一种从制备当归注射液的废弃物中提取当归多糖的方法

摘要

本发明涉及一种从制备当归注射液的废弃物中提取当归多糖的方法，其特征在于：将制备当归注射液所得醇沉物，加水溶解，0～10℃静置后过滤，去沉淀，浓缩至0.1～2.0g/ml；加入2.0～10.0倍体积的无水乙醇，0～10℃静置后过滤，沉淀、加水溶解、离心、除去沉淀，上清液进一步浓缩后，加入2.0～10.0倍体积的无水乙醇，静置，弃上清，沉淀以无水乙醇洗涤、过滤，至乙醇洗涤沉淀时黄色褪尽；沉淀物干燥，得到当归多糖。本发明利用制备当归注射液所得废弃物来提取多糖，变“废”为宝，充分利用中药资源，简便、快捷且对环境污染小。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从制备当归注射液的废弃物中提取当归多糖的方法。

背景技术

当归为伞形科植物Angelica Sinesis(Oliv)Diels.的干燥根。有补血活血、调经止血、扶正固本等功效。专利申请号为02115699.9的中国发明专利申请公开了当归静脉注射液及其制备方法。但是当归注射液生产过程中分离出的醇沉物，一直以来对其活性组分及功效认识不清而废弃。我们对该醇沉物进行研究，结果显示它含有多糖类化合物，并具有多种药理活性。

多聚糖简称多糖(Polysaccharides)，是由十个以上的单糖基通过甙链连接而成。可以以均多糖或杂多糖形式存在。近年来多糖的生物活性(主要是调节免疫功能)逐渐为人们所认识，多糖类药物被认为是一类新型、高效、低毒类药物，引起国内外医药学界重视。

当归的化学成分复杂，主要分为挥发油及水溶性组分两大部分。日本学者Yamade等从东当归根中分离出分子量13500、结构为6位分枝α(1→4)的水溶性葡聚糖，其多糖组分还含有鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、木糖等。然而因产地来源及制备方法的不同，导致多糖组分中总糖醛酸、蛋白质、己糖种类和比例不同，生物学活性差异很大。为此，找到一种简便、经济、对环境污染小的方法分离制备当归多糖，且保证其具有稳定的质量标准，对于充分开发传统植物药物当归具有重要指导意义，也将取得良好的经济效益。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种从制备当归注射液的废弃物中提取当归多糖的方法，该方法利用制备当归注射液所得废弃物来提取多糖，变“废”为宝，充分利用中药资源，简便、快捷且对环境污染小。

本发明提供的技术方案是：一种从当归注射液提取废弃物制备当归多糖的方法，将制备当归注射液所得醇沉物，加水溶解，0～10℃静置后过滤，去沉淀，浓缩至0.1～2.0g/ml；加入2.0～10.0倍体积的无水乙醇，0～10℃静置后过滤，沉淀、加水溶解、离心、除去沉淀，上清液进一步浓缩后，加入2.0～10.0倍体积的无水乙醇，静置，弃上清，沉淀以无水乙醇洗涤、过滤，至乙醇洗涤沉淀时黄色褪尽；沉淀物干燥，得到当归多糖(ASP)。

在上述方法中，将制备当归注射液所得醇沉物，加水溶解，静置后过滤，去沉淀，浓缩至0.5～1.0g/ml；加入4.0～8.0倍体积的无水乙醇，0～10℃静置后过滤，沉淀、加水溶解、离心、除去沉淀，上清液进一步浓缩后，加入4.0～8.0倍体积的无水乙醇，静置，弃上清，沉淀以无水乙醇洗涤、过滤，至乙醇洗涤沉淀时黄色褪尽；沉淀物经真空干燥或40～70℃烘干，得到当归多糖。

本发明利用制备当归注射液所得废弃物来提取多糖，变“废”为宝，充分利用中药资源，简便、快捷且对环境污染小。

具体实施方式

实施例1：从当归注射液提取废弃物制备当归多糖的方法，取制备当归注射液所得醇沉物，称重，加适量水溶解，8℃静置12小时，过滤，除去沉淀，将上清液浓缩至约1.0g/ml后，加入4倍体积的无水乙醇，4℃静置12h，过滤，沉淀加入适量的水溶解，3500rpm离心10min，除去沉淀，上清液进一步浓缩后，加入4倍体积的无水乙醇，4℃静置24h，弃上清，沉淀部分用无水乙醇洗涤、过滤，反复数次，至乙醇洗涤沉淀时黄色褪尽。沉淀物经60℃烘干，即得到当归多糖ASP。

