2，4－O－二－α－L－吡喃鼠李糖基－β－D－吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙的合成方法

摘要

一种2，4－O－二α－L－吡喃鼠李糖基－β－D－吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙的合成方法，是由3，6－二－O－三甲基甲酰基－β－D－吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙与2，3，4－三－O－苯甲酰基－L－吡喃鼠李糖三氯乙酰亚胺酯进行糖苷化反应，再脱去保护基(苯甲酰基)，即得2，4－O－二－α－L－吡喃鼠李糖基－β－D－吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙。该方法原料便宜易得，反应条件温和，产物收率高，β型产物的光谱纯度达99％以上，在整个合成方法步骤中，大大减少了柱层析分离纯化手段，而以方便的重结晶纯化取代之，从而使设备投资减少，成本降低，操作又方便，因此本发明合成方法是适宜于工业化大规模生产的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有生理活性的甾体皂甙的合成方法，具体地说是2，4-O-二-α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙(Dioscin)的合成方法。

背景技术

甾体皂甙(Steroid saponins)是植物中一类重要的生物活性物质，它是以C-27甾体化合物为甙元的一类皂甙，主要分布于百合科、薯蓣科和茄科植物中，其他科如玄参科、石蒜科、豆科以及鼠李科的一些植物中也含有甾体皂甙。常用中药知母、天门冬、麦门冬、七叶一枝花等都含有大量甾体皂甙。天然甾体皂甙具有广泛的生物活性，如抗炎、抗霉菌、抗病毒、抗癌、抗感染、降血糖、降血脂、平喘、止血、免疫、抗肝病、抗衰老等活性(徐任生主编，天然产物化学，科学出版社，1993，553；中草药现代研究(第二卷)，中国医学科学院药物研究所，250)。薯蓣皂甙是甾体皂甙中的一大类，许多薯蓣皂甙都具有较好的生物活性。前苏联的科研人员发现高加索薯蓣中的皂甙提取物有降胆固醇的作用，临床实验也有证明。80年代Ravikumer等发现云南白药中的薯蓣皂甙有抗癌活性(Ravikumar PR，Paul H，Charles JS，et al.Cytotoxic saponins from the Chinese herbal drug Yunnan BaiYao J Pharm Sci，1979，68(7)：900)。另外薯蓣皂甙元(diosgenin)及其甙还有抗关节炎作用。研究表明从重楼、穿龙薯蓣(D.nipponica)中分离得到的薯蓣皂甙具有明显的心血管、抗肿瘤和抗真菌的活性(K.Nakaro等，chem.Pharm.Bull.37，116-118，1989；C.D.Hufford等，J.Nat.Prod.，51，94-98，1988)。最近几年的研究发现Dioscin对肺癌、乳癌、胃癌、白血病、结肠癌、宫颈癌、黑色素瘤等肿瘤细胞都有很好的细胞毒性(Takanori，Nakamura等，Biol.Pharm.Bull.19(4)，564-566，1996；MeiDong等，Tetrahedron，57，501-506，2001；Wang Zhao等，Tsinghua Science andTechnology，6(3)，239-242，2001)。我国的许多种药材中都含有薯蓣皂甙，如藏山药、蚤休、菝葜、穿山龙、蜀葵叶薯蓣、山麦冬等等，但含量都不高，含量较高的穿龙薯蓣(穿山龙)根茎中的薯蓣皂甙含量平均也只有2.0％。目前，国内以不同种的薯蓣属植物为原料，提取其总甾体皂甙作为临床上的降血脂药已有数家工厂生产，其中用盾叶薯蓣(D.zingibernsis)为原料研制成功的新药“盾叶冠心宁”，临床治疗冠心病、心绞痛有一定疗效。已上市的“地奥心血康”也是一种降血脂的药物，该药是以黄山药(D.panthaica)的根茎为原料提取的薯蓣皂甙的混合物，其中包括单糖甙、二糖甙等。

