一种DNA提取方法及其在检测食品中的转基因成分中的应用

摘要

本发明涉及一种DNA提取方法以及该DNA提取方法在检测食品中的转基因成分中的应用。现有技术中的DNA提取方法所得到DNA质量不高，含有抑制PCR反应的物质。本方法的综合使用了树脂吸附和蛋白变性萃取以及过滤步骤进行DNA的提取，使得到的DNA可以用于PCR方法检测食品中的转基因成分。本发明的DNA提取方法包括以下步骤：(1)用裂解液处理样品并离心得到含有DNA的上清；(2)过滤步骤(1)中的上清得到滤液；(3)向上述(2)的滤液中加入萃取剂处理并离心得到上清液；(4)向上述(3)中的上清中加入树脂用于吸附DNA；(5)洗脱吸附于树脂上的DNA并离心得到含有DNA的滤液；(6)沉淀滤液中的DNA。

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA提取方法及其在转基因食品检测中的应用。

背景技术

食品中含有脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，以前人们忽视其存在。直到近年，欧洲及其它地区批准了许多转基因作物的种植。核酸在食品分析上现在已经成为一个重要的分析食品的工具。最近欧盟数个法律条例中，销售含转基因的成分的食品必须加以标示。许多国家已经或考虑引用法律推行包含转基因成分的食物的标示。

因此，有必要开发适当的技术用于确认哪些食品必须加以标示。实践当中，区分转基因与非转基因的最佳办法是在DNA的水平上证明外来基因的存在与否。聚合酶链反应(PCR)可以用于检测外来基因的存在。然而，在进行PCR分析之前必须把DNA从样品中提取出来。许多的实验方法已描述了如何提取DNA，但各种方法的复杂程度和所获得的DNA的质量有很多的差别，并且不能够用于一些食品如啤酒、高度发酵和经过深加工的产品如酱油中DNA的提取，并且所得到的DNA产物中含有很多的PCR反应的抑制剂。这些方法具体包括：商业用途的树脂提取方法，如美国Promega公司的Wizard方法、DNeasy方法(Qiagen，Switzerland)、Nucleon Phytopure方法(Scotlab Bioscience，USA)和核酸沉淀技术，包括CTAB方法(Tinker et al.Theor.Appl.Genet.(1993)85：976-984)、ROSE方法(Steiner et al.Nucleic acids Res.(1995)23：2569-2570)、ROSEX方法、Alkali方法(Klimyuk et al.(1993)PlantJ 3：493-494)、alkaliX方法、Chelex 100方法(Walsh et al.(1991)Biotechniques 10：506-513)和SDS/蛋白酶K方法(Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，p6.15)。这些提取方法有不同的特性和用途。Wizard和Dneasy适于一般的DNA的提取，Nucleon Phytopure是特殊设计用于分析植物的，CTAB是一种为了经济考虑的方法，Chelex100是用作鉴证分析的标准方法，ROSE和alkali是快速而简便的方法，而ROSEX是ROSE方法加Chelex 100方法的组合，AlkaliX方法是Alkali方法和Chelex 100方法的组合。

用不同方法提取的DNA的性质不同。例如，用alkali，alkaliX或Chelex 100方法提取的DNA几乎完全改变原有的性质，即呈现出单链结构。Wizard和Dneasy方法不能分离大分子量的DNA(Zimmermannet al.，1998)。DNA的提取方法影响DNA的回收率。CTAB，Wizard，Dneasy and Nucleon Phytopure方法的回收率低于20％(Zimmermann etal.，1998)。这些方法所丢失的DNA可能是由于DNA在氯仿沉淀期间的丢失或DNA沉淀的效率低。ROSE和ROSEX方法的回收率在70-80％之间(Zimmermann et al.，1998)。这些方法所丢失的DNA可能归因于在离心时DNA和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的共同沉淀。Chelex100，alkali和alkaliX方法需要有沸腾这一步，这会影响到用于核酸定量的光密度计并导致计算数量的错误。

