淀粉状蛋白沉积物的免疫反应增加到最大。
本发明的与Aβ同源的合成性非淀粉状蛋白源性但为免疫源性的肽被设计为具有减少原纤维产生的潜力，而维持Aβ肽的两个主要免疫原性位点，这两个位点是Aβ1-42上的第1-11个残基和第22-28个残基，这两个位点是以Jameson等(1988)的抗原指数和本发明者在实验室中获得的结果/观察为基础。因此，本发明合成性非淀粉状蛋白源性肽是以Aβ1-42的前面30个氨基酸残基(SEQ ID NO：1)为基础而设计的，其中在SEQ ID NO：1的第17-21位置上的一个或两个疏水残基被带电的残基Lys、Asp或Glu取代。Aβ的前面30个残基缺乏Aβ1-42的疏水C末端，但保留了对应于SEQ ID NO：1的第1-11个残基和第22-28个残基的两个免疫原性位点。
使用其采取β-折叠构象的可能性低的疏水残基Lys、Asp或Glu改变Aβ1-30(SEQ ID NO：1)的位置17-21上的一个或两个残基，可大大地减少该肽的原纤维产生潜力。SEQ ID NO：12和13是这种修改的Aβ1-30的两个例子。此外，在本发明合成肽的N末端和/或C末端上存在一系列Lys或Asp残基可进一步增强免疫原性(Werdelin，1981)，并减少该合成肽采取β-折叠构象以及形成淀粉状蛋白原纤维/沉积物的倾向。最近，Pallitto等(1999)已提出，在抗-β-折叠肽或Aβ原纤维生成抑制物的设计中，使赖氨酸残基与长4-8个残基的Aβ肽连接，但是，它们并未提出使用这种肽作为免疫原。先前已使用多阳离子氨基酸来增强胞吞/吞噬过程中蛋白质向细胞中的运输(Martinez-Fong等，1994；Wang等，1989；Shen等，1985；Peterson等，1984；Deierkauf等，1997；DiNicola等，2000)。Buschle等(1997)报道，多阳离子氨基酸增强了抗原呈递细胞对肽的摄取，从而启动免疫应答。他们还报道，虽然由多赖氨酸介导的肽摄取似乎是由于细胞膜的至少瞬时通透性的缘故，但是多精氨酸存在下的肽传送可能依赖于胞吞过程。
本发明与Aβ同源的合成性免疫源性但非淀粉状蛋白源性肽由下式表示，该肽并不是Aβ原纤维生成的肽抑制子：
(A)m-(N-Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5-C)n-(B)p式中，
m是0、4、5、6、7、8、9或10；
p是0、4、5、6、7、8、9或10；
A是Lys或Asp；
B是Lys或Asp；
n是1或2；
N是SEQ ID NO：1的第1-16个残基；
C是SEQ ID NO：1的第22-30个残基；
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5分别是Leu、Val、Phe、Phe和Ala，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5中有0个、1个或2个被Lys、Asp或Glu替换；
当有0个残基被替换时，m或p之一或两种不是0。
上述式中表示的肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2-5。
基本的30个氨基酸序列(Aβ1-30)其中被替换的第17-21个残基中有0个、1个或2个由上述式子中的N-Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5-C表示。在本发明的合成肽中，这30个氨基酸残基片段可以重复(n是2)。较佳的是，在该肽的N末端和/或C末端存在长4-10个残基的多赖氨酸或多天冬氨酸片段。当在Aβ1-30的第17-21个残基中没有残基被替换时，在该肽的N末端和/或C末端具有长4-10个残基的多赖氨酸或多天冬氨酸片段。如果多赖氨酸或多天冬氨酸片段没有出现在C末端，则较佳酰胺化该C末端，如优选实施例SEQ ID NO：6。SEQ ID NO：11是在其C末端具有长4-10个残基的多赖氨酸或多天冬氨酸的未替换的Aβ1-30肽的实施例。
此外，当m是0，且在N末端缺乏长4-10个残基的多赖氨酸或多天冬氨酸片段时，较佳的是，将该肽的C末端酰胺化，以减少该肽的C末端电荷降低Aβ的第22-28个残基片段的免疫原性的可能性，或者使该C末端具有长4-10个残基的多赖氨酸或多天冬氨酸片段。本发明肽的另一优选的实施例如下：
当m不是0时，p是0；
当p不是0时，m是0；和
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5分别是Leu、Val、Phe、Phe和Ala，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4和Xaa5中有1个或2个被Lys、Asp或Glu替换(SEQ ID NO：2-5。
本领域熟练的技术人员还将理解，也可使用本发明合成肽的肽拟态，其中肽键被非肽键取代。
本领域熟练的技术人员已周知，可采用常规的技术，如圆二色性光谱、FT-IR和电子显微镜测量肽的悬浮液，测量肽的β-折叠构象，从而可容易地测定本发明合成肽的减少的原纤维产生潜力。
还已周知的是，免疫原必须与主要组织相容性(MHC)抗原II结合，以激活有效的抗体应答。由抗原呈递细胞(APC)产生的MHC-II抗体以序列特异性的方式与免疫原中的T细胞表位结合。这种MHC-II-免疫原复合物被CD4+淋巴细胞(Th细胞)识别，该淋巴细胞使能识别从呈递的免疫原得到的B细胞表位的特异性B细胞的增殖，以及使这些B细胞生产B细胞表位特异的抗体。进一步增加本发明合成肽的免疫原性的另一方法是，与免疫刺激性聚合物分子形成共轭物，这些分子如甘露聚糖(甘露糖的聚合物)、葡聚糖(β1-2葡萄糖的聚合物)、三棕榈酰基-S-甘油半胱氨酸，以及目前许可的在人中用于疫苗的肽。上述许可用在疫苗中的这些肽提供了由有力的免疫原产生强的T辅助细胞(Th)表位，所述免疫原如破伤风毒素、百日咳毒素、麻疹病毒蛋白F和B型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)。选择用于与该合成肽结合的Th表位较佳能在表达不同MHC单元型的大量个体中引起T辅助细胞应答。这些表位在多样种群的许多不同个体中起作用，并被认为是混杂的Th表位。混杂的Th表位提供遗传学不同种群的大多数成员中引起有效的抗体应答的优点。
而且，不仅可根据本发明的合成肽结合/交联的T辅助细胞表位在给定种群的大多数成员中引起免疫应答的能力，而且引起记忆/回忆反应的能力，而有利地选择它们。当哺乳动物是人时，接受本发明的合成肽的免疫治疗的大多数人受试者/患者很有可能已经儿科疫苗(即，麻疹+流行性腮腺炎+风疹以及白喉+百日咳+破伤风疫苗)免疫，也可能经B型肝炎病毒疫苗免疫。因此，这些患者以前已经暴露于儿科疫苗中存在的至少一种Th表位中。先前使用标准的疫苗免疫而暴露于Th表位应建立Th细胞克隆，这种克隆可在给予所述合成肽后立即增殖(即回忆反应)，从而刺激针对Aβ肽和淀粉状蛋白沉积物的快速B细胞应答。
虽然可与本发明的合成肽一起使用的Th表位是混杂的，但它们并不包括所有的表位。这一特征说明，Th表位与表达不同MHC抗原的远系交配种群的大部分(50-90％)反应，而非该种群的所有成员。为了给本发明的合成性非淀粉状蛋白源性肽提供一种可理解的、方法通用的免疫反应性，可制备具有与合成肽交联的不同Th表位的的共轭物的混合物。例如，具有从破伤风毒素和百日咳毒素、麻疹病毒蛋白F和HbaAg的混杂的Th表位的四种共轭物的组合可能会更有效。