虽然植物中有很多种皂甙，但皂甙是一类极性较强的大分子化合物，不容易结晶，易溶于水和醇，难溶于有机溶剂，而且在同一植物中往往有很多结构相近的皂甙共存，更增加了分离纯化的困难。一般经过分离纯化只能得到总皂甙。要使总皂甙得到进一步分离，得到较纯的皂甙，往往仅靠一种柱层析的方法很难解决所有的分离问题，除了使用常规的正相硅胶柱层析外，还需要选用反相硅胶、大孔吸附树脂及葡聚糖凝胶柱层析等几种方法配合使用，才能达到满意的分离效果。另外甾体皂甙在植物中的含量也不尽相同，有的甾体皂甙的含量很低，这样从植物中提取也更加困难。这样由于皂甙在植物中含量很低，且分离过程复杂，很难用于工业化生产。然而皂甙元相对于皂甙来说，更容易分离得到，且分离纯化过程易于工业化。由于甾体皂甙元是合成甾体避孕药及激素类药物的原料，国内外学者在50～60年代在寻找资源、改进生产工艺等方面做了很多工作，到目前为止我国已是能够大量生产薯蓣皂甙元(diosgenin)、替告皂甙元(tigogenin)和海柯皂甙元(hecogenin)等甾体皂甙元的重要国家，这样就为化学合成甾体皂甙准备了充足的原料来源。甾体皂甙是由甾体皂甙元和糖基配体通过糖苷键连接而成的，因此可以采用甾体皂甙元为母核，按照已有的天然甾体皂甙中各种糖的连接方式，大量有效地半合成出纯的甾体皂甙，进而进行药理活性筛选，并进一步研究构效关系，从中开发出疗效好而毒副作用小的新药。

二十世纪九十年代后期陆续有多篇专利和文献介绍了薯蓣皂甙(Dioscin)的半合成工作，其中俞飚、邓绍江、李兵和惠永正等做了较多的工作(CN 1291614A；CN1293199A；Tetrahedron Letters，39，6511-6514，1998；Carbohydrate Research，317，53-62，1999；Carbohydrate Research，331，1-7，2001；Tetrahedron Letters，42，2405-2407，2001)，另外Tsuyoshi，Ikeda等也提出了一条合成路线(Tsuyoshi，Ikeda，et al.Tetrahedron Letters，42，2353-2356，2001)。下面介绍一下文献上公布的几条合成路线：合成路线一：CN1291614A

这条路线使用当量的三氟化硼-乙醚(BF₃·Et₂O)为促进剂，虽然促进剂成本较低，但是收率不高，而且需要在-78℃下反应，反应条件比较苛刻，不利于大规模工业化生产。合成路线二：Bing Li等，Carbohydrate Research，331，1-7，2001

这条路线有两种方法进行糖苷化。方法一，使用当量的N-碘代丁二酰亚胺(NIS)-三氟甲磺酸银(AgOTf)混合物为促进剂，虽然收率较高，反应条件较温和，但由于NIS和AgOTf都很贵，而且需要当量的促进剂，成本较高，不利于大规模工业化生产；方法二，使用当量的三氟化硼-乙醚(BF₃·Et₂O)为促进剂，虽然促进剂成本较低，但是收率偏低，而且需要在-78℃下反应，反应条件比较苛刻，也不利于大规模工业化生产。合成路线三：Biao Yu and Houchao Tao，Tetrahedron Letters，42，2405-2407，2001

这条路线糖苷化反应的收率较高，但由于合成糖基配体(3-2)需要使用N-苯基-三氟亚氨乙基氯(N-phenyl trifluoroacetimidoyl chloride)，这种试剂不易得到，因此难以工业化生产。合成路线四：Tsuyoshi，Ikeda，et al.Tetrahedron Letters，42，2353-2356，2001

这条路线的最大缺点是得到的产物是α型和β型的混合物，所要得到的β型产物比α型产物少(α∶β＝1∶0.24-0.44)，只有β型产物的脱保护基产物(Dioscin)才是有细胞毒性的，而且收率不很高，α型和β型产物的分离又很困难，因此也难以进行工业化大规模生产。

以上四条合成路线在反应条件、收率、反应试剂或反应选择性等方面都有着这样或那样的缺陷，进行大规模工业化生产都有一定的困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种2，4-O-二-α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙(Dioscin)的合成方法，该方法的收率高，反应条件温和，操作简便，纯度高，成本低，是适宜于大规模工业化生产的方法。

本发明的方法可以用下述的反应式表示：

本发明的合成方法中，采用薯蓣皂甙元(Diosgenin)和葡萄糖糖苷化反应得到的产物β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙(Trillin)(Biao，Yu and Houchao Tao，Tetrahedron Letters，42，2405-2407，2001)为原料，选择性地在Trillin的葡萄糖基的3，6位上三甲基甲酰基保护基(Piv)得到3，6-二-O-三甲基甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙(V)，化合物(V)与由L-鼠李糖单水合物(I)经过三步反应(I→II→III→IV)合成的糖基配体，即2，3，4-三-O-苯甲酰基-L-吡喃鼠李糖三氯乙酰亚胺酯(IV)进行糖苷化反应，得到化合物(VI)，再脱去保护基，即可得到Dioscin。本发明合成方法包括以下步骤：1.  四-O-苯甲酰基L-吡喃鼠李糖(II)的合成