经提取的DNA的质量也非常重要，因为它影响到PCR方法检测出是否有标记基因的效率、实验的重复性、PCR的检测极限。从食品中提取的DNA的检测极限主要取决于：1.食品中存在的抑制物质；2.DNA在食品经过处理和加工的过程中受到的损伤程度(如净化、水解和碎化过程)；3.DNA在提取过程中的损伤程度。CTAB、Wizard、Dneasy和Nucleon Phytopure方法都可以得到高质量的DNA(Zimmermann et al.，1998)。Chelex 100，、alkali、alkaliX和ROSEX方法所得到DNA的质量较差。ROSE方法得到中等质量的DNA(Zimmermann et al.，1998)。所有这些方法可把DNA之外的RNA一并分离，而导致检测极限比预期的低，因为RNA在PCR反应中不扩增。

提取DNA方法的成本也是商业应用的一个考虑因素。商用的DNA提取方法(Wizard、Dneasy和Nucleon Phytopure方法)最为昂贵。Alkali、alkaliX和ROSE方法花费最少(Zimmermann et al.，1998)。

为了提取出充足的测试用的DNA，处理食物样品所需要的时间也是另一个重要的因素。Chelex 100、Wizard和Dneasy方法是非常耗时的。Alkali和alkaliX方法最快。其它方法所需的时间中等(Zimmermannet al.，1998)。最重要的是目前的方法不能适用于一些深加工制品和高度发酵产品如南乳和酱油等。而且这些方法不能把食品中的PCR抑制物质分离除去，以致所得到的DNA产物中含有PCR抑制物质。

具体说来，传统的Sambrook等的DNA提取方法中，首先是用裂解液裂解样品，然后用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)萃取去除蛋白、脂肪等杂质，然后用乙醇沉淀DNA(Sambrook J，et al.，(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，p6.15)。但该方法提取的DNA的质量不高。Wizard DNA提取方法，是在用裂解液裂解样品后用树脂吸附DNA，然后将DNA从树脂上洗脱下来，然后用乙醇沉淀DNA。该方法提取的DNA的质量仍不能达到要求，所达到的DNA产物中仍含有许多抑制PCR的杂质。

考虑到假阴性和假阳性结果的影响，从待测食品中提取的DNA的质量是非常重要的。因此，就需要一种能够从各种各样的食品中快速和高质量地提取DNA的方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种从含有DNA的样品，特别是食品样品中快速和高质量地提取DNA的方法。

本发明的另一个目的在于提供一种快速和准确的检测食品中的转基因成分的方法。

本发明的再一个目的在于提供一种快速和准确的检测食品中的转基因成分的试剂盒。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种DNA的提取方法，该方法包括如下步骤：

(1).用裂解液处理样品并离心得到含有DNA的上清；

(2).过滤步骤(1)中的上清得到滤液；

(3).向上述(2)的滤液中加入萃取剂处理并离心得到上清液；

(4).向上述(3)中的上清中加入树脂用于吸附DNA；

(5).洗脱吸附于树脂上的DNA并离心得到含有DNA的滤液；

(6).沉淀滤液中的DNA。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种检测食品中的转基因成分的方法，该方法包括：A.用上述的方法提取DNA；B.用PCR方法扩增和检测其中的至少一种转基因成分。

在本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于检测食品中的转基因成分的试剂盒。

用本发明的方法所提取的DNA的质量高，基本上不含有抑制PCR反应的物质，因此可以通过PCR方法方便有效地检测食品中的转基因成分。

附图说明

图1示本发明方法的概括的流程图。

图2示本发明的方法的流程图。

图3和图4示本发明的DNA提取方法的流程图。

图5示本发明的DNA扩增方法的流程图。

图6示花椰菜花叶病毒35S启动子序列的检测结果。其中的样品为：1.大豆(美国)、2.大豆(墨西哥)、3.杯装面条1、4.杯装面条2、5.袋装面条1、6.袋装面条2、7.豆浆(香港)。

