建立天然药物药理基因表达差异谱的方法并应用于药物筛选

摘要

一种建立天然药物药理基因表达差异谱的方法，它克服了现有技术中从分子学水平只能对非系统类疾病进行研究的缺陷。本发明是在建立动物模型之后，分离两组动物模型的肝脏、肾脏、脾脏、心肌、肺叶、脑组织、动静脉大血管、横纹肌、胰腺、肠组织和胃组织，通过基因芯片技术寻找相关疾病的靶组织，最后再通过基因芯片技术建立天然药物药理基因表达差异谱。用本发明可以从基因表达的分子学水平阐明各种疾病致病的机理。可以通过本发明进行天然药物药理的研究，从而进行天然药物新药的筛选。

说明书

技术领域：本发明涉及一种建立基因表达差异谱的方法，特别是建立一种天然药物药理基因表达差异谱的方法并应用于药物筛选。

背景技术：基因表达谱是指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库，大规律cDNA测序，收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体，描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息，这样编制成的数据表就称为基因表达谱。近年来，人们相继开展了一系列大规模基因表达检测技术，人们已经能定性、定量且大规模地检测基因的表达产物mRNA，并绘制基因表达谱。

在现有技术中，基因表达谱与药物治疗机理无关。现行中药的作用机理研究中，所用的常规方法皆为西药的药理研究方法。其特点是单一分子针对某种单一病机，或称单分子针对单靶点。而中药大多是多成分组成的复方药物，其药理作用是多靶点。显然用常规的药理学方法来研究中药是极不科学和合理，

在《药学学报》1998，33(11)：876～879“药物筛选的发展与现状”中报道：人类靠自身试验进行药物筛选，受到多种因素的限制，特别是毒性反应是用人体筛选药物过程中很难避免的巨大困难。因此，使用动物进行药物筛选就被人们所采用，古代文献中就有用动物进行药物毒性观察的大量记载。但人类有目的、有计划地应用动物进行药物筛选，是现代医学发展的结果。实验动物的应用，使药物研究产生又一次飞跃，发现了大量新型药物，如抗高血压药和其它心血管系统药物的大量发现，就与应用动物进行筛选分不开的。直到本世纪70年代中期，动物实验一直是药物筛选的基本方法。但由于动物实验需要时间长、劳动强度大、操作技术要求高、受试样品需要量大(约5g)等因素的限制，因而发展缓慢，未能进行大规模筛选。而天然药物组成复杂，尤其是中药无法在分子水平进行药理研究。

发明内容：本发明的目的正是为了克服上述现有技术中的不足之处，提供将祖国将传统中医理论和现代生物分子知识紧密相结合，从而建立一种天然药物药理基因表达差异谱的方法并应用于药物筛选。

为达到上述目的，本发明提供了的方法包括如下步骤：

(1)建立两组动物模型：一组为正常组，一组为疾病模型组；

(2)寻找疾病相关靶组织：分离两组动物模型的肝脏、肾脏、脾脏、心肌、肺叶、脑组织、动静脉大血管、横纹肌、胰腺、肠组织和胃组织，提取两组动物组织中的总RNA，逆转录，制备探针，杂交，芯片扫描，数据分析，凡疾病模型组与正常组相同组织的基因表达无差异的组织剔除，基因表达有差异的组织即为疾病相关靶组织；

(3)建立天然药物药理基因表达差异谱：将待测天然药物按方剂的高剂量，中剂量和低剂量，分三组给疾病动物模型组，给药形成三个剂量的“疾病给药”组，将疾病动物模型给等容量生理盐水形成“疾病对照”组，将正常动物模型给等容量生理盐水形成“正常对照”组，常规疗程后，分离上述五个组的疾病相关靶组织，提取RNA，逆转录，制备探针，杂交，芯片扫描，数据分析；依据正常对照-疾病对照-疾病给药三种情况下高剂量、中剂量或低剂量的，在疾病相关靶组织中，疾病相关基因的表达差异而形成的图谱即为天然药物药理基因表达差异谱。

本发明能将所建立的天然药物药理基因表达差异谱应用于天然药物药理的研究和天然药物的筛选。

本发明的优点是：

1、可以对所用病症从基因表达的分子学水平阐明各种疾病致病的机理。

2、可以进行天然药物药理的研究。克服了现行中药的作用机理研究中，只能用西药的药理研究方法。而又无法将西药的单一分子针对某种单一病机，或称单分子针对单靶点应用于解决中药大多是多成分组成的复方药物，其药理作用是多靶点的问题。