与本发明合成性非淀粉状蛋白源性肽交联的免疫刺激性肽中的Th表位包括B型肝炎表面抗原T辅助细胞表位、百日咳毒素T辅助细胞表位、破伤风毒素T辅助细胞表位、麻疹病毒F蛋白T辅助细胞表位、沙眼衣原体(Chlamydia trachomitis)主要外膜蛋白T辅助细胞表位、白喉毒素T辅助细胞表位、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)环子孢子蛋白T辅助细胞表位、曼森氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)丙糖磷酸异构酶T辅助细胞表位、大肠杆菌(Escherichia coli)TraT T辅助细胞表位，这些表位公开在美国专利第5,843,446号中，本文将该文的全部公开内容纳入作为参考。
本领域熟练的技术人员将理解，用来修饰本发明肽的术语“合成的”指该肽是化学合成的，或者是仅在宿主生物体从其天然状态被遗传转化成生产该肽时，在生物体中产生的。可采用化学合成的方法制得本发明的合成肽，这些方法对于本领域普通的技术人员来说是周知的。因此，可采用具有t-Boc或F-moc化学的固相合成的自动Merrifield技术，在肽合成仪(如，应用生物系统肽合成仪，AppliedBiosystems Peptide Synthesizer)上合成合成肽。
或者，可采用已知的重组DNA技术合成较长的肽。关于NDA技术的任何标准手册都提供了详细的生产本发明合成肽的方案。为了构建编码本发明合成肽的核苷酸序列，将氨基酸序列反转录到核酸序列中，并且较佳是在表达该肽的生物体中使用最佳的密码子用法。接着，制备合成基因，通常通过合成重叠寡核苷酸进行，该核苷酸编码该肽，并且如果需要，该核苷酸还可编码任何调节元件。将该合成基因插入合适的克隆载体中，获得重组克隆，并将其表征。然后在适合于选择的表达系统和宿主的合适条件下表达本发明的合成肽，采用标准方法纯化所需的肽，并将其表征。
也可从耶尔森氏菌属的侵染素蛋白获得可与本发明的合成性非淀粉状蛋白源性肽交联的免疫刺激性肽。致病菌耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)的侵染素是介导该细菌进入哺乳动物细胞的外膜蛋白(Isberg等，1990)。已证明，该菌要侵入培育的哺乳动物细胞需要耶尔森氏菌属侵染素分子和该培育细胞上存在的整联蛋白β1族的几个种类之间的相互作用(Tran Van Nhieu等，1991)。由于T淋巴细胞富含β1整联蛋白(尤其是激活的免疫或记忆T细胞)，已对人T细胞上的侵染素的影响进行了研究(Brett等，1993)。据认为，整联蛋白通过与细胞外的基质蛋白(包括纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白)相互作用，促进免疫T细胞移出血管，通过结缔组织到达抗原激发的位点。已发现，侵染素分子的羧基末端非特异性促分裂原——抗-CD3抗体存在的对天然的人CD4+是共刺激性的，引起了细胞因子的明显增殖和表达。也已鉴别了与β1整联蛋白相互作用以引起这种刺激的特异性侵染素区域(Brett等，1993)。因为证明与这个区域有关的T细胞共刺激特征的缘故，所以可将它与本发明的合成肽交联，以增强免疫原性。
革兰氏阴性菌的许多外膜蛋白是被脂质修饰的，并且是非常免疫原性的。因为共价脂质键与免疫原性之间有明显的相关性，所以一种为细胞的膜蛋白所共有的脂质——三棕榈酰基-S-甘油半胱氨酸(Pam3Cys)可与共轭物中的合成肽结合，这样也可以增强免疫原性。
如果该合成肽与佐剂共给予，则免疫原性还可明显得到改进。佐剂增强抗原的免疫原性，但它们自身不一定是免疫原性的。佐剂可使抗原局部滞留在接近给药位点的地方，以对免疫系统的细胞产生促进缓慢的、持续释放抗原的储存效果(depot effect)，由此而起作用。佐剂还可吸引免疫系统中的细胞到抗原储存中，刺激这些细胞引起免疫反应。
为改善针对如疫苗的宿主免疫系统应答，免疫刺激剂或佐剂已使用许多年了。内源性佐剂，如脂多糖，通常是灭活的或减弱的细菌(如疫苗)的成分已使用。外源性佐剂是免疫调节剂，它们通常共价连接于抗原，并被配制以增强宿主免疫反应。因此，已鉴定佐剂可增强针对肠道外传送的抗体的免疫反应。但是，这些佐剂中有一些是毒性的，并可引起不良的副作用，使得它们不适用于人和许多动物。实际上，在人和脊椎动物疫苗中，仅有氢氧化铝和磷酸铝(通称为明矾)常用作佐剂。已很好确定了明矾在增加抗体针对白喉类毒素和破伤风类毒素中的的功效，并且HbsAg疫苗也已经用明矾作佐剂。
各种各样的外源性佐剂可引起针对抗原的有力的免疫反应。这些佐剂包括与膜蛋白抗原结合的皂苷(免疫刺激复合物)、具有矿物油的普朗尼克(pluronic)普朗尼克系聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物]聚合物、矿物油中的灭活的分枝杆菌、完全弗氏佐剂、细菌产物〔如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)〕，以及脂质A和脂质体。为了有效地诱导体液免疫应答(HIR)和细胞介导的免疫(CMI)，由佐剂将免疫原乳化。许多佐剂是毒性的，它们诱导肉芽瘤、急性和慢性炎症(完全弗氏佐剂，FCA)、细胞裂解(皂苷和普朗尼克聚合物)以及致热原性关节炎和前葡萄膜炎(LPS和MDP)。虽然FCA是优异的佐剂，并在研究中广泛使用，但是它并未得到在人或脊椎动物中使用的许可，因为它具有毒性。
美国专利第4,855,283号描述了用糖脂类似物作为免疫调节剂或佐剂，这些类似物包括N-糖基酰胺、N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯，每种类似物在糖残基中被氨基酸取代。美国专利第4,258,029号描述了盐酸十八烷基酪氨酸(OTH)当与破伤风类毒素结合以及福尔马林灭活的I、II和III型小儿麻痹症病毒疫苗时，将其用作佐剂的功能。还有，Nixon-George等在1990年报道，与重组B型肝炎病毒表面抗原结合的芳族氨基酸的十八烷基酯增强了针对B型肝炎病毒的宿主免疫反应。
加入使针对Aβ肽和淀粉样蛋白沉积物的免疫反应增加到最大的外源佐剂/乳液制剂是优选的。合适的佐剂和载体是：(1)已被成功地用于人I期试验的佐剂和载体；(2)基于其在临床前安全研究中缺乏反应原性，而具有在人中许可使用的潜力的佐剂和载体；(3)已被许可用于食物和伴生动物的佐剂和载体。Aguado等(1999)报道了目前正在进行临床试验的一些佐剂。
非常需要在给予最少量的剂量(理想的是仅给予1剂量)后产生最大的免疫反应的免疫治疗方案。这一结果可通过在微粒中俘获免疫原而获得。例如，可吸收的缝合材料聚(丙交酯-共-乙交酯)共聚物可被制作到含有免疫原的微粒中。在口服或肠道外给药后，微粒在体内水解，产生无毒性副产物乳酸和羟基乙酸，并释放出免疫原，该免疫原在俘获过程中基本上未改变。被俘获的免疫原的微粒降解和释放速率可由几个参数控制，包括(1)用于微粒形成的聚合物的速率(具有较高的共-乙交酯浓度等级的颗粒更快)；(2)颗粒大小(越小的颗粒降解越快)；(3)俘获效率(具有较高浓度的俘获抗原的颗粒比具有较低负载的颗粒降解快)。微粒制剂还可通过混合具有不同的释放速率的俘获免疫原的微粒，以一次给药的方式提供主要的和随后的免疫加强。可易于获得在小于1周到大于6个月的时间内能释放抗原的单剂量制剂。而且，当将微粒化的抗原与外源制剂/乳化制剂混合时，被俘获在微粒中的本发明合成肽的传送也可提供改进的功效。
使用在明矾中配制的合成肽注射动物，如小鼠或大鼠，然后接着对淀粉状蛋白β肽进行免疫反应，可建立和分析合成肽的功效。