图7示根癌农杆菌胭脂碱合成酶(NOS)序列的检测结果。其中的样品为：1.调味粉1、2.调味粉2、3.调味粉3、4.调味粉4、5.碗装面条1、6.碗装面条2、7.速食通心米粉、8.速食通心米粉、9.DNA分子标记、10.NOS阳性对照0.1％、11.NOS阳性对照0.5％、12.NOS阴性对照。

图8示新酶素磷酸转移酶II(NPTII)的检测结果。其中的样品为：1.菜籽油1、2.菜籽油2、3.菜籽油3、4.菜籽油4、5.菜籽油5、6.DNA分子标记、7.NOS阳性对照0.1％、8.NOS阳性对照0.5％、9.NOS阴性对照。

图9示18S rRNA的检测结果。其中的样品为：1.大豆1、2.大豆2、3.玉米1、4.玉米2、5.杯装面条1、6.杯装面条2、7.酱油1、8.酱油2、9.爆谷1、10.爆谷2、11.豆浆1、12.豆浆2、13.18S阳性对照、14.DNA分子标记、15.18S阴性对照。

发明的具体实施方式

用传统的食品分析技术并不容易确定食品中是否含有转基因成分。然而通过检测食品中的DNA的方法却可以有效地确定食品中是否含有转基因成分。本发明的方法适用于任何含有DNA的食品样品。本发明中所说的食品包括各种食品原料和加工的食品。例如，食品原料包括大豆、玉米、马铃薯、番茄、大米、大麦和油菜籽。加工后的食品包括：大豆制品，例如豆腐、豆浆、豆汁、大豆蛋白、发酵的豆腐、素食(例如素鱼)；玉米制品，例如玉米饼干、玉米片、玉米粉、玉米汤、玉米油、爆玉米；番茄制品，例如番茄酱、番茄汤、番茄汁、番茄味的马铃薯片；马铃薯制品，例如马铃薯片、炸薯片、马铃薯面粉、马铃薯淀粉；大麦制品，例如啤酒、面包、面粉、面条、麦片。其它加工制品有冰淇淋、菜籽油和巧克力等。

以DNA检测技术就能确定出食品是否含有转基因成分，或经过基因改造。在食品样品中，转基因DNA的含量很低，并且可能含有一些可能抑制PCR反应的物质。要检测转基因成分，首先要将这些含量很低的DNA提取出来，并将DNA纯化，并尽量把抑制PCR反应的物质去除。

所用未加工食品原料和加工食品中都含有DNA。转基因食品和非转基因食品的区别即在于其中嵌入了转基因成分。这个被嵌入的转基因成分将被PCR方法快速、特异和精确地扩增。在转基因生物体中存在着一些通用的、广泛使用的转基因成分。例如，花椰菜花叶病毒35S启动子控制大多数商用转基因植物的被嵌入的基因要素转录的开始。同样地，农杆菌中胭脂碱基因终止子控制大多数转基因植物的被嵌入的基因要素转录的有效终止。另外，NPTII经常被加入到转基因植物的中用于早期的转基因植物开发时从转基因植物中筛选出成功转基因的植物。这三个要素都是有效的区别转基因植物和非转基因要素的目标。而且，18S核糖体RNA存在于所有的真核细胞中。该分子可以作为DNA提取质量的标记。

图1示本发明的转基因食品的提取方法的概括的流程图。图2是本发明的检测食品中的转基因成分的流程图。

首先，对本发明中所用的样品来说，如果食品本身是固体如大豆、玉米等，只需要进行粉碎即可。如果食品是液体，如啤酒和豆浆，则如果直接进行提取，则DNA的含量太低，DNA产物的量不足于用于检测。因此，对这类食品要首先进行冷冻干燥，得到浓缩的产品后再进行DNA的提取和检测。冷冻干燥可以在普通的冷冻干燥仪上进行。

