一种检验高产AmpC酶致病菌的纸片和制作及其检验方法

摘要

本发明公开了一种检验高产AmpC酶致病菌的纸片及其制作和检验方法。其中检验纸片是以氯唑西林为酶抑制剂，以头孢他啶和头孢噻肟为药敏指示剂设计而成的头孢他啶/氯唑西林和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片。其制作方法是，先用灭菌生理盐水将氯唑西林配制成浓度为10mg/ml的溶液后，再取5μl氯唑西林溶液分别加入标准头孢他啶纸片和标准头孢噻肟纸片的中心，然后将其放于超净台中晾干后置－20℃冰箱内保存。使用时，将标准纸片和复合纸片分别贴于同一接种好受检菌的MH平皿上，以复合纸片与相应标准纸片的抑菌环直径值之差判定受检菌是否为高产AmpC酶菌株。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检验致病菌的纸片和制作及其检验方法，属于医学检验技术领域。

背景技术

众所周知，抗生素是临床治疗感染性疾病的主要和必要手段，其中以β-内酰胺类抗生素的应用最为广泛。然而致病菌对这类药物的耐药性已成为当前临床抗感染治疗中甚为棘手的一个问题。现代医学研究证明，造成这一问题的主要原因是致病菌代谢产物β-内酰胺酶所致。近年来，随着第三代头孢菌素的广泛应用，以阴沟肠杆菌为代表的大多数革兰氏阴性致病菌，如各种肠杆菌科细菌、不动杆菌、绿脓假单胞菌等代谢中产生的高水平AmpC酶，均导致细菌对除第四代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素外的几乎所有β-内酰胺抗生素产生耐药。因此，发明一种简便、快速、准确检出高产AmpC酶致病菌的新技术，对于正确选择抗菌药物，提高临床抗感染治疗效果是一项极为重要的工作，也是一项具有挑战性的工作。

目前，用于检验致病菌是否为高产AmpC酶菌株必须结合等电聚焦电泳、酶抑制试验和β-内酰胺酶活性测定等技术，它们通常通过提取受检菌的β-内酰胺酶对AmpC酶进行定量测定。这些方法不仅需要复杂的实验设备，经费开支大，操作繁琐、耗时、费力，而且缺乏统一的技术规范和结果判断标准，几乎不可能在临床推广应用。对此，J Clin Microbiol2000；38(5)：1791-1796公开了一种头孢西丁三维试验，其简化了检测程序，检测结果也比较容易判断，但仍需提取受检菌的β-内酰胺酶，技术难度和操作程序仍较大、较繁琐，难以在大多数临床实验室推广应用。《中华检验医学》杂志2002；25(2)：88-90公开了一种根据受检菌的常规药敏试验结果推测其是否为高产AmpC酶菌株的方法。但随着致病菌耐药机制的日益复杂化和多样化，特别是由于超广谱β-内酰胺酶的蔓延，这种方法的准确性已越来越不可靠。另外，《中华检验医学》杂志2001；24(4)：211-213介绍了一种用双抑制剂扩散协同法检测产AmpC酶致病菌株的技术，但这种方法在检测同时高产AmpC酶又产超广谱β-内酰胺酶菌株时的准确率尚不肯定。

发明内容

本发明的任务在于提供一种制作容易，价格低廉，易于推广，操作简单，结果可靠的检验高产AmpC酶致病菌的复合纸片。

本发明的任务还在于提供一种检验高产AmpC酶致病菌复合纸片的制作方法。

本发明的另一任务还在于提供一种用复合纸片检验高产AmpC酶致病菌的方法。

本发明的目的是这样实现的。检验高产AmpC酶致病菌的纸片以氯唑西林为酶抑制剂，以头孢他啶和头孢噻肟为药敏指示剂设计而成。检验纸片为头孢他啶/氯唑西林复合纸片和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片。

本发明检验高产AmpC酶致病菌纸片的制作方法，先用灭菌蒸馏水将氯唑西林配制成浓度为10mg/ml的溶液后，再取5μl氯唑西林溶液分别加入标准头孢他啶纸片和标准头孢噻肟纸片的中心，即获得头孢他啶/氯唑西林复合纸片和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片，然后将其放于超净台中晾干后，置-20℃冰箱内保存备用。

本发明检验高产AmpC酶致病菌的方法，将标准头孢他啶纸片、标准头孢噻肟纸片和头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片分别贴于同一接种好受检菌的MH平皿上，以头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片对同一受检菌株的抑菌环直径值之差和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片对同一受检菌株的抑菌环直径值之差判定受检菌是否为高产AmpC酶菌株。

本发明检验高产AmpC酶致病菌的具体判断标准为：头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片的抑菌环直径值之差超过5mm(含5mm)，或头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差超过5mm(含5mm)，则判定受检菌为阳性，即受检菌株为高产AmpC酶菌株，否则判定受检菌为阴性，即受检菌为非高产AmpC酶菌株。

为表明本发明头孢他啶/氯唑西林复合纸片和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片对高产AmpC酶菌株检验结果的可靠性，实验室对高产AmpC酶阴沟肠杆菌标准菌株029M、非高产AmpC酶阴沟肠杆菌标准菌株029和临床分离出的106株阴沟肠杆菌分别进行了检测，结果如下：

