保护临床化学用质量控制血清中酶活性的方法

摘要

本发明涉及一种保护医学检验质量控制物的方法，特别是涉及一种保护临床化学用质量控制血清中酶活性的方法，该方法包括以动物血清为原料制备所述血清的常规工艺步骤，在制备过程中液体血清冷冻或脱水之前加入海藻糖作为血清酶的稳定剂，按每升液体血清计，海藻糖的加入量为0.10－0.25mol。采用本发明方法制备的质量控制血清是一种物美价廉的多酶质控品，完全可以替代进口。

说明书

本发明涉及一种保护医学检验质量控制物的方法，特别是涉及一种保护临床化学用质量控制血清中酶活性的方法。

目前，国内、外各医院、实验室广泛采用临床化学用质量控制血清来进行室内质量控制和室间质量评价，以提高临床化学检验结果的准确度和精密度。所述质量控制血清有液体混合血清、商品冻干血清和定值冻干血清三种，液体混合血清的制备方法为：收集动物血清、血清处理、低温冻存；冻干血清一般以动物血清作基础物，加入所需成分，分别调至预定浓度，分装后真空冷冻干燥(以上内容详见人民卫生出版社1998年4月出版发行的《医学检验质量控制》一书，该书刊号为ISBN7-117-02852-1/R·2853)。国内产品(如卫生部上海生物制品研究所和卫生部临床诊断试剂实验中心共同生产的临床化学用定值冻干质量控制血清)可用作十多种常规临床化学检验项目(如钾、钠、氯、磷、钙、尿素氮、尿酸、葡萄糖、肌酐、总蛋白、白蛋白等)的质量控制材料，但不能用作血清酶(如谷丙转氨酶、谷草转氨酶等)的质量控制材料，原因在于国内产品中是采用稳定周期较短的金属离子、巯基化合物作酶的稳定剂，故导致血清酶的活性低、酶分子的半寿期短，无法对血清酶进行质量控制；而国外产品(如英国RANDOX公司生产的定值冻干质量控制血清)可用作上述常规临床化学检验项目和血清酶的质量控制材料，但价格昂贵，给医院和患者均带来经济上的负担。

本发明的目的在于提供一种保护临床化学用质量控制血清中酶活性的方法，采用本发明方法制备的质量控制血清还可用作血清酶的质量控制材料，且价格较低。

本发明包括以动物血清为原料制备临床化学用质量控制血清的常规工艺步骤，在制备过程中液体血清冷冻或脱水之前加入海藻糖作为血清酶的稳定剂，按每升液体血清计，海藻糖的加入量为0.10-0.25mol。

海藻糖可市购上海试剂二厂的产品。

海藻糖是一种安全无毒的非还原性双糖，化学名为1-O-D-glucosido-α-1-D-glucosidose，熔点为97℃，易溶于水、热乙醇，不溶于乙醚，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，相对分子量为378.33(含两分子结晶水)，分子构象式及Haworth式可参见中国轻工业出版社2000年出版发行的《功能性发酵制品》一书，刊号为ISBN7-5019-2694-8/TS·1644。

为了更好地理解本发明的实质，下面将用海藻糖对冻干血清中血清酶(以谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶为例)的保护试验及结果来说明其在制备质量控制血清领域中的新用途。

1材料及冻干品制备

1.1材料：海藻糖为上海试剂二厂的产品，采用上海复星长征医学科学有限公司TRACE产品作为谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)的测定试剂。

1.2对照冻干质控品：采用英国RANDOX公司生产的定值冻干质量控制血清，置于冰箱冷藏室(4-6℃)中备用。

1.3仪器：冷冻干燥机，全自动生化分析仪，BC-151冰箱。

1.4血清的分装：收集混合人血清若干毫升，立即检测新鲜混合血清中酶的活力单位，然后分装，每瓶分装2.0ml于棕色玻璃瓶中，不加海藻糖保护(无糖组)，待脱水、冻干；定量称取海藻糖配制成的四种血清，海藻糖的浓度分别为0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L，每瓶分装2.0ml于棕色玻璃瓶中(含糖组)，待脱水、冻干。

1.5冻干品制备：分装后的含糖血清、无糖血清置于冷冻干燥机内，打开瓶盖在-35℃速冻30分钟后，盖上瓶盖在-25℃连续冷冻10小时，最后，在1小时内让温度升到25℃，血清呈粉末状，包装，在4-6℃中保存备用。

2方法

2.1采用酶动力学法，分别测定血清冻干品(含糖组、无糖组)及英国RANDOX公司血清冻干品在脱水-再水化后六种酶的活性，并计算出酶的保活率(％)。

2.2酶活性的具体测定：分别在30天、60天、120天、240天、360天时把冻干品(含糖组、无糖组)及英国RANDOX公司冻干品再水化后，分别检测含糖冻干品、无糖冻干品及RANDOX公司冻干品中酶的活力。检测方法采用酶动力学法(Kinetic)、双波长、反应温度37℃，酶活力单位用u/L表示。