图3和4是DNA提取的示意图。首先向样品中加入裂解缓冲液用于裂解细胞和释放DNA分子(10)。样品可被置于一个合适的容器中如1.5ml的微量离心管中。样品的用量没有具体的限制，优选不小于0.4g。为了使实验结果更可靠，每个样品可以重复一次。裂解缓冲液可以使用常规的裂解缓冲液。例如裂解缓冲液包括缓冲液A和B，其中缓冲液A包括10mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，2mM EDTA-Na和1％十二烷基硫酸钠；缓冲液B包括5M的盐酸胍。然后，充分混合，例如通过旋涡振荡样品以使样品中的细胞充分裂解。细胞成分被溶解后，加入蛋白酶K(12)，分解食物的蛋白成分，其中蛋白酶K不含DNA。为了使样品中的蛋白成分裂解完全，可将样品在60℃水浴中温育一段时间，优选1-3小时。然后样品溶液被冷却至室温，并维持5分钟。然后，离心去除混合物中不能溶解的物质和沉淀物。例如，离心速率为14000rpm，时间为10分钟。把得到的含有DNA分子的上清溶液移到另一干净的容器中，例如一个干净的1.5ml的微量离心管。为了去除可能干扰PCR反应的微粒成分，将溶液通过含有微孔滤膜的无菌过滤器(14)得到滤液。其中，过滤器可以使用各种常用的过滤器如注射器式过滤器，前提条件是无菌和无致热源。例如OSMONICS的CAMEO 25AS。微孔滤膜的孔径大小优选为0.22μm。向得到的含有DNA的滤液中加入等量的萃取剂。优选萃取剂为苯酚∶氯仿∶异戊醇(混合溶剂)，优选比例为25∶24∶1。振荡混合后离心(14000rpm)，将得到的上层水溶液移到另一干净的容器中，例如一个干净的1.5ml的微量离心管中。优选再向该溶液中加入等量的氯仿，并混合和分离(14000rpm)得到含DNA的水溶液。向得到的水层中加入树脂(16)，将溶液和树脂的混合物通过一个微量管柱(20)。其中，树脂可以使用本领域常规的用于吸附DNA的树脂，但前提是没有可以破坏DNA的酶如Dnase，例如Promega公司的Wizard树脂。例如，把溶液经由注射器推到微量管柱中，其中微量管柱为常规的微型管柱，如Promega公司的Wizard微量管柱。然后用80％的异丙醇洗涤，去除杂质。离心，去除液体。向微量管柱中加入洗脱缓冲液(焦碳酸二乙酯水，即DEPC水)。可以将柱子加热到70℃并维持2分钟以释放所吸附的DNA分子。将收集到的流出液离心，得到含有DNA的溶液。向溶液中加入2倍体积的无水乙醇，在-80℃放置30分钟沉淀DNA。离心收集DNA。DNA沉淀(24)用70％的酒精洗涤。离心得到纯化的DNA沉淀，用DEPC水或TE(Tris-HCl，EDTA缓冲液)溶液，优选DEPC水溶解后。然后用常规方法在260/280nm测定DNA的浓度。

得到的DNA产物用常规的PCR扩增技术进行扩增，然后用凝胶电泳进行检测。PCR反应可在普通的PCR热循环仪上进行，如Strategene RoboCycler 96，德国。PCR反应中所使用的各种针对花椰菜花叶病毒35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶终止子和新霉素磷酸转移酶II的引物是由发明人根据GenBank上公开的序列进行设计然后由Promega等公司进行商业合成的。各引物的具体序列请参见序列表中SEQ ID No.1-22的描述。具体地说，用于扩增35S序列的引物对包括引物A(SEQ ID NOs.1-2)和B(SEQ ID Nos.3-5)。用于扩增NOS的引物对包括引物C(SEQ ID NOs.6-7)和D(SEQ ID Nos.8-10)。用于扩增NPTII的引物对包括引物E(SEQ ID Nos.11-13)和F(SEQ IDNos.14-16)。而用于扩增真核生物标记的18sRNA的引物对包括引物G(SEQ ID Nos.17-19)和H(SEQ ID Nos.20-22)。PCR反应中所使用的示例性试剂的组成具体如下表所示。

