公开/公告号CN1439647A
专利类型发明专利
公开/公告日2003-09-03
原文格式PDF
申请/专利权人 本元正阳基因技术股份有限公司;
申请/专利号CN02103946.1
发明设计人 潘速跃;
申请日2002-02-21
分类号C07H21/04;C12N9/02;C12N15/53;C12N15/63;C12N15/85;C12P19/34;C12P21/02;
代理机构
代理人
地址 100176 北京市北京经济技术开发区永昌中路6号
入库时间 2023-12-17 14:52:52
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-04-16
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07H21/04 授权公告日:20070314 终止日期:20130221 申请日:20020221
专利权的终止
2007-03-14
授权
授权
2005-02-09
实质审查的生效
实质审查的生效
2003-09-03
公开
公开
发明领域
本发明属于生物技术领域,描述了一种错义突变的二氢叶酸还原酶基因的序列和由此多核苷酸序列编码的氨基酸序列,以及利用此多核甘酸序列和氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达的方法。
背景技术
哺乳动物细胞表达系统的表达载体一般都含有能筛选出外源基因已整合的选择标记或带有选择性增加拷贝数的扩增系统。二氢叶酸还原酶是目前最常用的选择性扩增系统。二氢叶酸还原酶能将叶酸催化生成四氢叶酸。而四氢叶酸是嘌呤、单磷酸胸苷和甘氨酸的生物合成所必需的。氨甲喋呤可以与二氢叶酸还原酶结合而抑制它的活性导致细胞的死亡。当含有二氢叶酸还原酶基因的细胞在逐步升高的氨甲喋呤浓度的培养基中生长时,二氢叶酸还原酶的基因可以得到同步扩增。部分能抵抗高浓度氨甲喋呤的细胞二氢叶酸还原酶的基因拷贝数可以达到数千,二氢叶酸还原酶的表达量可以提高数千倍。因此,通过氨甲蝶呤的加压选择来使得二氢叶酸还原酶和要表达的目的基因共同扩增,从而提高目的基因的表达水平是目前最常用的基因扩增方法(Hansjrg Hauser等.Mammalian cell biotechnologyin protein production.Berlin;New York:de Gruyter,1997)。
由于二氢叶酸还原酶扩增系统是通过氨甲喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制作用来对要表达的目的基因进行选择和扩增的,因而二氢叶酸还原酶的活性和表达水平对筛选的工程细胞的表达产量有重要的影响。通过使用弱启动子、有意损害Kozak的保守序列能提高哺乳动物表达系统的表达水平(李育阳.基因表达技术.北京:科学出版社,2001,139-158)。提示通过有意的降低二氢叶酸还原酶的活性和表达水平,有助于筛选到要表达目的基因的高表达细胞株。
发明详述
本发明公开了一种错义突变二氢叶酸还原酶基因的多核苷酸序列以及相应的氨基酸序列。
该错义突变的二氢叶酸还原酶基因是通过PCR随机突变的方法获得的,其编码的蛋白质在第77位氨基酸由丝氨酸转换为苏氨酸,其全序列见SEQ ID NO2。
由于氨基酸序列的改变可能导致了二氢叶酸还原酸蛋白质结构的改变。利用该突变的二氢叶酸还原酶基因构建的白介素10表达载体,转染CHO DHFR-细胞撤除其依赖条件HT(次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷混合液)后,筛选的混合细胞和单克隆细胞其白介素10的表达产量均较野生型的二氢叶酸还原酶提高3倍左右。提示二氢叶酸还原酶第77位氨基酸由丝氨酸转换为苏氨酸可能降低了二氢叶酸还原酶的活性。
本发明公开了由编码这种错义突变氨基酸的基因进行哺乳动物细胞表达的方法。本发明中提供的用由编码这种错义突变氨基酸的基因进行哺乳动物细胞表达的方法是指利用由编码这种错义突变氨基酸的基因作为选择标记和扩增系统来选择转染的哺乳动物细胞,和通过氨甲喋呤来提高细胞表达水平的方法。利用这种突变的二氢叶酸还原酶基因构建的表达载体可以将要表达的目的基因和该突变基因共同构建到一个载体上对细胞进行转染,也可以是将它们分别构建到不同的载体上对细胞进行共转染。
附图说明
下列附图用于说明发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1为利用三片段定向连接的方法构建的突变基因筛选表达质粒图谱,EF1α/HTLV为启动子,hIL10为白介素10,IRES为内部核糖体进入位点,PCR指利用DiversifyTM PCR Random Mutagenesis Kit,以引物1和引物2进行PCR扩增的DNA片段。
图2、图3分别为为利用引物1和引物2分别扩增野生型的二氢叶酸还原酶基因和筛选出来突变的二氢叶酸还原酶基因,分别构建表达质粒A和表达质粒B的质粒图谱。
下面结合具体实施例,进一步阐明本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,均按照常规条件如:Sambrook等,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:二氢叶酸还原酶突变基因的构建和筛选
利用DiversifyTM PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech公司)构建二氢叶酸还原酶突变基因。PCR条件如下:反应体积,50μl;去离子水31μl,10×TITANIUM Taq Buffer 5μl,MnSO44μl,dGTP(2mM)5μl,50×DiversifydNTP Mix 1μl,引物1(10μM,序列见SEQ ID NO3)1μl,引物2(10μM,序列见SEQ ID NO4)1μl,二氢叶酸还原酶基因模板(1ng/μl),TITANIUMTaq酶1μl;热循环:94℃,30秒;94℃ 30秒,56℃ 30秒,68℃ 1分钟,30循环;68℃,1分钟。