本发明的另一方面提供免疫组合物，它包括免疫有效量的一种或多种本发明的合成肽，或其共轭物，以及药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或助剂(包括佐剂)。因此，可使用佐剂、药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、助剂或通常在免疫组合物中提供的其它成分将合成肽或其共轭物配制成免疫组合物。本领域普通的技术人员易于测定这些制剂，它们包括即释制剂和缓释制剂，如微胶囊化。可以常规的途径给予本发明的免疫组合物，包括皮下、口服、肌肉内或其它肠胃外或肠途径。类似地，可以单剂量的方式给予疫苗，或将其分成多剂量再给予。本领域普通的技术人员易于确定免疫方案。例如，可用本发明中的佐剂或乳剂包括明矾、完全弗氏佐剂、静脉脂肪乳剂、皂苷、鲨烯、L121、乳化原(emulsigen)和ISA720。在优选实施例中，佐剂/乳剂是明矾、不完全弗氏佐剂、静脉脂肪乳剂和皂苷的组合、鲨烯与L121的组合，或者乳化原与皂苷的组合。
本发明的免疫组合物含有免疫有效量的一种或多种合成肽或其共轭物以及药学上可接受的载体。剂量单位形式的这些组合物可含有每千克体重约0.5μg到约1mg的各肽或其共轭物。当以多剂量传送时，通常将剂量单位形式分成每剂量适当的量。
含有两种或多种本发明合成肽或其共轭物的混合物的免疫组合物在较宽范围的人群中增强了免疫效力，从而提供针对淀粉状蛋白β肽和淀粉状蛋白沉积物的较好的免疫反应。通过对脂肽进行修改，以便给有力的疫苗提供嵌入式佐剂性，从而可获得其它的免疫刺激性合成肽免疫原。使本发明合成肽免疫原俘获在Hagan等(1991)所述类型的生物可降解微粒之内或之上，可改进针对它们的免疫反应。可在佐剂存在与不存在的情况下将免疫原包囊化，包括共价地连接于脂质部分如Pam3Cys，这些微粒可与免疫刺激性佐剂如弗氏不完全佐剂或明矾一起给予。对于口服以及局部给药，这些微粒起到加强针对免疫原的免疫反应并提供时间控制型的持续或周期性释放的作用(O′Hagan等，1991)。
本发明的另一方面是一种用本发明的合成肽或其共轭物进行免疫的方法。本发明方法涉及向需要的哺乳动物(优选是人)给予含有合成肽或其共轭物的免疫组合物。首先在AD的转基因动物模型中测试功效，如Schenk等(1999)使用的小鼠模型，或其它公众的或市售的AD转基因小鼠模型。
本发明的又一方面提供针对本发明的免疫源性肽而产生的抗体和包括这些抗体的抗原结合部分的分子。
应理解，当术语“抗体”用在本发明的抗体实施例中时，它包括完整的抗体，如多克隆抗体或单克隆抗体(mAb)，以及其蛋白水解的片段，如Fab或F(ab′)2片段。此外，可将编码抗体的可变区的DNA插入其它的抗体中，以产生嵌合抗体(例如，可参见美国专利第4,816,567号)，或者将其插入T细胞受体中，以产生具有一样宽的特异性的T细胞(参见Eshhar等，1990；Gross等，1989)。也可产生和使用单链抗体。单链抗体可以是具有抗原结合能力的单链复合多肽，含有与免疫球蛋白的轻链或重链(连接的VH-VL或单一的FV链)同源的或类似的一对氨基酸序列。VH和VL都可模仿天然的单克隆抗体序列，或者一条或两条链可含有美国专利第5,091,513号所述类型的CDR-FR构建物(本文将该专利的全部内容纳入作为参考)。与轻链和重链的可变区类似的分离的多肽被多肽连接物维持在一起。根据如美国专利第4,946,778号和第5,091,513号和第5,096,815号中所述的方法，可生产这些单链抗体，尤其是其中编码VH和VL链的多肽结构的DNA是已知的，本文将这些文献的全部内容纳入作为参考。
如果一种抗体能特异性地与分子反应，从而使该分子与该抗体结合，则我们认为该抗体“能结合”分子。术语“表位”指能被抗体结合也可被该抗体识别的任何分子的部分。表位或者“抗原决定簇”通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，它们具有特殊的三维结构特征，以及特殊的电荷特征。
多克隆抗体是从用抗原免疫的动物血清中得到的抗体分子的异源种群。
单克隆抗体(mAb)是针对特殊抗原的一类基本上同源的抗体。可采用本领域熟练的技术人员已知的方法获得mAb。例如，可参见Kohler等(1975)；美国专利第4,376,110号；Harlow等(1988)；Colligan等(1993)，本文将这些文献的全部内容纳入作为参考。这些抗体可以是任何免疫球蛋白种类，包括IgG、IgM、IgE、IgA及其任何亚类。可在体外或体内培育产生本发明的mAb的杂交瘤。通过体内生产可获得高效价的mAb，生产方法如下：在从单独的杂交瘤得到的细胞被腹膜内注射到降植烷-灌注的Balb/c小鼠中，以产生含有高浓度的所需mAb的腹水。可采用本领域熟练的技术人员周知的柱色谱法技术，从腹水中或者从培养物上清液中纯化同种型IgM或IgG的mAb。
嵌合抗体是分子，其不同部分从不同的动物种类获得，如那些具有鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。嵌合抗体主要用于减少应用过程中的免疫原性，并增加产率，例如，鼠的mAb可从杂交瘤中以较高产率产生，但是它对人具有较高的免疫原性，这样可使用人/鼠嵌合或人源化mAb。嵌合抗体和人源化抗体和它们的生产方法在本领域中是周知的，如Cabilly等，1984；Morrison等，1984；Boulianne等，1984；Cabilly等，1984；Neuberger等，1985；Taniguchi等，1985；Morrison等，1986；Neuberger等，1986；Kudo等，1986；Morrison等，1986；Sahagan等，1986；Robinson等，1987；Liu等，1987；Sun等，1987；Better等1988；以及Harlow等，1988。本文将这些文献纳入作为参考。
“包括抗体的抗原结合部分的分子”不仅包括任何同种型和任何动物细胞系或微生物产生的完整免疫球蛋白分子，而且还包括其结合抗原的反应性部分，包括但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、其重链和/或轻链的可变部分、加入这些反应性部分的嵌合抗体或单链抗体，以及这种抗体反应性部分已用物理方法插入其它任何类型的分子或细胞中，如嵌合T细胞受体或具有这种受体的T细胞，或者开发成借助于含这种反应性部分的分子部分传送治疗部分的分子。可采用任何已知的方法提供这种分子，包括但不限于酶裂解、肽合成或重组技术。
本发明还提供一种药物组合物，该组合物含有一种分子和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂，该分子包含针对本发明的肽产生的抗体的抗原结合部分。本领域熟练的技术人员仅采用常规的实验即可开发药物组合物的制剂，非常熟练的技术人员按常规使用这种制剂，并且其组合物适用于其所设想的用途，即用作减少淀粉状蛋白原纤维和沉积物的形成的治疗剂。
根据本发明，可将包含针对本发明的免疫原肽产生的抗体的抗原结合部分的分子给予需要的受试者，以减少淀粉状蛋白原纤维和沉积物的形成。给药的位点、剂量和给药方案根据本领域熟练的技术人员采用的已很好确立的方法确定。
上面已经对本发明作了概述，参考下面的实施例将更易于理解这些内容，这些实施例仅仅是阐述性的，并不是对本发明作出限制。
实施例1
本实施例的实验证明，用非淀粉状蛋白源性、无毒性Aβ同源肽免疫转基因APP小鼠(Tg2576)7个月，可分别减少皮层和海马中大脑淀粉状蛋白负荷的89％(p＝0.0002)和81％(p＝0.0001)。同时，大脑中可溶的Aβ1-42的水平减少了57％(p＝0.0019)。表达与Aβ斑有关的白介素-1β的分枝的小胶质细胞在经免疫的小鼠中缺乏，这说明这些动物中炎症减少了。在本实施例中使用的材料和方法以及试验结果如下。材料和方法肽