2.3酶保活率计算公式

通过保活率公式计算以观察冻干品(含糖组、无糖组)及英国RANDOX公司冻干品在脱水-再水化后六种酶的稳定性。

3结果

3.1在4℃保存过程中含糖血清冻干品、无糖血清冻干品中的六种酶稳定性、时效性观察：将两种冻干品分别在30天、60天、120天、240天、360天再水化后观察两者中六种酶的稳定性，结果见表1。

                                表1 保存    二种血清中六种酶的保活率(％) 时间      ALT         AST        γ-GT      ALP      LDH         CK (d)    (Y)   (N)   (Y)   (N)   (Y)  (N)  (Y)  (N)  (Y)  (N)   (Y)   (N)  30   100.0  81.3 103.8  89.2  97.1 97.1 99.1 98.2  99.2 98.5 100.0 84.7  60   100.0  68.2 100.0  88.5  98.3 96.7 98.0 98.2  98.8 96.4 100.0 85.0 120   100.0  43.8 100.0  80.1  98.5 85.3 93.8 80.4 100.0 89.8 100.0 58.0 240    93.8  31.3  96.2  65.4  94.1 74.6 93.1 60.7 100.0 88.4  93.0 58.8 360    93.8  27.7  95.8  55.4  93.7 65.0 92.9 56.8  98.9 86.3  93.3 57.5

注：Y表示加入海藻糖保护，N表示未加入海藻糖保护，d表示保存天数。

含糖血清在4℃保存360天时进行再水化，测六种酶的保活率为92.9％-98.9％，平均保活率为94.7％，而无糖血清在4℃保存30天时进行再水化，六种酶损失15.0％，保存360天时进行再水化，测六种酶的保活率低于90.0％，平均保活率为58.1％，损失达41.9％(酶失活50.0％以上)，其中ALT在360天时进行再水化，保活率仅为27.7％，酶活性损失了近50.0％(无糖血清中六种酶的上述变化可能与保存过程中六种酶分子失去维持其结构和功能特性的结构水膜有关，故无糖血清无法用作血清酶的质量控制材料)，含糖血清中的六种酶保活率是无糖血清中的六种酶保活率的1.63倍，这表明含糖血清中的海藻糖对六种酶确有良好保护作用。肉眼观察，含糖、无糖的血清冻干品分别再水化后，前者的溶液较清晰，而后者的溶液有浑浊现象，可能是无糖的血清冻干品再水化过程中脂类物质发生融合现象所为。

3.2含糖血清冻干品再水化后的六种酶保活率与该冻干品中海藻糖浓度间的关系，结果见表2。

                           表2 海藻糖浓度            含糖血清中六种酶的保活率(％)  (mol/L)    ALT      AST    γ-GT      ALP      LDH      CK   0.10     100.0    100.0   100.0     100.0    100.0    100.0   0.15     100.0    100.0   100.0     100.0    100.0    100.0   0.20     100.0    100.0   100.0     93.7     99.2     100.0   0.25     100.0    92.3    100.0     82.1     93.8     95.3

含糖血清中六种酶的保活率在82.1-100.0％之间，仅发现浓度为0.25mol/L的海藻糖对ALP有轻度抑制外，其它浓度对另外五种酶的保活效果较好(保活率＞90％)。当海藻糖浓度低于0.10mol/L时对六种酶的保活效果不佳，而浓度大于0.30mol/L时有抑制部分酶活性的现象，故海藻糖的浓度为0.15-0.20mol/L最适宜。

3.3含糖血清冻干品与英国RANDOX公司冻干质控品分别再水化后六种酶保活率的对比，结果见表3。

                                 表3放置    国内外二种冻干品再水化后六种酶的保活率(％)时间       ALT        AST        γ-GT        ALP          LDH        CK(d)    (H)   (R)   (H)   (R)   (H)   (R)   (H)   (R)   (H)   (R)   (H)   (R) 1    100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 2    100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 3    100.0 90.9  93.3  100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 91.3  91.1  91.1  92.2

注：H表示含海藻糖的血清冻干品，R表示英国RANDOX公司的冻干质控品，d表示冻干品再水化后的放置天数。

含糖血清冻干品与RANDOX公司冻干品分别再水化后，在4℃下对照观察3天，六种酶的总保活率分别为95.9％和95.4％，差异甚微。

3.4实验还表明：海藻糖对冻干血清中的其它种血清酶、对液体血清中的血清酶也具有保活效果。

4结论及原因探讨：

4.1上述保护试验证实了海藻糖具有抗冻结、抗干燥、可稳定生命体细胞膜和蛋白质结构的非特异性保护功能，可增强血清中酶的稳定性，使酶保活率较为稳定，而其本身不被酶分解，同时给出了海藻糖保活酶的浓度范围。