检测结果1。实验室对高产AmpC酶阴沟肠杆菌标准株029M进行检测，结果头孢他啶/氯唑西林复合纸片对高产AmpC酶阴沟肠杆菌标准株029M的抑菌环直径较标准头孢他啶纸片的抑菌环直径增大了6mm，头孢噻肟/氯唑西林复合纸片对高产AmpC酶阴沟肠杆菌标准株029M的抑菌环直径较标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径也增大了6mm。按以上给出的本发明头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片或头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差超过5mm(含5mm)受检菌为阳性的判定标准，受检阴沟肠杆菌标准株029M为高产AmpC酶菌株；头孢他啶/氯唑西林复合纸片对诱导产AmpC酶阴沟肠杆菌标准株029的抑菌环直径较标准头孢他啶纸片的抑菌环直径增大了0mm，头孢噻肟/氯唑西林复合纸片对诱导产AmpC酶阴沟肠杆菌标准株029的抑菌环直径较标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径增大了1mm。按以上给出的本发明头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片或头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差小于5mm受检菌为阴性的判定标准，受试诱导产AmpC酶的阴沟肠杆菌标准株029为非高产AmpC酶菌株。

检测结果2。对临床分离出的106株阴沟肠杆菌分别用头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片、标准头孢他啶纸片、标准头孢噻肟纸片进行常规纸片药敏试验，并提取β-内酰胺酶进行头孢西丁三维试验，结果见附表。

从附表可以看出，对临床分离出的106株阴沟肠杆菌，头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片和标准头孢他啶纸片、标准头孢噻肟纸片检验为阳性的有31株，其中12株同时产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶，2株同时产SHV-12型超广谱β-内酰胺酶，75株为阴性。其与头孢西丁三维试验的结果也完全一致，符合率为100％。

本发明的优点：

1、本发明检验高产AmpC酶致病菌的复合纸片结果可靠、经济实用。

2、本发明检验高产AmpC酶致病菌株的复合纸片制作容易，只需将氯唑西林用蒸馏水配制成一定浓度的溶液，再将其分别加入标准头孢他啶和标准头孢噻肟纸片的中心即可制成头孢他啶/氯唑西林复合纸片和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片。

3、本发明检验高产AmpC酶致病菌株的复合纸片，使用方法简单，操作容易，只需计算其与相应标准检验纸片的抑菌环直径值之差即可作出准确判断。

具体实施方式

本发明头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片以氯唑西林为酶抑制剂，以头孢他啶和头孢噻肟为药敏指示剂设计而成。其制作方法是：先用灭菌蒸馏水将氯唑西林配制成浓度为10mg/ml的溶液，以微量加样器取5μl氯唑西林溶液分别加入30μg/片的标准头孢他啶和标准头孢噻肟纸片的中心，即可制成头孢他啶/氯唑西林复合纸片(30μg/50μg)和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片(30μg/50μg)，再将其放于超净台中晾干后，置-20℃/冰箱中保存备用。

本发明检验高产AmpC酶致病菌株的操作方法及结果判断标准。纸片药敏试验常规操作按NCCLS(美国国家临床实验室标准化委员会)推荐的方法进行。将标准头孢他啶纸片、标准头孢噻肟纸片和头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片分别贴于同一接种好受检菌的MH平皿上，常规过夜培养后，测定头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片、标准头孢他啶纸片、标准头孢噻肟纸片对同一受检菌株的抑菌环直径。然后分别计算头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片的抑菌环直径值之差，以及头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差。如果头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片的抑菌环直径值之差大于5mm(含5mm)，或头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差大于5mm(含5mm)，则受检菌为高产AmpC酶菌株；反之，如果头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片的抑菌环直径值之差小于5mm，而且头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差也小于5mm，则受检菌为非高产AmpC酶菌株。附表：

