基于原子力显微镜观察的超薄切片在云母表面的贴附方法

摘要

一种基于原子力显微镜观察的超薄切片在云母表面的贴附方法,制备包埋块和进行超薄切片后选择银白色或铅白色的片子,用铂金环捞取,吸取超纯水滴于事先剖裂的云母表面,将铂金环轻轻浸在水滴中,从侧面移走铂金环,使切片飘浮在水面上,再将云母置于烘片机上缓慢烘干,使切片平整地贴附在云母表面。本发明的方法步骤简单,成本低廉,不会破坏样品的细微结构,所得的图像更为清晰,适用于制备各种生物样品。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种超薄切片的贴附方法，特别涉及的是用于原子力显微镜观察的超薄切片在云母表面的贴附方法，属于生物医学工程技术领域。

背景技术：

超薄切片法是一种用于电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察的生物组织样品的制备方法。大体的步骤包括：(1)生物样品的固定，通常用的是戊二醛和四氧化锇双固定法；(2)脱水，用乙醇或者丙酮梯度脱水；(3)包埋，用国产的环氧树脂618或者进口的Epon812先渗透后包埋；(4)切片，使用超薄切片机切片，选择银白色或铅白色的片子，铜网捞取晾干；(5)染色，通常用铅铀双染色；(6)透射电镜观察。

20世纪80年代随着原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)的发明，就有人尝试用原子力显微镜来观察生物组织样品。为了充分利用原子力显微镜分辨率高的优势，需要暴露细胞内部的结构，因此可以利用组织切片的方法。常规的石蜡切片和冰冻切片表面起伏很大，粗糙度太高，不适合用AFM观察。最终大家都把目光瞄向了超薄切片法，因为利用这种方法获得的切片不仅足够的薄，而且表面非常平整，并且又具有合适的粗糙度和摩擦力，正好适合原子力显微镜观察的需要。较早的文献见之于Amako K.，TakadeA.，Umeda A.et al.J Electron Microsc.1993 Vol.42，121-123、Ushiki T.，Shigeno M.& Abe K.Arch.Histol.Cytol.1994，57，427-432.这些文章中只是简单地提到超薄切片用云母收集，并未提及详细的方法和步骤。他们得到的图像分辨率都不高，尤其是用玻璃刀切的片子，用AFM观察很难分辨出细胞的轮廓。在随后的工作中，人们想方设法在提高分辨率上大做文章，如文献Osada T.，Arakawa H.，IchikawaM.et al. J.of Microsc.1998，189.43-49提到使用一种电子蚀刻的方法来达到了亚细胞的分辨水平。这种方法先用覆有formvar膜的捞取超薄切片，染色干燥后在电镜下观察，加速电压为80Kv。在观察的同时，由于高速电子对切片的轰击作用，原来充满树脂的组织空隙进一步被暴露，造成了表面浮雕的效果，于是在AFM下观察可以达到亚细胞水平的分辨率，可以观察到细胞内部的结构。但这些方法在取得突破的同时，本身也存在着缺陷：(1)Amako等人只是说明AFM可以观察用钻石刀切得的表面平坦光滑的超薄切片，但只能看清霍乱弧菌的轮廓和形状，无法观察到细菌内部的结构。(2)Ushiki等人使用AFM来观察去包埋剂的生物组织切片，他们解释使用这种方法是因为树脂包埋的切片难以给出有效的生物信息。但是去包埋剂的过程会破坏样品原本的细微结构，尤其对于一些软样品，如培养细胞。(3)Osada等人使用的电子束刻蚀的方法确实有效的提高了分辨率，但是切片在电子流中暴露的时间过长或者加速电压过高，都会导致样品变形，细微结构遭到破坏。而且在准备AFM观察的样品之前，都必须经过一个电镜样品制备以及观察的程序，不仅步骤繁琐，成本也大。