4.2海藻糖的作用机理可通过以下二种假说来解释：

4.2.1水替代假说，即：当血清中的酶蛋白分子因干燥、失去维持其结构和功能特性的结构水膜时，海藻糖可与酶蛋白表面分子的失水部位以氢键形式相联结，形成了一层保护膜以代替失去的水膜，起到了生物体水膜的代替物作用，海藻糖还能通过氢键有效地与外部水分子相连接，制造了为维持生命体所必须的水分子相似构造，从而保护了酶蛋白分子表面，稳定了酶蛋白分子的构象，使酶蛋白结构不被破坏；

4.2.2玻璃态假说，即：当血清中的酶蛋白分子在干燥环境下失水所伴随的细胞内盐浓度的变化而导致蛋白变性、膜构造变化时，酶蛋白分子可通过稳定周期长的海藻糖玻璃化转变的趋势，导致其在海藻糖中的无定形连续相的形成，在结构上与玻璃状的冰相似，在这种结构中酶蛋白分子的运动和变性反应非常微弱，使酶分子的生物半寿期延长，从而稳定了酶蛋白分子的构象，使酶蛋白结构不被破坏。

4.3用动物血清、加入海藻糖后按常规工艺步骤制得的冻干血清符合医学检验质量控制物的总要求，其技术规格为：

PH:7.2-7.8(37℃)，

冻干物水份含量：＜1％，

瓶间变异：酶类CV＜2％，其余分析物CV＜1％，

冻干品有效期＞24月(4℃)，

最长复溶时间≤30分钟，2-8℃稳定时间≥72小时，

细菌＜100cfu/ml

氮含量＜50μmol/L

吸光度值检测：340nm＜4.0,460nm＜5.0,550nm＜0.9,700nm＜0.8。

从以上保护试验及结果，可以得出本发明的优点在于：

(1)、在保护试验中设立无糖血清冻干品、含糖血清冻干品、英国RANDOX公司冻干质控品为对照组进行随机试验，并经统计学处理结果，前二者呈显著性或极显著性差异，有糖组明显优于无糖组，后二者差异甚微，证明海藻糖对血清中的血清酶具有显著的保活作用。

(2)、本发明将来源丰富、价廉的海藻糖用于临床化学用质量控制血清中酶活性的保护，对海藻糖发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。加入海藻糖制成的质量控制血清可作为血清酶(如谷丙转氨酶、谷草转氨酶等)的质量控制物，在血清酶检验结果的质量控制中使用效果良好，是一种物美价廉的多酶质控品，完全可以替代进口质控品。

下面将描述本发明的几个实施例，但本发明的内容完全不局限于此。

实施例1

取1L健康猪血清、0.10mol海藻糖混合，置于磁搅拌器混匀，分装、封口后标记日期，置-20℃以下低温冻存，制得液体混合血清。本例为保护临床化学用液体质量控制血清中酶活性的方法。

临用前从冰箱取出，在室温中融解后轻轻混匀，待恢复至室温，有效期为24个月。可作为血清酶、常规顶目(如钾、钠、氯、钙、磷、葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、总蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸等)的室内质控物，也可用于小范围的室间质量评价工作(实施例2、实施例3同此)。

实施例2

取1L健康猪血清、0.15mol海藻糖混合，置于磁搅拌器混匀，分装、封口后标记日期，置-20℃以下低温冻存，制得液体混合血清。本例为保护临床化学用液体质量控制血清中酶活性的方法。

实施例3

取1L健康猪血清、0.20mol海藻糖混合，置于磁搅拌器混匀，分装、封口后标记日期，置-20℃以下低温冻存，制得液体混合血清。本例为保护临床化学用液体质量控制血清中酶活性的方法。

实施例4

取1L人血清、0.10mol海藻糖混合，置于磁搅拌器混匀，分装后置于冷冻干燥机中，在-35℃、瓶盖开启状态预冷冻30分钟，盖上瓶塞在-25℃冷冻8.5小时，在1小时内让机内温度升至25℃，标记日期、制得冻干血清。本例为保护临床化学用冻干质量控制血清中酶活性的方法。

该冻干血清置于4-6℃冰箱冷藏室中，有效期为24个月，临用前从冰箱取出，在室温中复溶后轻轻混匀，在室温下平衡。可作为血清酶、常规顶目(如钾、钠、氯、钙、磷、葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、总蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸等)的室内质控物，也可用于室间质量评价工作(实施例5、实施例6同此)。

实施例5

取1L人血清、0.15mol海藻糖混合，置于磁搅拌器混匀，分装后置于冷冻干燥机中，在-35℃、瓶盖开启状态预冷冻30分钟，盖上瓶塞在-25℃冷冻8.5小时，在l小时内让机内温度升至25℃，标记日期、制得冻干血清。本例为保护临床化学用冻干质量控制血清中酶活性的方法。

实施例6

取1L人血清、0.20mol海藻糖混合，置于磁搅拌器混匀，分装后置于冷冻干燥机中，在-35℃、瓶盖开启状态预冷冻30分钟，盖上瓶塞在-25℃冷冻8.5小时，在1小时内让机内温度升至25℃，标记日期、制得冻干血清。本例为保护临床化学用冻干质量控制血清中酶活性的方法。