如先前所述(Sigurdsson等，2000)，在Keck Foundation(耶鲁大学，New Haven，CT)上合成所使用的肽〔Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-30-NH2(SEQ ID NO：1)和K6Aβ1-30-NH2(SEQ ID NO：6)〕。使用固相tBOC(N-叔丁氧羰基)合成本发明的非淀粉状蛋白源性肽，采用HPLC纯化，然后采用HPLC和激光吸附质谱法表征。
用于免疫的肽K6Aβ1-30-NH2保留了Aβ肽的两个主要的免疫原性位点，即基于Jameson等(1998)的抗原性指数和本发明者在实验室中获得的初步结果的Aβ1-42的第1-11个残基和第22-28个残基。Aβ1-30-NH2和K6Aβ1-30-NH2肽的C末端被酰胺化，以进一步保护它们的抗原性。次级结构研究
如先前所述(Soto等，1998；和Soto等，1996)，采用圆二色性(CD)评估这些肽的次级结构(α-螺旋、β-折叠和随机螺旋)。结果以摩尔椭圆率表示，单位为度·cm2/dmol，采用Lincomb和CCA算法(Perczel等，1992)分析数据，以获得不同类型的次级结构的百分比。
虽然采用圆二色性(CD)对合成肽的次级结构进行评估，但是也可使用Aucouturier等(1999)已发表的方案，采用傅立叶变换红外光谱(FTIR)进行评估。虽然CD对骨架构象敏感，而FTIR对酰胺基的氢键(这是其结构的附属)的程度和强度敏感，但这两种技术最终都给出类似的信息：不同次级结构基元(即α-螺旋、β-折叠、β-转角和随机螺旋)的百分比(Surewicz等，1993)。CD是一种已经很好建立的研究溶液中蛋白质和肽的次级结构的技术，它能对不同的结构基元含量作出相当准确的估计。研究结构特征的FTIR的主要优点是它不依赖于样品的物理状态。样品可以水溶液或有机溶液、水合膜、不均匀分散液、聚集材料甚或固态蛋白质的形式进行检测。因此，CD和FTIR对于研究肽的次级结构来说是互补的。
根据Golabek等(1996)和Soto等(1996和1998)所述进行圆二色性的实验过程，其步骤如下：在25℃，在Jasco J-720分光偏振计中，使用具有双蒸馏去离子水和TFE(光谱学用等级)作为溶剂的0.1cm通径长度的孔，记录含有合成肽的溶液(1-5μM于300μl 10mM磷酸钠，pH7.2)的CD光谱。用d-(+)-10-樟脑磺酸的水溶液校准仪器。在180-260nm的波长范围内，以1nm的间隔记录光谱，然后减去在相同条件下获得的缓冲液光谱。
Aucouturier等(1999)的傅立叶变换红外光谱法的试验过程如下：在中性pH的H2O和D2O缓冲液中制备含有可溶的或聚集的合成肽的溶液或悬浮液(5-10mg/ml)，然后将10μl加到具有CaF2板和6μm通径长度间隔的红外孔中。如先前所述(Aucuturier等，1999；Soto等，1995)，在25℃用Perkin Elmer 2000型FTIR分光光度计记录光谱。对于每个光谱，使用2cm-1的分辨率，并在4000-1000cm-1的范围内以1cm-1的间隔以单束模式收集1000次扫描。平滑和傅立叶自身去褶合(Fourier self-deconvolution)适用于增加酰胺I区域(1700-1600cm-1)中的光谱分辨率，然后进行Lorentzian线形的迭代拟合，以评估各次级结构元素的比例。淀粉状蛋白原纤维体外形成的研究
可采用从本发明者的实验室获得的已发表的方案(Castano等，1995；Wisniewski等，1991；Wisniewski等，1993和Wisniewski等，1994)进行淀粉状蛋白原纤维体外形成的研究。将在0.1M Tris(pH7.4)中制备的浓度为25-250μM的合成肽的等分试样培育不同的次数，然后将它们的原纤维形成与Aβ1-28、Aβ-1-40和Aβ1-42的相比。在这个实施例中，在0.1M Tris(pH7.4)中制备的肽的等分试样培育不同的次数，然后将它们的原纤维形成与Aβ1-30-NH2和Aβ1-42的相比。如先前本发明者的实验室所述(Soto等，1998，和Jameson等，1998)，采用荧光检测，在硫黄素T产生的荧光发射的基础上评估体外原纤维生成。硫黄素特异性地与淀粉状蛋白结合，这种结合导致其发射光谱的转移，使荧光增强与形成的淀粉状蛋白的量成比例(LeVine等，1993)。
虽然在本实施例中未进行，但是，也可采用其它3种不同的方法评估体外原纤维生成：
(A)基于刚果红与淀粉状蛋白原纤维的特异性相互作用的分光光度计检测。在培育期后，将2μl的刚果红(1.5mg/ml)加到每份样品中，在暗处培育1小时。然后以15,000rpm离心样品10分钟，在490nm测量上清液的吸光度。所形成的淀粉状蛋白的量与上清液吸光度的减少直接成正比例(Castano等，1986)。
(B)如Soto等(1995)所述使用沉积检测。简言之，以15,000rpm离心样品10分钟，以分离可溶的和聚集的肽。使用反相Vydac C4柱和3-70％乙腈的线性梯度，采用微内径HPLC分析溶液中的物质的量。通过比较对应于各培育样品中的可溶肽的峰面积和非培育样品的相同对照，评估聚集的肽的百分比。
(C)在阴性染色后采用刚果红染色和电子显微术检测进行原纤维生成的额外表征(Castano等，1995；Wisniewsi等，1991；Wisniewsi等，1993和Wisniewsi等，1994)。对于电子显微镜术，将肽的培育样品放在包涂了碳模型(formar)的300目镍格栅上，然后在2％戊二醛的蒸气下用2％乙酸双氧铀染色60秒钟。将格栅放在Zeiss EM 10电子显微镜上，在80kV下进行目测。对于刚果红染色，将培育的肽放到包涂明胶的玻璃显微镜载片上，并使其在37℃的空气中干燥。然后在室温将该薄片浸入溶解在80％乙醇的用NaCl使其饱和的0.2％刚果红中60分钟，用水洗涤3次，然后用偏振光显微术进行目测。神经毒性
使用制造商(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)所述的标准MTT检测，在第2天和第6天评估K6Aβ1-30-NH2(1-100μM)在人成神经细胞瘤细胞系(SK-H-SH)中潜在的神经毒性。使用Aβ1-30-NH2、Aβ1-40和Aβ1-42作为对照肽。简言之，以每孔10,000个细胞/100μl培养基将细胞放在96孔平板的平底上进行平板培养。使这些细胞在培养器中粘附在平板上过夜(37℃，5.0％CO2)，然后加入10μl新配制的肽溶液(在毫微级纯度的水中)。Aβ1-42仅仅部分溶解在100μM范围内，因此，在这个浓度作为一种悬浮液加入Aβ1-42。接下来的步骤如试验方案中所述。动物
如Karen Hsiao等(1996)所述，在Tg2576 APP小鼠模型中进行接种。这些小鼠在早在11-13月时就产生Aβ斑。选择这种模型而不选择双Tg APP/PS1模型(Holcomb等，1998)的原因是，在单一Tg APP小鼠中Aβ沉积的开始和发展的年龄更类似于AD。将年龄匹配的载体处理的Tg小鼠和接受K6Aβ1-30-NH2的非Tg同窝初生仔作为对照，这些动物在长到11-13个月时接受第一次注射，此时应已经存在少数斑。每组有4只小鼠。使这些小鼠处于12小时的光-暗循环中，并能随意获得食物和水。动物的饲养根据制定的指南进行。
给予疫苗：以三氟乙酸(TFA)盐的形式提供K6Aβ1-30-NH2。如Schenk等(1999)先前所述进行免疫过程，但是肽在注射前不放在37℃培育过夜。简言之，将肽以2mg/ml的浓度溶解在PBS中，然后将其以1∶1的体积比与佐剂或PBS混合。将完全弗氏佐剂用于第一次注射，接下来的3次注射用弗氏不完全佐剂，从第5次注射开始使用PBS。小鼠接受100μl混合物(即，100μg/100μl)的皮下注射，接着在2周后进行第二次注射，之后每月注射一次。