 成分 储液浓度终浓度 体积1×(μl) PCR缓冲液 10×1× 2.0 MgCl₂ 50mM2.1mM 0.85 dNTPs 10mM0.2mM 0.4 Taq聚合酶 5U/μl0.5U 0.1 引物 10μM0.5μM 1.0 DNA样品 随样品变化100-200ng 1.0 DEPC水 14.65 总体积 20.0

在冰上溶解PCR超级混合物和引物溶液。在加入其它成分之前，将PCR管在冰上冷却5分钟。根据上表，加入各反应试剂。除了样品DNA，每个反应需要一个阴性和阳性对照。其中阳性对照是参照材料和测定研究院联合研究中心欧洲委员会(Europe commission，JointResearch Centre，Institute for Reference Materials and Measurements(IRMM)，Geel(BE))的经公正的参照材料IRMM410^*，阴性对照是DEPC水。PCR的反应条件如下所示。1.变性：94℃，2分钟2.变性：94℃，1分钟3.退火：55℃，1分钟4.延伸：72℃，1分钟(步骤2-4重复循环40次)5.延伸：72℃，10分钟6.结束：6℃PCR反应的产物的检测是在常规的琼脂糖凝胶电泳上进行的。缓冲液是1×TAE(Tris，乙酸，EDTA缓冲液)。凝胶中含有0.3mg/ml的溴化乙锭。DNA分子标记为MBI Fermentas USA产品。每个泳道上样为20μl。24mA恒流电泳30分钟。

实施例实施例1.对转基因食品中花椰菜花叶病毒35S启动子序列的扩增和检测材料和方法1.样品：本发明中所用的大豆(美国)，大豆(墨西哥)，杯装面条1，杯装面条2，袋装面条1，袋装面条2和豆浆(香港)都是市售产品。2.试剂：DNA提取试剂：缓冲液A：10mM Tris HCl pH8，150mM NaCl，2mM EDTA，1％SDS。缓冲液B：5M盐酸胍

PCR超级混合物

成分 储液浓度 终浓度PCR缓冲液 10× 1×MgCl₂ 50mM 2.1mMDNTPs 10mM 0.2mM其中，PCR缓冲液是常用的Tris-HCl缓冲液。Taq聚合酶：购自Invitrogen USA。引物：购自Invitrogen USA，其序列如序列表中SEQ ID No.1和2所示。PCR反应调节如下(PCR热循环仪Strategen RoboCycler 96，德国)：1.变性：94℃，2分钟2.变性：94℃，1分钟3.退火：55℃，1分钟4.延伸：72℃，1分钟(步骤2-4重复循环40次)5.延伸：72℃，10分钟6.结束：6℃

1〕DNA的提取

首先将待测样品中的固体的样品如大豆和面条用粉碎机磨成细粉。加0.4g粉末至带有螺旋盖的微量离心管中(USA-Scientific)中。每个样品有一个重复。分别加入860μl缓冲液A，接着加入100μl缓冲液B并振荡混合。然后加入40μl不含DNA的蛋白酶K(Invitrogen，USA)并振荡混合。60℃水浴温育3小时，中间不时进行振荡混合。将该混合物冷至室温并在室温放置5分钟。然后在台式离心机(Eppendorf Centrifuge5415R USA)中以14000rpm离心10分钟。保留上清。将上清用针筒过滤器(Cameo syringe filter USA)过滤。向滤液中加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v/v)(Amersham Pharmacia USA)。旋涡振荡混合并以14000rpm离心5分钟。取上层并加入等体积的氯仿。旋涡振荡混合并在14000rpm离心5分钟。取上层，并向一个和微量管柱(Promega，USA)连接的注射器中加入1ml树脂(树脂和微量管柱为Promega公司产品)。将树脂和上层液充分混合并使该混合液通过该微量管柱。取下柱子并去掉塞子，将该微量管柱重新和一个注射器连接。向注射器中加入2ml 80％的异戊醇并使其通过该柱子。将该微量管柱在11000rpm离心2分钟。加入50μl洗脱缓冲液(DEPC水)并将柱子加热到70℃并在室温维持2分钟。将微量管柱在11000rpm离心1分钟。向微量离心管中的洗脱液中加入150μl无水乙醇并在-80℃放置30分钟。将微量离心管在14000rpm离心15分钟。弃上清并向DNA沉淀中加入70％的乙醇进行洗涤。14000rpm离心5分钟。弃上清并向沉淀中加入20μl DEPC水。取4μl在260/280nm测定DNA的浓度(Biorad Spectrophotometer 3000Switzerland)。将DNA浓度调整为50-200ng并储存在-20℃。