L-鼠李糖单水合物(I)和苯甲酰氯，在溶剂中反应，定量生成化合物(II)。化合物(I)和苯甲酰氯以及弱碱的摩尔比是1∶3.0-7.0∶6.0-8.0，反应溶剂是二氯甲烷、三氯甲烷或吡啶，弱碱是吡啶或三乙胺，反应温度是20-40℃，反应时间是8-10小时。反应结束后按常规方法处理。合成方法参照R.K.Ness，et al，J.Amer.Chem.Soc.，1951，296-299。2.  2，3，4-三-O-苯甲酰基-L-吡喃鼠李糖(III)的合成

化合物(II)在极性溶剂中和氨气反应，生成2，3，4-三-O-苯甲酰基-L-吡喃鼠李糖(III)。极性溶剂是四氢呋喃-甲醇的混合溶剂，它们的体积比是4-1∶1，反应温度是10-15℃，反应时间是8-10小时。纯化产物较好的是采用重结晶纯化，也可用柱层析纯化，反应收率为60-72％。合成方法参照M.Zhang et al.，CarbohydrateResearch，2001，330，319-324。3.  2，3，4-三-O-苯甲酰基-L-吡喃鼠李糖三氯乙酰亚胺酯(IV)的合成

化合物(III)和三氯乙腈、催化剂在溶剂中于惰性气体保护下反应生成2，3，4-三-O-苯甲酰基-L-吡喃鼠李糖三氯乙酰亚胺酯(IV)。催化剂是1，8-二氮杂二环[5.4.0]-7-十一烯(DBU)或无水碳酸钾，化合物(III)和三氯乙腈、催化剂的摩尔比为1∶1.4-1.8∶0.05-0.08，惰性保护气体是氮气或氩气，反应温度是0-25℃，溶剂是无水二氯甲烷或无水三氯甲烷，反应时间是1.0-3.0小时。纯化产物较好的方法是用短硅胶柱过滤，过滤用的吸附剂是硅胶，硅胶与产物的重量比为4-1∶1，硅胶的粒度是40-60μm，反应收率为88-96％。合成方法参照M.Zhang et a1.，Carbohydrate Research，2001，330，3 19-324。4.  3，6-二-O-三甲基甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙(V)的合成

Trillin和三甲基甲酰氯在溶剂中于惰性气体保护下反应生成3，6-二-O-三甲基甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙(V)。Trillin和三甲基甲酰氯的摩尔比是1∶4-7；反应溶剂是二氯甲烷、三氯甲烷、吡啶或它们的混合物，弱碱是用吡啶或三乙胺，弱碱与苯甲酰氯的摩尔比是4-1.5∶1；惰性气体是氦气或氮气；反应温度是-10-10℃；反应时间是6-8小时。产物的纯化较好的是重结晶纯化，也可用柱层析纯化，反应收率为60-72％。合成方法参照文献：Bing Li等，Carbohydrate Research，2001，331，1-7。5.  2，4-O-二-α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙(Dioscin)的合成

(a)糖苷化反应

惰性气体保护下，化合物(V)、化合物(IV)、促进剂和分子筛在溶剂中进行糖苷化反应生成2，4-二-O-(2，3，4-O-苯甲酰基-α-L-吡喃鼠李糖基)-3，6-二-O-三甲基甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙(VI)。化合物(V)、化合物(IV)和促进剂的摩尔比1∶2.0-8.0∶0.02-0.2，较好的是1∶2.2-3.2∶0.04-0.1。促进剂是C₁-C₆的卤代酰胺、C₁-C₆的卤代烃基磺酸、C₁-C₆的卤代烃基磺酸酯、C₁-C₆的卤代烃基磺酸盐、C₁-C₆的三甲基硅基卤代烃基磺酸酯、三氟化硼-乙醚络合物或它们的混合物，例如N-碘代丁二酰亚胺(NIS)、N-碘代丁二酰亚胺(NIS)-三氟甲磺酸银(AgOTf)混合物、N-碘代丁二酰亚胺(NIS)-三氟甲磺酸(TfOH)混合物、三氟甲磺酸银(AgOTf)、三甲基硅基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)等，较好的是三氟甲磺酸银、三甲基硅基三氟甲磺酸酯或三氟化硼-乙醚络合物。在反应中加入分子筛有利于反应，所述的分子筛是硅酸盐型、铝酸盐型、多孔性路易斯酸性分子筛或它们的粉末，化合物(V)和分子筛的重量比为1∶0-5.0，较好的是1∶2.0-4.0。分子筛较好的是4、5球形分子筛的粉末。反应溶剂是C_1-4的氯代烷烃、二氧六环或甲苯，较好的是二氯甲烷或三氯甲烷，溶剂用量是1mol化合物(V)用10-40升溶剂。反应温度是-78-40℃，较好的是-35-25℃。反应时间是0.2-4小时，较好的是1.0-2.0小时。惰性保护气体是氮气、氩气或氦气。反应结束时加入弱碱淬灭反应，弱碱是三甲胺或三乙胺，促进剂与弱碱的摩尔比是1∶1-3，较好的是1∶1-1.2。产物用柱层析纯化，柱层析用的吸附剂是硅胶，氧化铝或大孔树脂等，较佳是硅胶，硅胶与产物的重量比为20-10∶1，硅胶的粒度较好的是40-60μm，洗脱用的溶剂。是石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷或甲醇中一种或一种以上的混合物。反应的收率为65-75％。