3、可以通过本发明进行天然药物药理的研究，当众多异常基因表达在天然药物的作用下趋于正常表达时，该天然药物就显然是有疗效的。从而进行天然药物新药的筛选。药理学研究不但是药物作用机理的研究，同时也是药物筛选的依据及方法。

4、利用已知药物(疗效确切的药物)建立的药理基因表达差异谱，可知道疗效与靶组织中相关基因表达的定性、定量关系，利用此关系就可以对待筛药物有无疗效及疗效强弱做判断，而筛选新药。

附图说明：图1是利用本发明建立的高血压天然药物药理基因表达差异谱。

图2是利用本发明建立的II型糖尿病天然药物药理基因表达差异谱。

具体实施方式：

实施例1.

(1)建立高血压的动物模型。将试验小鼠分为两组，即正常组和模型组，正常组12只，模型组30只，模型小鼠喂养高糖、高蛋白饲料，使之形成原发性高血压模型，正常组小鼠给予普通饲料，两组动物均自由饮水。

(2)寻找原发性高血压的相关靶组织。造模成功后处死正常组中的6只小鼠和模型组中的6只小鼠，分离动物的肾脏、肝脏、脾脏、心肌、肺(肺叶)、动静脉大血管、横纹肌、脑组织、胰腺、肠组织和胃组织，将正常组和模型组中每6只动物组各个组织合并，提取总RNA，将RNA制备成RNA探针，用每张芯片含8000个以上基因、数目为2×11张的Oligo芯片杂交，杂交芯片扫描，数据分析。比较模型组和正常组小鼠上述组织的基因表达差异，相同表达的组织剔除，表达有差异的组织为心肌、动静脉大血管，肾脏，即这些组织为原发性高血压的相关靶组织。

(3)建立治疗高血压天然药物的药理基因表达差异谱：取已造模成功的小鼠18只，随机分为3组，每组6只，分别为KH-012号天然药物方剂的高剂量组(12g/kg)，中剂量组(6g/kg)和低剂量组(3g/kg)，另取6只给予等容量生理盐水，为模型对照组，最后取6只正常小鼠，给予等容量生理盐水，为正常对照组。给药时间均为7天，处死全部动物，取出高血压相关靶组织，即心肌、动静脉大血管，肾脏，按前述方法进行RNA提取，制备探针，杂交，扫描，数据分析。依据正常对照-疾病对照-疾病给药三种情况下三个剂量的，在高血压相关靶组织中，疾病相关基因的表达差异而形成的图谱，如图1所示的是KH-012号治疗高血压天然药物高剂量组的药理基因表达差异谱。

实施例2

(1)建立针对II型糖尿病病因的小鼠动物模型。将实验小鼠分为两组，即正常组和模型组，正常组12只，模型组30只。模型组小鼠喂养高糖、高脂饲料，使之形成II型糖尿病模型，喂养时间100天，正常组小鼠给予普通饲料，两组动物均自由饮水。

(2)寻找II型糖尿病相关靶组织。100天后测定模型组小鼠和正常组小鼠的血糖值，胰岛素含量，以确认造模成功。处死正常组中6只小鼠和模型组中6只小鼠，分离动物的肾脏、肝脏、脾脏、心肌、肺(肺叶)、动静脉大血管、横纹肌、脑组织、胰腺、肠组织和胃组织，将正常组和模型组中每6只动物组各个组织合并，提取总RNA，将RNA制备成RNA探针，用每张芯片含8000个以上基因、数目为2×11张的Oligo芯片杂交，杂交芯片扫描，数据分析。比较模型组和正常组小鼠上述组织的基因表达差异，相同表达的组织剔除，表达有差异的组织为横纹肌、胰腺，即这些组织为II型糖尿病的相关靶组织。

(3)治建立治疗II型糖尿病天然药物的药理基因表达差异谱：取已造模成功的小鼠18只，随机分为3组，每组6只，分别为KH-054号天然药物方剂的高剂量组(12g/kg)，中剂量组(6g/kg)和低剂量组(3g/kg)，另取6只给予等容量生理盐水，为模型对照组，最后取6只正常小鼠，给予等容量生理盐水，为正常对照组。给药时间均为7天，处死全部动物，取出II型糖尿病相关靶组织，即横纹肌、胰腺，按前述方法进行RNA提取，制备探针，杂交，扫描，数据分析。依据正常对照-疾病对照-疾病给药三种情况下三个剂量的，在高血压相关靶组织中，疾病相关基因的表达差异而形成的图谱，如图2所示的是KH-054号治疗II型糖尿病天然药物的中剂量组的药理基因表达差异谱。