总的说来，这些方法虽然能够在一定程度上提高AFM观察生物组织超薄切片的分辨率，但是都存在一些不足，诸如容易造成样品损伤变形，步骤繁琐，成本高等等。

发明内容：

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种基于原子力显微镜观察的超薄切片在云母表面的贴附方法，样品制备简单、成本低廉，不破坏样品的细微结构，所得的图像具有亚细胞的分辨水平，更具有实用价值。

为实现这样的目的，本发明采用了改进的常规超薄切片技术，将培养细胞或病理组织超薄切片平整地贴附在云母表面。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)按一般电镜超薄切片法制备包埋块，包埋液可用国产的环氧树脂618

或者进口的Epon812，但样品固定时无需锇酸，也无需块染，因重

金属无助于提高分辨率，且锇酸昂贵。

(2)超薄切片机切片，用新制备的玻璃刀，半薄切片定位后，选取感兴

   趣部位进行超薄切片，飘浮液为超纯水，选择银白色或铅白色的片

   子，用铂金环捞取，事先准备新剖裂的云母薄片，大小约1.5cm见

   方，吸取约15μl超纯水滴于云母表面，将铂金环轻轻浸在水滴中，

   从侧面移走铂金环，切片就飘浮在水面上。

(3)调烘片机温度在40-65℃之间，将云母置于烘片机上，缓慢烘干5-10

   分钟后，水渐渐蒸发干，切片将平整地贴附于云母表面。

(4)将云母置于干净的培养皿中，保存在低温干燥的环境中备用，注意

   防尘。

本发明所说的超薄切片技术为现有技术，从事生物电镜样品制备的技术人员均能够实施这一方法。

本发明的方法步骤简单，成本低廉，与一般供电镜观察的超薄切片相比，省去染色这一步骤，也无需电子蚀刻或者去包埋剂的过程，无需锇酸固定和铅、铀重金属染色，不会破坏样品的细微结构，适用于制备各种生物样品。

附图说明及具体实施方式：

图1、图2、图3、图4为本发明实施例中制备的样品在AFM(NanoscopeIIIa from Digital Instrument，Santa Babara，CA)空气中轻敲模式下观察的图像。

其中，图1、2为人舌鳞状细胞癌组织。

图3、4为舌鳞癌培养细胞PCA8113。

如附图所示，利用本发明方法制备的样品所得的图像具有亚细胞水平的分辨率，与Osada等使用的电子束刻蚀方法相比，具有相似的分辨水平，局部胞内的超微结构甚至更为清晰。

实施例1

人舌鳞状细胞癌组织样品取自某医院口腔颌面外科临床手术，以2％戊二醛固定液低温固定1～2小时，或者在冰箱中冷藏过夜。以PBS缓冲液冲洗，乙醇梯度脱水，环氧乙烷置换，环氧树脂618渗透并包埋。LKB-2088 V型超薄切片机切片，所用的玻璃刀为LKB-7800制刀机新制备。选择银白色或铅白色的片子，铂金环捞取置于云母上的水滴中。烘片机温度调至60℃，将云母缓慢烘干。AFM轻敲模式下观察。所得图像见图1、图2：视野中可见呈分裂相的细胞核，核内染色质活跃，相对细胞质较少，核质比小，细胞形态异常，这些都是肿瘤细胞的典型特征。扫描范围：16μm×16μm。

实施例2

舌鳞癌培养细胞PCA8113取自某口腔医学研究所口外肿瘤生物实验室，2％戊二醛固定，脱水后离心收集，环氧树脂618渗透并包埋。切片后云母收集，置50℃烘片机上缓慢烘干。AFM轻敲模式下观察。所得图像见图3、图4。

图3所显示的是一个肿瘤细胞，胞内线粒体丰富，提示细胞代谢活动旺盛。图4显示的是一个肿瘤细胞内的巨大的核，核膜清晰，可见两个核仁，近核区域细胞器丰富，细胞外的平整区域为环氧树脂。图3扫描范围：15μm×15μm，图4扫描范围：20μm×20μm