实施例2：从当归注射液提取废弃物制备当归多糖的方法，取制备当归注射液所得醇沉物，称重，加适量水溶解，3℃静置10小时，过滤，除去沉淀，将上清液浓缩至约0.3g/ml后，加入8倍体积的无水乙醇，6℃静置11h，过滤，沉淀加入适量的水溶解，3500rpm离心10min，除去沉淀，上清液进一步浓缩后，加入2倍体积的无水乙醇，4℃静置24h，弃上清，沉淀部分用无水乙醇洗涤、过滤，反复数次，至乙醇洗涤沉淀时黄色褪尽。沉淀物经真空干燥，即得到当归多糖ASP。1.ASP的定性实验及糖含量测定1.1试验方法：1.1.1标准曲线的制作：

精密称取105℃恒重的葡萄糖0.10g于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，取此溶液10ml置于100ml容量瓶中，定容至刻度，制成标准溶液。精密吸取标准溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml分别试管中，加蒸馏水稀释至2ml，两管平行；另精密吸取蒸馏水2ml作空白对照，置刻度试管中，分别加入水饱和酚溶液0.5ml，浓硫酸5.0ml，剧烈振荡10min，于30℃水浴中保温20min，在岛津UV1601分光光度计490nm处比色。1.1.2 ASP糖含量测定：

精密称取制得的ASP0.051g，置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，吸取该溶液2、4ml分别置于100ml容量瓶中加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述两种浓度溶液各2ml，两管平行，分别加入水饱和酚溶液0.5ml，浓硫酸5.0ml，剧烈振荡10min，于30℃水浴中保温20min，在岛津UV1601分光光度计490nm处比色。1.2试验结果及分析：

以不同浓度的葡萄糖溶液与其OD₄₉₀作回归分析得直线方程Y＝0.1426+5.08x(回归系数r＝0.998)，式中Y表示光密度，x表示葡萄糖的量。将当归多糖溶液加入苯酚和硫酸后由无色变为橙色，表明由当归醇沉物精制而得的物质确属糖类。将测定结果代入回归方程Y＝0.1426+5.08x计算，得出ASP的平均糖含量为65.5％。

进一步检验硫酸-苯酚显色反应的稳定性，对标准品(葡萄糖)和ASP在显色后不同时间的OD₄₉₀值进行测定，结果表明标准品和待测品(ASP)在显色后的0min～90min内OD₄₉₀无明显变化，至反应后120min时，各管OD₄₉₀值开始有所下降。说明硫酸--苯酚显色反应在90min以内显色稳定。结果见表1。

表1.硫酸—苯酚显色反应OD₄₉₀值随时间变化表管号             糖含量                            OD₄₉₀(显色后)

             /mg        0min     15min      30min     60min     90min      120min空白管           0          0        0          0         0         0          0标准管1          0.01       0.196    0.195      0.198     0.199     0.197      0.1711’                               0.01       0.197    0.200      0.199     0.196     0.209      0.176标准管2          0.02       0.246    0.248      0.249     0.249     0.247      0.2242’                               0.02       0.240    0.236      0.236     0.239     0.238      0.219标准管3          0.03       0.309    0.310      0.309     0.309     0.307      0.2933’                               0.03       0.307    0.309      0.308     0.309     0.305      0.290标准管4          0.04       0.371    0.370      0.368     0.372     0.365      0.3504’                               0.04       0.372    0.369      0.371     0.369     0.368      0.349标准管5          0.05       0.399    0.401      0.403     0.400     0.398      0.3895’                               0.05       0.397    0.400      0.398     0.396     0.394      0.386测定管1          0.02       0.224    0.222      0.221     0.223     0.217      0.2061’                               0.02       0.223    0.222      0.222     0.221     0.218      0.207测定管2          0.04       0.292    0.294      0.292     0.292     0.293      0.2732’                               0.04       0.294    0.293      0.292     0.292     0.288      0.275上表中n’为n的平行管，n＝1、2、3、4或5。2.DEAE-纤维素层析柱分离ASP：