抗体效价：如先前所述(Jimenez-Huete等，1998)，采用ELISA检测通过血清的系列稀释测定抗体的效价，其中Aβ或其衍生物被包涂在微滴定孔上。以四甲基联苯胺(Pierce，Rockford，IL)为底物，使用连接于辣根过氧化物酶(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的山羊抗-小鼠IgG检测效价，效价定义为产生50％的最大信号的稀释度。
组织学：用戊巴比妥钠(150mg/kg，i.p.)麻醉小鼠，经主动脉灌注磷酸盐缓冲液，然后如先前所述处理大脑(Sigurdsson等，1996)。将右半球浸入高碘酸盐-赖氨酸-低聚甲醛中，使其固定，而使左半球快速冷冻，以用于采用已建立的ELISA法测量Aβ水平(Metha等，1998和Metha等，2000)。切下连续的皮层切片(40μm)，将5片0.2mm间隔的切片保存用于1)6E10；2)刚果红；3)白介素1β/OX42/番茄外源凝集素；4)GFAP和5)甲酚紫染色切片的组织学分析。6E10识别Aβ，并对前淀粉状蛋白和Aβ斑都染色(Kim等，1990)。进行刚果红染色，以鉴别这些动物中的淀粉状蛋白病灶。GFAP是形成部分细胞骨架的神经胶质中间丝的成分，它在星形细胞中占优。小神经胶质细胞似乎是CNS中自介素-1(IL-1)的主要来源(Schobitz等，1994)，OX-42识别小神经胶质细胞上的CD11b，CD11b是大鼠等价于人C3bi受体的受体(Robinson等，1986)。番茄外源凝集素与聚-N乙酰基乳糖胺残基结合，并对小神经胶质细胞具有神经组织特异性亲和力(Acarin等，1994)。星形细胞和小神经胶质细胞都与Aβ的沉积有关。用甲酚紫染色，以测定免疫是否引起这些动物的神经元收缩和/或细胞损失。制成切片后，将这些切片放在乙二醇防冻剂中，并放在-20℃保存备用。
甲酚紫和刚果红：使固定的切片在二甲苯中脱脂，并在一系列梯度的乙二醇和水中水合。如先前所述(Sigurdsson等，1996和1997；Soto等，1998)染色。
6E10、GFAP、IL-1β和OX-42：如先前所述染色(Sigurdsson等，1996和1997；Soto等，1998)。简言之，将切片放在6E10中培育(有基础研究机构Richard Kascsak提供)，6E10是以1∶1000的稀释度与人的Aβ选择性结合的主要抗体。使用小鼠免疫检测盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)中的小鼠，其中以1∶2000的稀释度使用抗-小鼠IgG次级抗体。以与6E10染色相同的方式进行GFAP(1∶500，Dako，Denmark)、IL-1β(1∶250，Endogen，Rockford，IL)和OX-42(1∶250，BiosourseInt.，Camarillo，CA)染色，但次级抗体被稀释为1∶1300。在有或没有硫酸铵镍(Ni)强化的情况下，使切片在3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)中反应。对于IL-1β和Aβ斑的双重标记，首先将切片中的IL-1β染色(DAB/Ni，黑色)，其中过氧化物酶是酶。然后用Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I(Vector)将斑(6E10)染色。
番茄外源凝集素：从防冻剂中取出切片，将其放在PBS、0.3％Triton-X-100在PBS(PBS-TX)中的溶液中洗涤，然后在0.3％过氧化氢在PBS中的溶液培育30分钟，以中止内源的过氧化物酶活性。与番茄外源凝集素(10μg/ml PBS，Vector)培育2小时后，在PBS-Tx中洗涤切片，然后使其与抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(Vector)反应1小时。接下来的步骤与抗体染色中的相同。
图像分析：使用Bioquant图像分析系统量化组织切片的免疫组织化学，并使用无偏取样的方法(West等，1999)。所有的操作都是由对研究的试验条件一无所知的人进行。所分析的皮层区域是具带皮层的背中线，并且沿着腹侧延伸到右半球的嗅裂中。格栅的面积是800×800μm2，随机地在每只小鼠10个框架中选择测量淀粉状蛋白负荷(各自为640×480μm2)。以与皮层分析类似的方式在整个海马上进行海马测量。Aβ负荷定义为反应产物占据测量领域的面积百分比。
可溶的Aβ水平的夹心型ELISA检测：在从大脑组织中抽提出Aβ之前，先在组织均浆缓冲液(20mM Tris pH7.4，250mM蔗糖，1mM EDTA，1mM EGTA)中制备10％(w/v)的匀浆液。在使用前，立即将1/100体积的100mM苯基甲基磺酰氟原液(在乙醇中)和1/1000体积的LAP(每ml的N-N-二甲基甲酰胺5mg的各亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶和胃酶抑制剂Aβ)加到该均浆缓冲液中。然后使上述匀浆液彻底地与等体积的0.4％二乙胺/100mM NaCl混合，然后在4℃以135,000×g旋转1小时，接着用1/10体积的0.5M Tris(pH6.8)中和。然后将样品等分，在干冰上使其迅速冷冻，放在-80℃保存，直到将其加到平板上为止。使用单克隆抗体6E10(对Aβ第1-16个氨基酸残基上的表位特异)、兔抗血清R162(对Aβ40特异)和兔抗血清165(对Aβ42特异)，进行先前所述的双抗体夹心ELISA(Mehta等，1998和2000)，测量左半球中可溶的Aβ水平。在微ELISA读数器中读取450nm的光密度(OD)。采用4种参数逻辑对数函数确定OD和Aβ40或Aβ42之间的关系。使用KlinetiCalc程序(Biotek Instruments，Inc.Winooski，VT)进行非线性曲线拟合，以将血浆的OD转化成估计的浓度。给所有的样品编号，研究者对于组排列是未知的，直到测量和记录水平后。对于Aβ40和Aβ42试验的检测限度是10pg/ml。变化的百分比系数通常为8-14％(试验之间)和10-18％(试验之内)。
数据分析：采用单路ANOVA分析细胞培养数据，接着进行Dunnett测试，以进行之后分析(GraphPad Prism 3.0)。使用无偏体视学图像分析系统(Bioquant，R&M Biometrics Inc.，Nashville，TN)来测定6E10染色的大脑切片中淀粉状蛋白负荷。采用双尾“学生”t-检验分析淀粉状蛋白负荷的数据和大脑中可溶的Aβ的水平。结果
在进行接种研究前，有必要先确认原型肽KKKKKK-Aβ1-30-NH2与Aβ1-42相比，确实有较少的β-折叠结构、减少的原纤维形成，并且它对神经元培养物是无毒性的。采用圆二色性测定这些肽的次级结构，采用硫黄素-T荧光测定法检测它们形成淀粉状蛋白原纤维的能力。额外的对照肽是Aβ1-30-NH2。
CD检测：与β-折叠含量低的化合物相比，β-折叠含量高的化合物更具有毒性，更有可能形成原纤维(Pike等，1991)。在其N末端具有多赖氨酸的肽含β-折叠的量比酰胺化的Aβ1-30或Aβ1-42少得多(表1)。
(K)6-Aβ1-30-NH2肽在37℃培育至少15天后也不形成原纤维。这个数据清楚表明，在N末端加入多赖氨酸改变了该肽，使得其β-折叠含量比Aβ1-42或Aβ1-30少得多。此外，(K)6-Aβ1-30-NH2肽的β-折叠含量不随着时间而增加。在96小时后，Aβ1-42的β-折叠含量增加到55％，而(K)6-Aβ1-30-NH2的β-折叠含量仍维持在16-18％。
表1