  编号  菌株号    纸片抑菌环直径(mm)  三维试验    ESBL    等电点  CAZ  CAZ/CLO  CTX    CTX/CLO    1    103741    13    15    19    20    -    SHIV-12    5.4，8.2    2    203173    32    33    33    34    -    3    203893    6    14    6    15    +    7.8    4    206257    26    26    28    28    -    5    201564    6    18    6    16    +    7.8    6    202810    29    29    31    31    -    7    204087    30    30    32    32    -    8    101370    26    26    27    27    -    9    205305    27    28    31    32    -    10    102661    27    27    30    30    -    11    205195    30    30    32    32    -    12    200058    19    20    6    7    -    CTX-M-3    5.4，8.4    13    103679    27    28    28    29    -    14    201404    27    28    28    28    -    15    207100    29    29    30    30    -    16    101887    28    28    31    31    -    17    204966    24    24    13    13    -    CTX-M-3    5 4，8.4    18    102468    6    12    6    9    +    CTX-M-3    5.4，8.3，8.4    19    103670    26    26    28    29    -    20    103394    13    14    18    18    -    SHV-12    5.4，8.2    21    101758    27    27    30    30    -    22    100613    30    30    32    32    -  编号  菌株号    纸片抑菌环直径(mm)  三维试验    ESBL    等电点    CAZ  CAZ/CLO   CTX    CTX/CLO    23    103063    6    12    6    9    +    CTX-M-3    5.4，8.3，8.4    24    100447    30    30    34    34    -    25    206054    27    27    30    30    -    26    102728    13    20    14    19    +    8.3    27    202302    29    29    31    31    -    28    201784    26    26    27    27    -    29    204524    27    27    30    30    -    30    104911    6    13    6    10    +    CTX-M-3    5.4，7.8，8.4    31    103420    29    29    30    31    -    32    103392    30    30    32    32    -    33    205336    6    14    6    11    +    8.5    34    202387    27    27    30    30    -    35    102405    26    26    29    30    -    36    204886    27    27    30    31    -    37    203956    27    27    30    30    -    38    102691    7    12    6    11    +    CTX-M-3    5.4，8.3，8.4    39    200151    29    29    30    30    -    40    101048    6    15    6    13    +    7.8    41    102166    28    28    32    32    -    42    101767    30    30    32    32    -    43    100135    29    29    31    32    -    44    101731    13    14    20    21    -    SHV-12    8.2  编号  菌株号    纸片抑菌环直径(mm)  三维试验    ESBL    等电点  CAZ  CAZ/CLO  CTX    CTX/CLO    45    202865    6    11    6    8    +    CTX-M-3    7.8，8.4    46    103605    27    27    27    27    -    47    102702    27    27    29    29    -    48    201128    6    6    9    14    +    SHV-12    5.4，7.8，8.2    49    100995    6    18    6    17    +    8.5    50    209029    14    14    19    20    -    SHV-12    8.2    51    101928    31    31    32    32    -    52    103854    30    30    28    28    -    53    100057    34    34    31    31    -    54    102510    30    30    26    26    -    55    201861    28    28    31    31    -    56    103597    28    28    27    27    -    57    984535    6    14    6    14    +    7.8    58    985384    16    16    6    6    -    CTX-M-3    5.4，8.4    59    986466    28    28    30    30    -    60    987496    6    6    14    15    -    SHV-12    8.2    61    135413    6    12    6    11    +    7.8    62    130769    6    11    6    7    +    CTX-M-3    5.4，8.4，8.5    63    136501    19    19    6    6    -    CTX-M-3    8.4    64    130125    22    22    12    12    -    CTX-M-3    5.4，8.4    65    136488    30    30    32    32    -    66    133105    25    26    27    28    -  编号  菌株号    纸片抑菌环直径(mm)  三维试验    ESBL    等电点    CAZ  CAZ/CLO    CTX    CTX/CLO    67    132308    27    27    30    30    -    68    133036    27    27    29    29    -    69    135083    6    13    6    14    +    5.4，7.8    70    135179    26    26    29    29    -    71    135302    15    20    13    18    +    5.4，8.3    72    135990    25    25    27    28    -    73    136490    6    6    9    14    +    8.3    74    985733    6    13    6    11    +    7.8    75    136509    24    25    26    27    -    76    987262    27    26    26    27    -    77    134470    25    26    26    27    -    78    107481    10    16    6    16    +    7.8    79    132221    28    28    30    30    -    80    986078    30    30    26    26    -    81    129352    28    28    28    28    -    82    986131    27    27    30    30    -    83    986140    28    28    27    27    -    84    133886    24    24    28    28    -    85    987862    26    26    28    28    -    86    105349    6    12    6    9    +    CTX-M-3    5.4，7.8，8.4    87    105208    6    11    6    6    +    CTX-M-3    5.4，7.8，8.4    88    101967    6    6    10    16    +    SHV-12    5.4，7.8，8.2  编号  菌株号         纸片抑菌环直径(mm)  三维试验    ESBL    等电点    CAZ  CAZ/CL0  CTX    CTX/CL0    89    105285    25    26    28    28    -    90    207488    22    25    20    25    +    5.4，8.5    91    105716    6    12    6    7    +    CTX-M-3    7.8，8.4    92    105597    6    11    6    6    +    CTX-M-3    7.8，8.4    93    208192    14    20    8    18    +    5.4，8.8    94    208620    25    25    27    28    -    95    104367    6    17    6    17    +    7.8    96    209952    25    25    16    16    -    CTX-M-3    8.4    97    105661    6    13    6    8    +    CTX-M-3    5.4，7.8，8.4    98    105545    6    11    6    6    +    CTX-M-3    5.4，7.8，8.4    99    105334    26    26    32    32    -    100    209262    30    30    27    27    -    101    987964    14    18    12    17    +    7.8    102    986069    30    30    27    27    -    103    134031    24    24    27    28    -    104    136313    24    24    25    25    -    105    129487    25    25    28    28    -    106    104987    24    24    30    30    -    -    029M    10    16    10    16    +    8.8    029    29    29    30    31    -    -注：表中CAZ为头孢他啶；CAZ/CLO为头孢他啶/氯唑西林；CTX为头孢噻肟；CTX/CL0为头孢噻肟/氯唑西林；ESBL为超广谱β-内酰胺酶