2〕PCR扩增和检测

如下表所示，向微量离心管中加入DNA样品和PCR反应缓冲液，引物溶液和Taq聚合酶后在PCR热循环仪中进行PCR反应，PCR反应的调节如上述材料和方法中所述。

PCR反应产物用3％(1×TAE)琼脂糖凝胶电泳进行检测。其中凝胶中加入了0.3mg/ml的溴化乙锭(Amersham Pharmacia USA)。DNA分子标记为MBI Fermentas USA产品。每个泳道上样为20μl。24mA恒流电泳30分钟。阳性对照为IRMM410^*，阴性对照为DEPC水。结果如图7所示。结果为，泳道1(大豆，美国)，2(大豆，墨西哥)，3(杯装面条)，5(袋装面条1)和6(袋装面条2)出现了162bp的35S带，表明该食品中含有转基因成分。实施例2.对根癌农杆菌胭脂碱合成酶(NOS)终止子的扩增和检测

DNA的提取方法和PCR扩增和检测方法和实施例1相同。其中的样品是1.调味粉1、2.调味粉2、3.调味粉3、4.调味粉4、5.碗装面条1、6.碗装面条2、7.速食通心米粉、8.速食通心米粉。其中所用的引物如SEQ ID Nos.6和8所示。阳性对照改为IRMM410^*。阴性对照为DEPC水。结果如图7所示。结果是样品5.碗装面条1、6.碗装面条2、7.速食通心米粉、8.速食通心米粉出现了阳性的146bp的条带。说明这些食品中有转基因成分的存在。实施例3.对新霉素磷酸转移酶II(NPTII)序列的扩增和检测

DNA的提取方法和PCR扩增和检测方法和实施例1相同。其中所用的样品为1.菜籽油1、2.菜籽油2、3.菜籽油3、4.菜籽油4、5.菜籽油5。其中所用的引物如SEQ ID Nos.11和14所示，阳性对照为IRMM410。结果如图8所示。结果是样品3和4中出现了194bp的阳性条带，说明这2种食品中有转基因成分的存在。实施例4.18SrRNA的检测

DNA的提取方法和PCR扩增和检测方法和实施例1相同。其中所用的样品为1.大豆1、2.大豆2、3.玉米1、4.玉米2、5.杯装面条1、6.杯装面条2、7.酱油1、8.酱油2、9.爆谷1、10.爆谷2、11.豆浆1、12.豆浆2。其中所用的引物如SEQ ID Nos.17和20所示，阳性对照为IRMM410。结果如图9所示。18SrRNA是真核生物的标志，也是DNA提取过程成功的指示。结果所有的样品都为阳性，都出现了137bp的条带，说明DNA的提取是成功的。

大部分市场上出现的转基因植物都用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子作为转基因的转录启动因子。因此，35S阳性的结果表明所检测的食品中有转基因成分的存在。但如果食品中含有芸苔属植物(如cauliflower，Brussels，Sprouts，Parsley)的成分时，35S阳性并不能说明食品中是否含有转基因成分的存在。这时要结合NOS和/或NPTII的检测的结果。

实施例5.一种用于检测食品中的转基因成分的试剂盒

如下的试剂存放于不同的相互隔离的容器中，并共同组成一个试剂盒用于检测食品中的35S和/或NOS和/或NPTII的存在与否。

1×50μl 35S引物

1×50μl NOS引物

1×50μl NPTII引物

1×50μl 18SrRNA引物

3×0.8ml不含DNA的蛋白酶K

3×1.2ml PCR反应的超级混合物

1×100μl 35S和NOS的DNA阳性对照(1％w/v)