硫磺素T检测：在t＝0时Aβ1-42已经是原纤维的，而Aβ1-30-NH2则随着时间逐渐形成原纤维(图1)。Aβ1-30-NH2和Aβ1-42的较高程度的硫黄素T染色6天后的结果显示了已知的Aβ肽原纤维形成的逐批易变性(Soto等，1995)，以及Aβ1-42在长时间培育中一定程度的球粒形成。K6Aβ1-30-NH2在37℃培育至少15天后没有形成原纤维。
神经毒性：为了进一步评价这种接种方法的安全性，测定了K6Aβ1-30-NH2的神经毒性。采用MTT检测发现，与载体组相比，在第2天，K6Aβ1-30-NH2对细胞生存没有影响，在第6天有轻微的营养性(p＜0.05)，而Aβ1-40和Aβ1-42则对人成神经细胞瘤细胞(SK-N-SH)有毒性(p＜0.05-0.001)(图2A和2B)。在培育过程中，用显微镜观察到仅在含有Aβ1-42(10-100μM)的培养物孔中有聚集物。
抗体效价：给Tg2576及其非Tg同窝出生者接种K6Aβ1-30-NH2或载体。几乎所有的小鼠发展了针对免疫原(K6Aβ1-30-NH2)的抗体，这些抗体与Aβ1-40和Aβ1-42交叉反应。其定义为产生50％的最大信号的稀释度的效价范围是几百到几千(未给数据)。用佐剂注射载体处理的动物，结果发现PBS没有发展针对这些3种肽的抗体(未给数据)。非转基因小鼠针对所有3种肽的效价普遍较高，并且与Aβ1-40和Aβ1-42相比，多克隆抗体对免疫原具有较高的抗体亲抗原性。这些发现与预期的一样，因为该免疫原是以人的Aβ序列为基础，该序列与小鼠的Aβ有3个氨基酸不同(Johnstone等，1991)，且引起免疫反应的K6Aβ1-30-NH2与完整的Aβ肽相比，应对抗体具有更多的结合基元。
淀粉状蛋白负荷和相关的组织病理学：在治疗7个月后，将18-20月大的小鼠处死，如先前所述(Sigurdsson等，1996)处理它们的大脑右半球用于组织学研究。用甲酚紫、刚果红、番茄外源凝集素以及针对1)人Aβ(6E10)、小神经胶质细胞(OX-42，IL-1β)以及GFAP(抗-GFAP)的抗体染色大脑切片。用K6Aβ1-30-NH2接种后，采用体视学技术进行检测，结果发现Tg小鼠大脑皮层和海马中的淀粉状蛋白负荷分别减少89％和81％(图3A、3B；4A、4B)。经免疫的动物中刚果红阳性淀粉状蛋白沉积物的总量减少，但是，刚果红阴性的Aβ-免疫反应性损害的百分比似乎仍与非免疫的Tg小鼠中的一样。淀粉状蛋白沉积物的清除率似乎与其它大脑区域类似。用从其抗体效价为0到3千的几只免疫小鼠和对照小鼠获得的血清给高淀粉状蛋白负荷的对照小鼠和淀粉状蛋白负荷减少的免疫小鼠的选择的大脑切片染色。如预期的那样，随着效价的增加，更多的斑被染色，其模式在两类小鼠中相似(未给数据)。在甲酚紫染色中Tg处理组之间没有明显的差异。观察到与所有的淀粉状蛋白斑相关的反应性星形细胞。由于载体处理的Tg小鼠具有较高的斑负荷，它们比免疫Tg小鼠有更多的星形细胞簇。主要观察到分支的而非吞噬的(阿米巴)小神经胶质细胞的OX-42染色与斑相关。为了证实小神经胶质吞噬细胞的缺乏并不是由于OX-42的结合基元CD11b受体(Robinson等，1986)下调的缘故，用番茄外源凝集素给所有处理组的切片染色。这种具体的外源凝集素与聚-N-乙酰基乳糖胺残基结合，该残基除了在内皮细胞和室管膜细胞中发现外(Acarin等，1994)，还主要在分支和吞噬细胞的小神经胶质细胞中发现。后面这两类细胞在所有的小鼠中被染色。小神经胶质细胞的外源凝集素染色与OX-42染色类似。换言之，在免疫Tg组和对照Tg组中，小神经胶质细胞并不具有吞噬细胞的形态学，并且免疫小鼠和未免疫小鼠之间的每个斑拥有的分支小神经胶质细胞的数量似乎类似(未给数据)。另一方面，在对照Tg小鼠中，分支小神经胶质细胞的IL-1β染色在Aβ斑周围显得很突出(图3C)，而实际上在免疫小鼠中没有观察到IL-1β染色(图3D)。值得注意的是，K6Aβ1-30-NH2处理的小鼠的苏木精/曙红染色的肾切片中没有肾小球性肾炎的征兆，这表明小鼠没有发展自身免疫疾病。
ELISA检测可溶的Aβ：在右半球用于组织学研究的小鼠的左半球上进行可溶的Aβ水平的测量。用K6Aβ1-30-NH2接种7个月后，与对照组相比，可溶的Aβ1-42减少了57％(p＝0.0019)(图4C)。虽然在K6Aβ1-30处理组中存在可溶的总Aβ和Aβ1-40的水平减少的倾向，但是这些数值与载体组并没有有明显的不同。
总之，用非淀粉状蛋白源性/无毒性(β-折叠含量低)的Aβ同源肽免疫Tg APP小鼠，结果得到与Schenk等(1999)观察到的淀粉状蛋白负荷的类似的减少，在Schenk等的观察中，他们使用了原纤维/毒性(β-折叠含量高)的Aβ1-42。讨论
这些发现证明，Aβ聚集物/原纤维对于引起清除Aβ斑的足够的免疫反应并不是必需的。非原纤维/无毒性Aβ同源肽，如K6Aβ1-30-NH2，是人用的安全接种方法。
并不完全理解接种引起大脑淀粉状蛋白负荷减少的机制。但是，以Bard等(2000)的被动接种研究为基础，抗体很有可能起了关键的作用。有趣的是，他们证明抗体效力与可溶的Aβ或和聚集的合成Aβ肽的结合的亲和力无关。但是，有效的抗体能结合未固定的大脑切片中的斑。Janus等(2000)采用Schenk等(1999)的相同方案观察到，Aβ免疫的小鼠的血清优先染色致密的核斑，而不是使Aβ沉积物扩散，这表明抗体可能对β折叠Aβ具有较高的亲和力。在这些有些矛盾的发现的基础上，需要对Aβ-抗体相互作用进行更多的研究，这才有可能对抗体介导的Aβ清除的机制有更深入的理解。这些抗体不太可能影响Aβ的产生，因为他们不识别APP(Weiner等，2000)。抗体通过抗体与Aβ斑结合后的小神经胶质细胞激活增强Aβ的清除更有可能(Schenk等，1999，Bard等，2000)。它们的影响也可能部分是由于与大脑中可溶的Aβ结合的缘故，这种结合改变了沉积的Aβ和可溶的Aβ之间的平衡。根据显示Aβ可来回通过血脑屏障的大量报道(Zlokovic等，1993；Maness等，1994；Martel等，1996；Poduslo等，1997和1999；Mackic等，1998；Shibata等，2000和Ji等，2001)，接种效果可能部分由抗体与外周液体中的可溶Aβ结合所介导。随后的外周Aβ水平的减少可改变CNS之内和之外中发现的Aβ的平衡，这可能导致Aβ从CNS流出。最近的报道显示，在Tg2576小鼠中，Aβ的血浆水平随着大脑斑负荷的增加而减少(Kawarabayashi等，2001)。这表明可操纵这两个室之间的相互作用。
有趣的是，在Morgan等(2000)的行为接种研究中，他们观察到，虽然由免疫组织化学测得的APP/PS1小鼠中大脑淀粉状蛋白负荷并没有明显地减少，但是这些小鼠中出现认识缺乏的部分逆转。如Morgan等(2000)指出，已提出可溶的Aβ引起APP Tg小鼠的突触损失，因为一些Tg小鼠系在没有Aβ沉积物的齿状回中具有减少的突触泡蛋白染色(Mucke等，2000)。因此，对于免疫小鼠在没有减少斑负荷的情况下认识改善的可能解释是可溶的Aβ的减少，虽然在他们的研究中并没有估量这种潜在的联系(Morgan等，2000)。本发明者的实验室中获得的结果显示，在7个月的治疗后，淀粉状蛋白斑负荷减少81-89％与大脑中可溶的Aβ1-42减少57％有关，而在对照组中，可溶的总Aβ与Aβ1-40的减少并没有明显的差别。换言之，可溶的Aβ的减少少于斑状Aβ。但是，必须进行详细的时程研究，以进一步确定可溶的Aβ和斑状Aβ之间的平衡变化。这些发现间接证明了Aβ1-42对斑维持的重要性。总之，有可能是几种不同的机制导致大脑淀粉状蛋白负荷减少，这取决于动物模型和用于免疫的肽的特性。