灌制DEAE-纤维素层析柱：称取DEAE-纤维素40克，用适量去离子水润湿，缓慢将润湿的DEAE-纤维素灌入直径4.5cm的层析柱中，同时缓慢搅拌以完全除去气泡，保持DEAE-纤维素层析柱顶端呈水平。用200ml 10％的氢氧化钠过柱，再用大量蒸馏水过柱，至从层析柱中流出的蒸馏水的pH值为7.0。至此DEAE-纤维素层析柱灌制完毕。

将ASP溶液上样于DEAE-纤维素层析柱，依次以去离子水、酸性洗脱液(冰乙酸∶正丁醇∶蒸馏水＝2∶9∶17，体积比)及碱性洗脱液(10％NaOH，w/v)将ASP洗脱得三种组分ASP-1、ASP-2、ASP-3。ASP的3种分离组分经浓缩后，ASP-3溶液在滴入少量乙醇(约溶液体积的10％)即有大量沉淀，ASP-1溶液和ASP-2溶液中仍需加入终浓度为80％的无水乙醇才能完全沉淀。

3种组分60℃烘干后，ASP-1呈棕灰色粉末状，ASP-2呈深棕色块状，ASP-3呈白色块状。3种组分久置空气中不吸潮。3.ASP分离组分糖含量测定：

精密称取制得的ASP的3种分离组分ASP-1、ASP-2、ASP-3各0.05g，其余步骤同ASP糖含量的测定。将测得的待测品的OD₄₉₀值代入方程Y＝0.1426+5.08x计算，得ASP-1的糖含量均值为72.14％，ASP-2的糖含量均值为66.11％，ASP-3的糖含量均值为63.53％。4.ASP与其分离组分糖成分分析

称取ASP、ASP-1、ASP-2、ASP-3各10mg，各加入4ml 2N H₂SO4，封管，100℃水解5小时，水解液以BaCO₃中和，60℃浓缩。在距滤纸底边2.5cm处用铅笔划一直线为起点线，在距滤纸侧边1.5cm处为第一点样点，再每隔2.5cm为一点样点，用玻璃毛细管将1％标准品溶液和待测品溶液点样于各点样点，标准品和待测品在滤纸上的扩散直径需控制在0.5cm内。将滤纸底边浸入以正丁醇∶乙醇∶水＝40∶11∶19(体积比)混合而成的展开剂中，上行法层析12小时后，将滤纸用吹风吹干，均匀喷涂显色剂(邻苯二甲酸1.66g和苯胺0.93g共溶于100ml水中，再以正丁醇饱和)，用吹风加热滤纸至各糖点显色。

ASP、ASP-1、ASP-2、ASP-3被水解为单糖后，经过纸色谱展开，可见各标准品在滤纸上的移动距离不同，各显色点的直径均在1cm内。实验结果表明ASP主要含有D-半乳糖和D-阿拉伯糖，ASP-1主要含有D-阿拉伯糖和α-葡萄糖醛酸，ASP-2主要含D-阿拉伯糖，ASP-3主要含D-半乳糖和D-阿拉伯糖。各样品的R_F值见表2。表2.样品R_F值标准品             R_F值     标准品          R_F值      待测品         R_F值D-核糖             0.16      α-葡萄糖酚醛   0.17       ASP            0.10/0.31D-半乳糖           0.10      D-木糖          0.28       ASP-1          0.17/0.31L-鼠李糖           0.37      D-阿拉伯糖      0.31       ASP-2          0.31D-果糖             0.23      D-葡萄糖        0.14       ASP-3          0.10/0.315.试剂和材料：

无水葡萄糖，北京车华化学试剂厂；D-核糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-果糖、α-葡萄糖醛酸、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖，上海化学试剂三厂；所用试剂均为分析纯。孔径25μm半透膜，Sigma公司，内径1.0mm的玻璃毛细管，华西医科大学仪器厂；中速定性分析滤纸，杭州富阳特种纸厂。