从三七生粉提取分离三七皂甙R1、人参皂甙Re、三七素的方法

摘要

一种从三七生粉提取分离三七皂甙R1、人参皂甙Re、三七素的方法，它包括以下步骤：三七生粉以甲醇浸提，得甲醇提取液和残渣，将甲醇提取液浓缩干燥，获得甲醇提取物，甲醇提取物加水，并以石油醚萃取，取水相，以正丁醇萃取，得正丁醇相，蒸干后，得三七皂甙粗提取物，该皂甙粗提取物分离得三七皂甙R1和人参皂甙Re；甲醇提取后三七生粉残渣以水提取，得到水提取物，水提取物以正丁醇萃取，将水层冷冻干燥得三七素粗提取物，三七素粗提物进一步分离纯化得三七，本方法操作简单、新颖。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从三七生粉提取分离三七皂甙R₁、人参皂甙Re、三七素的方法。

背景技术

三七为我国的一种传统名贵中药材，它具有止血化瘀、消肿止痛、活跌打损伤等作用，近年来的药理研究表明，三七还具有增加冠脉血流量，降低心肌耗氧量和动脉血压的作用，用于治疗冠心病、心绞痛获得显著疗效。三七中的主要活性成分皂甙类，其中三七皂甙R₁为其特有成分，三七总皂甙在临床上已用于治疗偏头痛、镇静、安眠及消炎解热等，三七皂甙在结构上为达玛烷四环三萜型皂甙，另外，三七中还含一种活性成分为三七素，研究表明，它是三七中的主要止血成分，其结构为β-N-乙二酸-酰基-L-α、β-二氨基丙酸，到目前为止，在市场上几乎找不到三七皂甙和三七素纯品和对照品，而且由于三七皂甙的特殊化学特性，无紫外吸收，而三七素为一种特殊的氨基酸，对其提取分离方法的研究开发具有较高的经济价值和学术价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种从三七生粉提取分离三七皂甙R₁、人参皂甙Re、三七素的方法，该方法操作简单、新颖。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：一种从三七生粉提取分离三七皂甙R₁、人参皂甙Re、三七素的方法，其特征在于：它包括以下步骤：三七生粉以甲醇浸提，得甲醇提取液和残渣，将甲醇提取液浓缩干燥，获得甲醇提取物，甲醇提取物加水，并以石油醚萃取，取水相，以正丁醇萃取，得正丁醇相，蒸干后，得三七皂甙粗提取物，该皂甙粗提取物分离得三七皂甙R₁和人参皂甙Re；甲醇提取后三七生粉残渣以水提取，得到水提取物，水提取物以正丁醇萃取，将水层冷冻干燥得三七素粗提取物，三七素粗提取物进一步分离纯化得三七。

附图说明

图1为本发明中利用HSCCC第一步分离得到的三七皂甙R₁和人参皂甙Re混合物的薄层色谱图

图2为图1中混合物的高效液相色谱图

图3为发明中利用HSCCC第二步分离得到的两种皂甙的薄层色谱图

图4A、图4B为第二步HSCCC分离得到的一种皂甙液相色谱图(203nm)(16管、15管)

图5A、图5B为第二步HSCCC分离得到的另一种皂甙色谱图(203nm)(17管、18管)

具体实施方式

实施例1

一、称取三七粉100g加入500ml甲醇，浸泡36小时，过滤后，将滤液蒸干得甲醇提取物。将此甲醇提取物用蒸馏水300ml溶解后，先用等体积的石油醚(沸程为60-90℃)萃取两次，弃去上相，取下层水相用等体积的正丁醇萃取两次，将所得正丁醇相合并蒸干，得10.2g三七皂甙粗提物。

二、利用高速逆流色谱(HSCCC)第一步分离得到三七皂甙R₁、人参皂甙Re的混合物。

1、采用氯仿、甲醇、丙醇、水体系，其中氯仿∶甲醇∶丙醇∶水＝6∶6∶1∶4(体积比)

取三七皂甙粗提物，其上样量200mg，柱体积200ml，主机转数800rpm，上相作固定相，下相作流动相，流动相流速2ml/min。

2、操作步骤：按各溶剂体积比配制溶剂体系，在分液漏斗中静置分层，分出上下相，上相作固定相、下相作流动相，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进样。(该分离采用北京市新技术应用研究所研制的逆流色谱仪完成。)

由于三七皂甙R₁及人参皂甙Re没有紫外吸收，所以无法使用高速逆流色谱仪(HSCCC)所配的常规紫外检测器检测出峰及分离情况。因此，本实验中采用自动集分收集器，设定时间，分段收集高速逆流色谱仪上样后洗脱下的各级分。然后以薄层色谱检测分析各吸分管，采用与药典相同的展开条件，通过与药典中提供谱图比较。收集含有三七皂甙R₁和人参皂甙Re的级分(25-38管)其薄层展开谱图如图1所示。

通过以上分离，可得三七皂甙R₁及人参皂甙Re混合物13mg。其高效液相色谱分析谱见图2所示。

三、用高速逆流色谱仪将上述分离得到的混合物进行进一步分离(第二步分离)

1、采用乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3体积比，上样量为第一步多次分离所得产物共40mg，柱体积200ml，主机转数800rpm。上相作固定相，下相作流动相，流动相流速2ml/min。

2、操作步骤同上，以集分收集器收集，洗脱的各级分经薄层色谱检测分析并与药典中提供谱图比较，保留含有三七皂甙R₁与人参皂甙Re的级分(15-18)管，其薄层展开图见图3所示。

3、经高效液相色谱检测分析第15至16管为一种皂甙(24mg)见图4A、图4B，第17-18管为另一皂甙(13mg)见图5A、图5B，且两者完全分离。

实施例2(本实施例系从三七生粉甲醇提取后的剩余残渣中提取三七素的

实施例)。

提取步骤：三七生粉经甲醇提取后的残渣，用水提取，所得水提取物，经正丁醇萃取，水相经冷冻干燥即可得三七素粗提物，100g三七生粉可得三七素粗提物约10g，经氨基酸分析其中主要含三七素和精氨酸等几种氨基酸成分。三七素粗提取物以Sephadex LH-20的凝胶色谱柱分离，以柱填料的1/10的比例上样，去离子水洗脱，用馏分收集器收集各级分，分别点样，用茚三酮显色法分析，将能与茚三酮反应，呈显紫红色的级分，再分别用纸色谱点样，茚三酮显色分析。合并含三七素的级分经冷冻干燥得中间产物。该产物经过CMSephadex C-25再次层析分离，采用同样的方法分析，收集目标级分，冷冻干燥。必要时，可进行重复的CM-Sephadex C25柱分离或重结晶，即可得到三七素纯品。

三七素的分析方法：

1、氨基酸分析仪自动分析法

层析柱：4.6×150mm阳离子交换树脂

缓冲液流速：0.425ml/min

柱温：50℃，进样量：50μl，分析时间50min。

2、纸层析一茚三酮显色法

支撑物：层析滤纸

展开剂：正丁醇-乙酸-水-无水乙醇(4∶1∶2∶1)

显色法：喷雾1％茚三酮水溶液后，加热3分钟即显紫红色，此法为氨基酸的特征显色方法，三七素的位移值Rf＝0.1。

本发明优点：本发明提供的方法中可分别得到纯化的产品，且方法简便，所得纯品经过认定可作为质量控制的标准品或参考物，很有实用价值。