大量的研究表明，淀粉状蛋白沉积可激活大脑中的炎症级联反应，如增加与神经元损伤和死亡相关的IL-1产生(Sigurdsson等，1996和Akiyama等，2000)。我们用Aβ同源肽免疫也有可能刺激这种负性的炎症途径，以及淀粉状蛋白的减少。但是，从OX-42免疫反应性或番茄外源凝集素结合所鉴别得到的结果来看，在我们的免疫动物中观察到少数的吞噬性小神经胶质细胞。这并不令人惊讶，因为在7个月治疗后，大多数的斑已经被清除掉。此外，在免疫组小鼠中，实际上小神经胶质细胞的IL-1β染色并不存在，而大量的分支IL-1β阳性小神经胶质细胞则与对照Tg组中的斑相关。本发明者的实验室先前已报道，大脑淀粉状蛋白形成的大鼠模型在使用β-折叠断裂肽治疗后，存在类似的没有IL-1β染色(Sigurdsson等，2000)。但是，在短时间的研究中(16天)，这种效果与吞噬细胞的OX-42染色的强度增加有关，这表明吞噬细胞不表达IL-1β。目前从本实施例试验得到的观察可表明，免疫的一个重要效果是减少了大脑中的炎症。
实施例2材料和方法肽
如先前所述(Sigurdsson等，2000)，在Keck Foundation(耶鲁大学，New Haven，CT)上合成所使用的肽〔Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-30-NH2、K6Aβ1-30-NH2、Aβ1-30-K6(SEQ ID NO：11)、Aβ1-30-NH2(EE18，19)(SEQ ID NO：12)、Aβ1-30-NH2(DD18，19)(SEQ ID NO：13)〕。Aβ同源肽保留了Aβ肽的两个主要免疫源性位点〔根据Jameson等(1998)以及本发明者的实验室中获得的初步结果，这两个位点为Aβ1-42的第1-11个残基和第22-28个残基)，而这些肽却是非原纤维和无毒性的。淀粉状蛋白原纤维体外形成和神经毒性的研究
如实施例1所述进行试验。数据分析
数据分析：采用单路ANOVA分析细胞培养物数据，接着进行Newman Keuls测试，以进行后此分析(GraphPad Prism 3.0)。结果
硫黄素T检测：在t＝0时Aβ1-42已经是原纤维的，而Aβ1-30-NH2和Aβ1-40则随着时间逐渐形成原纤维(图5)。在37℃培育15天后，Aβ1-30K6稍微有些原纤维产生，但Aβ1-30-NH2(EE18，19)和Aβ1-30-NH2(DD18，19)没有形成原纤维。
神经毒性：为了进一步评估这种接种方法的安全性，测定肽的神经毒性(图6A和6B)。在第2天和第6天观察处理的效果(p＜0.0001)。采用MTT检测，发现与载体组相比，对照肽Aβ1-40和Aβ1-42对人的成神经细胞瘤细胞(SK-N-SH)有毒性(p＜0.01-0.001)。K6Aβ-30-NH2在第2天对细胞存活没有影响，在第6天稍有轻微的营养性(p＜0.001)，最高剂量(100μm)的Aβ1-30K6在两天后有稍微的毒性，但在第6天没有。在培育过程中，仅在含有Aβ1-42(10-100μM)的培养物孔中用显微镜观察到聚集物。本发明这些Aβ同源肽不形成原纤维，并且在人神经元培养物中是无毒的。总之，与使用Aβ1-40/42相比，这种方法在人中产生毒性的风险较低。
在充分描述本发明之后，本领域熟练的技术人员将理解，在不偏离本发明的精神和范围，并且无需进行过多试验的情况下，在大范围的等价参数、浓度和条件内可进行相同的试验。
虽然本发明已结合具体的实施例进行了描述，但是应理解能对本发明作进一步改动。本申请涵盖任何变动、使用或适用形式，只要它们遵循本发明的原理，并包括在本领域已知或常规的实践范围之内且可应用于下文所附的权利要求的范围内提出的必要技术特征的那些偏离。
本文所引用的所有参考文献，包括期刊文章或摘要、出版的或相应的美国或国外专利申请、出版的美国或外国专利或者任何其它参考文献都被完整地纳入作为参考，包括所有的数据、表格、图和在所引用的参考文献中提出的文本。此外，在本文所引用的文献中引用的文献的全部内容也都完整地纳入本文作为参考。
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序列表<110>B.弗朗吉诺(FRANGIONE，Blas)
T.维希涅夫斯基(WISNIEWSKI，Thomas)
E.M.西于尔兹松(SIGURDSSON，Einar，M.)<120>诱导对β淀粉状蛋白和淀粉状蛋白沉积物的免疫反应、与
β淀粉状蛋白同源的免疫源性但非淀粉状蛋白源性合成肽<130>FRANGIONE-2A PCT<140>未转让<141>2001-05-22<150>60/016，233<151>2000-05-22<160>14<170>Patentin version 3.0<210>1<211>30<212>PRT<213>人工<220><223>合成<400>1Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
20 25 30<210>2<211>40<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基7-10如果存在的话，要么一起都是Lys，或者都是Asp，或者都不存在。当残基
7-10存在时，残基1-6的任一个或者全部不存在，或者以Lys或Asp存在，与残基7-10结
合形成长4-10个残基的N末端聚赖氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>第27-31个氨基酸残基是LeuValPhePheAla，其中，第27-31个残基中的一个或两个被Lys、
Asp或Glu替换。C末端Ala残基可以被酰胺化<400>2Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
20 25 30Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
35 40<210>3<211>70<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基7-10全部是Lys或者全部是Asp或全部不存在。当残基7-10存在时，氨基酸残
基1-6中的任一个或者全部不存在，或者以Lys或Asp存在，与残基7-10结合形成长4-10
个残基的N末端聚赖氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基27-31和57-61相同，都是LeuValPhePheAla，其中，残基27-31中的一个或两
个残基以及残基57-61中相同的一个或两个残基被Lys、Asp或Glu替换。C末端Ala残基
可被酰胺化<400>3Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
20 25 30Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser
35 40 45Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Val
50 55 60Gly Ser Asn Lys Gly Ala65 70<210>4<211>40<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基31-34全部是Lys或者全部是Asp或全部不存在。当残基31-34存在时，氨
基酸残基35-40中的任一个或者全部不存在，或者以Lys或Asp存在，以与残基31-34
结合形成长4-10个残基的C末端聚赖氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>第17-21个氨基酸残基是LeuValPhePheAla，其中，第17-21个残基中的一个或两个被
Lys、Asp或Glu替换<400>4Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Xaa Xaa