(b)脱保护基反应

化合物(VI)和一价金属氢氧化物的水溶液在极性溶剂中反应，生成2，4-二-O-α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙(Dioscin)。一价金属氢氧化物是氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂，其水溶液的重量百分比浓度较好的是25-50％，化合物(VI)和一价金属氢氧化物的摩尔比是1∶8-20，较好的是1∶10-16。极性溶剂是四氢呋喃、甲醇、乙醇、乙腈、水中的一种或一种以上的混合物，溶剂用量是1mol化合物(VI)用10-30升溶剂。反应温度是20-60℃，较好的是40-50℃。反应时间是2-12小时，较好的是5-8小时。产物纯化可以是重结晶或柱层析，较好的是重结晶纯化，重结晶纯化所用的溶剂是三氯甲烷、C_1-4的醇、丙酮、水中一种或一种以上的混合物，较好的为甲醇或乙醇。反应的收率为90-100％。

本发明的优点：本发明方法的反应条件比较温和，没有特别苛刻的要求，操作比较简便；本发明方法中的原材料除了糖苷化反应使用的促进剂之外，均使用便宜易得的工业化原料，促进剂虽为试剂，但用量是催化量的，用量很少，促进剂的摩尔数只相当于化合物(V)摩尔数的4％-10％，重量只相当于化合物(V)1.3％-3.3％；本发明方法的收率较高，特别是关键反应(糖苷化反应)的收率可以达到65-75％，高于相关文献和专利报道的收率，参考路线一的收率只有52％；此外，关键反应(糖苷化反应)的选择性好，基本上都是β型产物；又因本发明方法对各步骤中产物的纯化手段进行了改进，与相关文献中大量使用柱层析纯化进行产物分离的手段相比，本发明的方法大大减少了柱层析分离纯化的使用，整个合成步骤中只用一次硅胶柱层析分离(第5(a)步)和一次短硅胶柱过滤纯化(第3步)，其它步骤中都改进采用简便易行的重结晶纯化，特别是最终产物Dioscin的纯化过程中，采用重结晶方法即可得到色谱纯度99％以上的β型产物，从而使本方法设备投资减少，成本降低，操作方便，因此，本发明方法是适宜于工业化大规模生产的方法。

通过下述实施例将有助于理解本发明，但不限制本发明的内容。实施例1    四-O-苯甲酰基L-吡喃鼠李糖的合成

L-鼠李糖单水合物100g(0.55mol)溶于1000ml无水吡啶中，0℃下滴加苯甲酰氯400ml(3.45mol)，室温下反应8小时。薄层层析检测，反应完全后，经常规处理得棕红色粘稠液体，即化合物(II)320g，收率100％。其物化数据相同于文献值：Boivin，J等，Carbohydrate Research，1980，79，193-204。实施例2    2，3，4-三-O-苯甲酰基-L-吡喃鼠李糖的合成

化合物(II)320g(0.55mol)，溶于1500ml体积比为7∶3的四氢呋喃-甲醇混合溶剂中，0℃下通入氨气，升温至15℃，搅拌8小时。反应完毕，浓缩近干，加入50％乙醇水溶液200ml，搅拌均匀，冷却后，抽滤。滤饼用50％乙醇水溶液3×50ml洗涤，滤饼烘干得白色结晶，即化合物(III)186g，收率71.1％，色谱纯度96.4％。其物化数据相同于文献值：Pozsgay，Vince等，Tetrahedron Letter，1993，34，7175-7178。实施例3    2，3，4-三-O-苯甲酰基-L-吡喃鼠李糖三氯乙酰亚胺酯的合成