实施例3.如图1所示的1-19均为基因编号，具体基因如下所示：

编号 基因名称编号 基因名称1 Selenoprotein W，muscle 1 11 Integrin beta 2-lide2 Squalene epoxidase 12 Fibroblast growth factor inducible 143 Glucagons receptor 13 Fibroblast growth factor 54 Early B-cell factor 3 14 Squalene epoxidase5 Negative control 2 15 TANK-binding kinase 16 Granzyme C 16 Complement component 97 Interleukin 10 receptor，alpha 17 Colony stimulating factor 3(granulocyte)8 Serine protease inhibitor 1-4 18 Interleukin 1 superfamily 1，epsilon9 P glycoprotein 2 19 f-box and leucine-rich repeat protein 3a10 Guanylate nucleotide binding protein 2

其中编号1-6的基因是大血管靶组织的，编号7-11的基因是心肌靶组织的，编号12-19的基因是肾皮质靶组织的。

下面结合附图进行说明：

6号基因Granzyme C在正常小鼠大血管靶组织中的基因表达丰度为5078，在疾病小鼠大血管靶组织中的基因表达丰度为935，即可以从6号基因表达水平的变化中发现，大血管靶组织中6号基因的低表达与高血压相关。6号基因在给药后基因表达丰度变为4523，即给药后疾病动物的该基因表达丰度有恢复正常的趋势，为评价高剂量的KH-012号治疗高血压天然药物是否对该种疾病有治疗作用提供了依据和方法，也为天然药物新药的筛选提供了依据。

18号基因Interleukin 1 superfamily 1，epsilon在正常小鼠肾皮质靶组织中的基因表达丰度为765，在疾病动物肾皮质靶组织中的基因表达丰度为4921，即可以从18号基因表达水平的变化中发现，肾皮质靶组织中18号基因的高表达与高血压相关。18号基因在给药后基因表达丰度变为4518，即给药后疾病动物的该基因表达丰度有恢复正常的趋势，为评价高剂量的KH-012号治疗高血压天然药物是否对该种疾病有治疗作用提供了依据和方法，也为天然药物新药的筛选提供了依据。

用本发明所建立的图1可以从基因表达的分子学水平阐明高血压致病的机理及治病机理，可以进行天然药物药理的研究及新药的筛选。

实施例4.如图2所示的1-21均为基因标号，具体基因如下所示：

编号    基因名称 编号    基因名称 1 Transcription factor 12 12 Pancreatic polypeptide receptor 1 2 CDC-like kinase 3 13 Nerve growth factor，gamma 3 Eph receptor A3 14 Programmed cell death 4 4 Y box protein 1 15 Myeloblastosis oncogene 5 Eph receptor A4 16 G protein-coupled receptor 33 6 Caspase 7 17 Transferring receptor 7 Mucin 14，endothelial 18 Interleukin 7 8 Hbsl-like(S.cerevisiae) 19 Protein tyrosine phosphatase 4a1 9 Interferon inducible protein 20 Serine protease inhibitor 2-1 lO Mesenchyme homebox 1 21 c-ste tyrosine kinase 11 WW domain binding protein 5

其中编号为1-14的基因是胰腺靶组织的，15-21的基因是横纹肌靶组织的。

1号基因Transcription factor 12在正常小鼠中的基因表达丰度为3241，在疾病小鼠中的基因表达丰度为687，即可以从1号基因表达水平的变化中发现，胰腺靶组织中1号基因的低表达与II型糖尿病相关。1号基因在给药后疾病小鼠的基因表达丰度变为2978，即给药后疾病小鼠的基因表达丰度有恢复正常的趋势，为评价中剂量的KH-054号治疗II型糖尿病天然药物是否对该疾病有治疗作用提供了依据和方法，也为天然药物新药的筛选提供了依据。

21号基因c-sre tyrosine kinase在正常小鼠中的基因表达丰度为5782，在疾病小鼠中的基因表达丰度为1024，即可以从21号基因表达水平的变化中发现，横纹肌靶组织21号基因的低表达与II型糖尿病相关。21号基因在给药后疾病小鼠中的基因表达丰度变为4982，即给药后疾病小鼠的基因表达丰度有恢复正常的趋势，为评价中剂量的KH-054号治疗II型糖尿病天然药物是否对该疾病有治疗作用提供了依据和方法，也为天然药物新药的筛选提供了依据。

用本发明所建立的图2可以从基因表达的分子学水平阐明II型糖尿病致病的机理及治病机理，可以进行天然药物药理的研究及天然药物新药的筛选。