PCR扩增后割胶纯化回收610bp的扩增产物,以BamHI和EcoRI酶切,利用三片段定向连接的方法构建突变基因筛选表达质粒。该筛选表达质粒的启动子为EF-1α/eIF4g杂合启动子,表达质粒上含白介质10基因,白介质10基因通过IRES与待筛选的二氢叶酸还原酶基因片段连接在一起。将以上连接反应液转化DH5α细胞,并直接将转化菌液摇菌,提取质粒。
将以上提取的质粒利用Lipofectamine(GIBCO公司)转染CHO DHFR-细胞,转染48小时待细胞汇合后,按1/4、1/8和1/12在六孔板中传代,并撤除HT混合液。培养基为α-MEM,内加10%透析血清(Hyclone公司)。
维持培养两周后利用铺琼脂糖的方法挑取单克隆细胞至96孔板,待细胞在96孔板中生长汇合至80~100%后,取培养液用ELISA的方法测白介素10的表达浓度。共挑选单克隆细胞156个,表达水平最高的细胞株表达量为300ng/106个细胞·24小时。
用酚-氯仿的方法提取表达水平最高细胞株的染色体DNA,并以引物1(序列见SEQ ID NO3)和引物2(序列见SEQ ID NO4)进行常规PCR扩增,将扩增产物割胶纯化后测序,测序发现二氢叶酸还原酶基因在+230位的碱基由G转换为C,核苷酸序列结果见SEQ ID NO1。
实施例2:CHO细胞表达白介素10
利用引物1和引物2分别扩增野生型的二氢叶酸还原酶基因和筛选出来突变的二氢叶酸还原酶基因,分别构建表达质粒A和B(构建方法和质粒图谱参考实施例1)。按实施方案1中的方法分别转染CHO DHFR-,撤除HT后分别检测混合细胞和挑取的单克隆细胞的白介素10的表达水平。表达质粒A撤除HT后混合细胞表达白介素10表达量为36ng/106·24小时,表达质粒B撤除HT后混合细胞表达白介素10表达量为124ng/106·24小时。表达质粒A和B各挑取60个单克隆细胞,表达质粒A的单克隆细胞株最高表达量为108ng/106·24小时,表达质粒B的单克隆细胞株最高表达量为380ng/106·24小时。提示利用本发明中获得的错义突变二氢叶酸还原酶基因筛选出的细胞表达产量高于野生型的二氢叶酸还原酶基因,目的基因的表达产量大约提高3倍。
序 列 表
(1)一般信息:
发明名称:一种错义突变的二氢叶酸还原酶及其编码序列
序列数目:4
(2)SEQ ID NO1的信息:
(I)序列特征:
(A)类型:核酸
(B)长度:564个碱基
(C)链性:双链
(D)拓扑结构;线性
(II)分子类型:cDNA
(III)序列描述:
atggttcgaccattgaactgcatcgtcgccgtgtcccaagatatggggattggcaagaacggagacctacc
ctggcctccgctcaggaacgagttcaagtacttccaaagaatgaccacaacctcttcagtggaaggtaaac
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agtgacacgtttttcccagaaattgatttggggaaatataaacttctcccagaatacccaggcgtcctctctga
ggtccaggaggaaaaaggcatcaagtataagtttgaagtctacgagaagaaagactaa
(3)SEQ ID NO2的信息:
(I)序列特征:
(A)类型:氨基酸
(B)长度:187个氨基酸
(D)拓扑结构;线性
(II)分子类型:蛋白质
(III)序列描述:
M V R P L N C I V A V S Q D M G I G K N G D L P W P P L R N E F K Y F Q R MT T T S S V E G K Q N L V I M G R K T W F S I P E K N R P L K D R I N I V L T R E LK E P P R G A H F L A K S L D D A L R L I E Q P E L A S K V D M V W I V G G S S VY Q E A M N Q P G H L R L F V T R I M Q E F E S D T F F P E I D L G K Y K L L P EY P G V L S E V Q E E K G I K Y K F E V Y E K K D
(4)SEQ ID NO3的信息
(I)序列特征:
(A)类型:核酸
(B)长度:27个碱基
(C)链性:单链
(D)拓扑结构;线性
(II)分子类型:寡核苷酸
(III)序列描述:
ATTGGATCCATGGTTCGACCATTGAACT
(4)SEQ ID NO4的信息
(I)序列特征:
(A)类型:核酸
(B)长度:29个碱基
(C)链性:单链
(D)拓扑结构;线性
(II)分子类型:寡核苷酸
(III)序列描述:
TCAGAATTCTGCATAGCTTTAGGAGGGGA
机译: 增强哺乳动物细胞中扩增靶基因表达的方法,并试剂盒中哺乳动物细胞中靶基因表达的表达
机译: 通过同源重组和稳定转染重组DNA构建体的同源基因细胞,改变哺乳动物细胞内源g-csf基因表达并整合到细胞基因组中的DNA构建体,一种改变表达的方法
机译: 预防或治疗哺乳动物个体中的高脂血症和由高脂血症引起的心血管疾病或病症的一种或多种症状,控制哺乳动物个体中的高脂血症,治疗心血管疾病的一种或多种症状,调节ldlr表达的方法为了调节哺乳动物个体中的ldlr的表达和调节哺乳动物个体中erk的活化以及降低哺乳动物个体中的胆固醇,预防或减轻高脂血症的组合物,以治疗或预防哺乳动物个体的高脂血症增加ldlr在哺乳动物个体以及哺乳动物细胞,组织,器官或个体中的表达,以提高ldlr在哺乳动物细胞,组织,器官或个体中的稳定性,并提高ldlr在细胞,组织中的稳定性,哺乳动物器官或个体