化合物(III)700g(1.47mol)，氩气保护下加入4900ml二氯甲烷，搅拌使固体溶解。室温下加入三氯乙腈260ml(2.58mol)和1，8-二氮杂二环[5.4.0]-7-十一烯(DBU)13ml(0.087mol)，室温下搅拌2小时。产物通过短硅胶柱(40-60μm)纯化，洗脱液是体积比为5∶1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液，最终得浅黄色泡沫状固体，即化合物(IV)872g，收率95.6％。其物化数据相同于文献值：Zhang，Meimei等，Carbohydrate Research，2001，330，(3)，319-324。实施例4    3，6-二-O-三甲基甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙的合成

氩气保护下100g(0.17mol)Trillin溶于1000ml体积比为1∶1的无水吡啶-二氯甲烷混合溶剂中，在0℃时滴加三甲基甲酰氯120ml(0.97mol)，0℃下反应8小时。反应结束后浓缩至小体积，倒入冰水中，过滤，滤饼水洗后烘干，即得化合物(V)的粗产物。粗产物用体积比为1∶2的二氯甲烷-石油醚混合溶剂重结晶，最终得到灰白色固体89.0g，色谱纯度99.5％，收率为70.3％。其物化数据相同于文献值：Bing Li等，Carbohydrate Research，2001，331，1-7。实施例5    2，4-二-O-α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙的合成a)2，4-二-O-(2，3，4-O-苯甲酰基-α-L-吡喃鼠李糖基)-3，6-二-O-三甲基甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙的合成

化合物(V)150g(0.2mol)、化合物(IV)340g(0.55mol)和4分子筛450g，在氩气保护下加入4500ml二氯甲烷，搅拌1小时。0℃下加入促进剂TMSOTf4.0ml(0.02mol)，加完后升至室温，搅拌反应2小时。反应结束后加入三乙胺3ml(0.02mol)淬灭反应，反应液过滤，浓缩液进行柱层析分离，吸附剂为硅胶(40-60μm)，洗脱液是体积比为4∶1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液，最终得到微黄色泡沫状固体，即化合物(VI)240g，色谱纯度98.5％。收率为72.2％。其物化数据如下：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ8.06-7.18(m，30H)，5.75-5.42(m，8H)，5.21(s，1H)，5.15(s，1H)，4.80(d，1H，J7.3Hz)，4.75-4.71(m，1H)，4.63(dd，1H，J11.9，2.2Hz)，4.44-4.37(m，2H)，4.32-4.29(m，1H)，3.97-3.92(m，2H)，3.80(dd，1H，J8.5，7.5Hz)，3.94(m，1H)，3.48-3.36(m，2H)；ESIMS(m/z)：1684(M+Na)；IR(νmax，KBr压片)：3374，2957，2908，2874，1733，1603，1453，1264，1108，1029，981，711。b)2，4-二-O-α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖基薯蓣皂甙的合成

得到的产物(VI)240g(0.14mol)，溶于2000ml四氢呋喃-甲醇(体积比1∶1)混合溶液中；搅拌下加入80g(2.0mol)氢氧化钠的200ml水溶液，40℃反应8小时。反应液减压蒸馏浓缩近干，加入1.2L蒸馏水，50℃搅拌1小时，冷却后抽滤，滤饼用蒸馏水3×300ml洗涤，抽干。滤饼用甲醇重结晶，最终得白色粉末固体(Dioscin)118g，是为β型产物，色谱纯度99.3％。收率为96％。其纯化合物的物化数据如下：¹H NMR(300MHz，C₅D₅N)：δ5.41(brs，1H，H-6Rha)，5.09(d，1H，J3.87Hz)，4.77-4.62(m，5H)，4.46-4.30(m，5H)，4.21-3.85(m，5H)，3.43-3.36(m，5H)，1.54(d，3H，J5.99Hz，CH₃-6Rha₁)，1.41(d，3H，J6.14Hz，CH₃-6Rha₂)，0.93(s，3H，CH₃)，0.90-0.83(m，9H，3CH₃)；¹³C NMR(300MHz，C₅D₅N)：140.97，121.94，109.40，103.01，102.15，100.39，81.24，78.65，78.19，78.08，77.91，77.07，74.24，74.05，72.95，72.69，70.53，69.66，67.04，64.39，63.01，61.44，56.76，50.41，42.10，40.59，40.02，39.09，37.67，37.27，32.44，32.40，32.00，31.81，30.89，30.73，30.29，29.45，21.28，19.54，18.78，17.47，16.48，15.19，14.45；ESI-MS(m/z)：892(M+Na)IR(νmax，KBr压片)：3323，2935，1458，1380，1243，1135，1029，981，918，899