20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40<210>5<211>70<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基61-64全部是Lys或者全部是Asp或全部不存在。当残基61-64存在时，氨
基酸残基65-70中的任一个或者全部可以是Lys或Asp，与残基61-64结合形成长4-10
个残基的C末端聚赖氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基17-21和47-51相同，都是LeuValPhePheAla，其中，残基17-21中的一个
或两个残基和残基47-51中的相同的一个或两个残基被Lys、Asp或Glu替换<400>5Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Asp Ala
20 25 30Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa
35 40 45Xaa Xaa Xaa Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa65 70<210>6<211>36<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>C末端残基36可被酰胺化<400>6Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr1 5 10 15Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
20 25 30Asn Lys Gly Ala
35<210>7<211>40<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基1-6可不存在，或者以Lys或Asp存在，与残基7-10结合形成长4-10个残
基的N末端聚赖氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>C末端Ala残基可被酰胺化<400>7Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu
20 25 30Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
35 40<210>8<211>40<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基35-40可不存在，或者以Lys或Asp存在，与残基31-34结合形成长4-10
个残基的C末端聚赖氨酸或聚天冬氨酸片段<400>8Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Xaa Xaa
20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40<210>9<211>50<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基7-10如果存在的话，要么一起都是Lys，或者都是Asp，或者都不存在。当
残基7-10存在时，残基1-6的任一个或者全部不存在，或者以Lys或Asp存在，以与
残基7-10结合形成长4-10个残基的N末端聚赖氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基27-31是LeuValPhePheAla，其中，第27-31个残基中的一个或两个被Lys、
Asp或Glu替换<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基45-50可不存在，或者以Lys或Asp存在，与残基41-44结合形成长4-10
个残基的C末端聚赖氨酸或聚天冬氨酸片段<400>9Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
20 25 30Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45Xaa Xaa
50<210>10<211>80<212>PRT<213>人工<220><223>合成<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基7-10全部是Lys或者全部是Asp或全部不存在。当残基7-10存在时，氨基
酸残基1-6中的任一个或者全部不存在，或者以Lys或Asp存在，与残基7-10结合形
成长4-10个残基的N末端聚赖氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基75-80可不存在，或者以Lys或Asp存在，以与残基71-74结合形成长4-10
个残基的C末端聚赖氨酸或聚天冬氨酸片段<220><221>misc-feature<223>氨基酸残基27-31和57-61相同，都是LeuValPhePheAla，其中，残基27-31中的一个
或两个残基和残基57-61中相同的一个或两个残基被Lys、Asp或Glu替换<400>10Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
20 25 30Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser
35 40 45Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Val
50 55 60Gly Ser Asn Lys Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa65 70 75 80<210>11<211>36<212>PRT<213>人工<220><223>合成<400>11Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Lys Lys
20 25 30Lys Lys Lys Lys
35<210>12<211>30<212>PRT<213>人工<220><223>合成<400>12Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Glu Glu Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
20 25 30<210>13<211>30<212>PRT<213>人工<220><223>合成<400>13Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Asp Asp Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
20 25 30<210>14<211>5<212>PRT<213>人工<220><223>合成<400>14Leu Pro Phe Phe Asp1 5
机译： 合成免疫原性但非淀粉状肽同构到淀粉样蛋白b，以诱导对淀粉样蛋白b和淀粉样沉积物的免疫反应
机译： 合成的免疫原性但非淀粉状肽同构到淀粉样蛋白b，以诱导对淀粉样蛋白b和淀粉样沉积物的免疫反应
机译： 合成免疫原性但非淀粉状多肽同构的淀粉样蛋白，诱导对淀粉样贝他和淀粉样蛋白沉积物的免疫反应