1×50μl NPTII的DNA阳性对照(1％w/v)

1×50μl 18SrRNA的DNA阳性对照(1％w/v)

1×50ml缓冲液A

1×6ml缓冲液B

1×50ml树脂

50支微量管柱

其中缓冲液A、B，PCR超级混合物以及树脂和实施例1中的相同。

                               序列表<110>香港基因晶片开发有限公司<120>一种DNA提取方法及其在检测食品中的转基因成分中的应用<130>CPCH0163305<140><141><160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物A：35S提取序列<400>1atatagagga agggtcttgc gaagg                                        25<210>2<211>125<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物A：35S提取序列±50核苷酸<400>2gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc caaatgaaat gaacttcctt atatagagga  60agggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt acgtcagtgg agatatcaca  120tcaat                                                              125<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物B：35S提取序列<400>3ccgacagtgg tcccaaagat ggac                                        24<210>4<211>124<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物B：35S提取序列±50核苷酸<400>4caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg  60tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac  120gtct                                                               124<210>5<211>164<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物B：35S提取序列±70核苷酸<400>5agaaaaggaa ggtggcacta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa   60gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa   120aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatg                    164<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物C：NOS提取序列<400>6gaatcctgtt gccggtcttg cgatg                                        25<210>7<211>125<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物C：NOS提取序列±50核苷酸<400>7tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt  60gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgataagcatgtaataatt   120aacat                                                              125<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物D：NOS提取序列<400>8tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc                                     30<210>9<211>130<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物D：NOS提取序列±50核苷酸<400>9caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta 60aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcacag 120ataggcctaa                                                        130<210>10<211>170<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物D：NOS提取序列±70核苷酸<400>10cgatctagta acatagatga caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt 60ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc 120ataaataacg tcatgcacag ataggcctaa cgcttgtcca agatctattc            170<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物E：NPTII提取序列<400>11ggtggtcgaa tgggcaggta gc                                         22<210>12<211>122<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物E：NPTII提取序列±50核苷酸<400>12aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa  60tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac  120tt                                                                 122<210>13<211>162<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物E：NPTII提取序列±70核苷酸<400>13tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga  60tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt  120gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt ga                     162<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物F：NPTII提取序列<400>14cacgacgggc gttccttgc                                              19<210>15<211>119<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物F：NPTII提取序列±50核苷酸<400>15ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc  60gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctatt   119<210>16<211>159<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物F：NPTII提取序列±70核苷酸<400>16ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat 60cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg 120gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagg                        159<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物G：18S提取序列<400>17aatttgcgcg cctgctgcct tcctt                                          25<210>18<211>125<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物G：18S提取序列±50核苷酸<400>18agtcccgtat tgttattttt cgtcactacc tccccgtgcc aggagtgggt aatttgcgcg 60cctgctgcct tccttggatg tggtagccgt ttctcatgct ccctctccgg aatcgaaccc 120tgatt                                                             125<210>19<211>165<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物G：18S提取序列±70核苷酸<400>19caattacggg gcctcgaaag agtcccgtat tgttattttt cgtcactacc tccccgtgcc 60aggagtgggt aatttgcgcg cctgctgcct tccttggatg tggtagccgt ttctcatgct 120ccctctccgg aatcgaaccc tgattccccg ttacccgtta caacc                 165<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物H：18S提取序列<400>20tctgccctat caactttcga tggta                                       25<210>21<211>125<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物H：18S提取序列±50核苷酸<400>21aactttgtgc tgatcgcacg gcctcgcgcc ggcgacgtat ctttcaaatg tctgccctat 60caactttcga tggtacgtga tatgcctacc atggttgtaa cgggtaacgg ggaatcaggg 120ttcga                                                             125<210>22<211>165<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物H：18S提取序列±70核苷酸<400>22tcggattggt gatactggat aactttgtgc tgatcgcacg gcctcgcgcc ggcgacgtat 60ctttcaaatg tctgccctat caactttcga tggtacgtga tatgcctacc a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