重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂

摘要

本发明涉及重组高效重组高效复合干扰素(Recombinant SuperCompound Interferon,rSIFN－co)作为乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂的应用。

说明书

本发明涉及重组高效复合干扰素(Recombinant Super Compound Interferon,rSIFN-co)，的应用。

重组高效复合干扰素是将几种天然人α-干扰素亚型中最常见的保守性氨基酸结构用遗传工程的方法以建构而成的一种全新干扰素分子，美国专利4695623、4897471中对此种干扰素已经有所描述，已证明rSIFN-co具有广谱的干扰素活性，有较强的抗病毒和抗肿瘤及天然杀伤细胞活性，美国专利5372808公开了用重组高效复合干扰素治疗疾病的方法，中国专利97193506公开了应用重组高效复合干扰素再次治疗丙型肝炎的方法，中国专利98114663公开了重组高效复合干扰素的制备方法和治疗乙型肝炎和丙型肝炎的用途。美国食品与药品管理局(FDA)已于1997年底批准了美国Amgen公司用大肠杆菌生产的rSIFN-co用于临床丙肝病人的治疗。对于乙型肝炎病人的诊断，当检测出表面抗原(HBsAg)阳性和e抗原(HBeAg)阳性者即可判定为乙型肝炎患者，目前临床上采用各种类型的α-干扰素对慢性乙型肝炎患者进行治疗，其作用机理是：干扰素与细胞表面的特殊膜受体结合而发挥其抗DNA和RNA的作用。包括对某些酶的诱导作用阻止受病毒感染细胞中病毒的复制。但用干扰素治疗乙型肝炎的疗效始终未被证实。本发明惊奇的发现，重组高效复合干扰素对于乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原具有有效的抑制作用，从而证明重组高效复合干扰素可以通过抑制乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原达到治疗乙型肝炎的目的。

本发明的目的是提供用于治疗乙型肝炎的重组高效复合干扰素药物，通过服用这种药物抑制乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原，使之降低到正常水平，达到治疗目的。本发明是通过以下方式实现的：本发明首先通过基因重组技术制备出具有如图一序列的重组高效重组高效复合干扰素，本发明的重组技术利用大肠杆菌优先表达密码子，在保证氨基酸序列不变的情况下，对其DNA编码序列进行了重新设计，然后人工合成其rSIFN-co全长的cDNA基因。本发明采用重组DNA技术将上述rSIFN-co全长cDNA序列克隆到大肠杆菌高效表达载体中去，然后利用L-阿拉伯糖诱导/活化表达调控机制激活载体中的强P_BAD启动子介导下游的rSIFN-co基因高效表达。这一阿拉伯糖诱导/活化表达调控系统比通常遗传工程生产中所采用的温控、pH调控、IPTG诱导等系统有明显的优点：(1)通常采用的几种调控系统都是以“去阻遏”的形式解除对功能启动子的抑制作用，从而启动子可介导下游基因的表达。改变温度、pH值本身以及加入IPTG诱导物等都对启动子无直接激活作用。在我们采用的系统中，阿拉伯糖与阻遏蛋白(AraC)结合后，不仅解除了对P_BAD启动子的抑制作用，同时“阿拉伯糖-AraC复合物”又可直接激活P_BAD启动子介导下游基因的表达。所以阿拉伯糖诱导/活化调控系统是一种比其它几种系统更有效的大肠杆菌高效表达系统；(2)P_BAD启动子活化的程度与加入的L-阿拉伯糖剂量成线性关系。这样可以直接通过改变阿拉伯糖浓度而调节外源基因产物的表达量。这一特性对改变包涵体的形成等非常有意义。加入阿拉伯糖比改变温度/pH等更容易直接控制外源基因产物在大肠杆菌中的表达；(3)L-阿拉伯糖来源丰富，价廉、无毒性，这克服其它诱导物如IPTG在这方面的缺点。

本发明用阿拉伯糖诱导/活化系统建立了高效、稳定的rSIFN-co表达大肠杆菌工程菌株，通过对该菌株在适宜的条件下的培养发酵获得了大量高纯度的rSIFN-co蛋白以用于本发明的研究和临床治疗。

本发明的应用方法是通过患者服用重组高效复合干扰素达到治疗目的，患者服用的重组高效复合干扰素可以制成各种剂型如：片剂、胶囊、口服液、贴剂、注射剂、喷雾剂、栓剂、溶液制剂，推荐的剂型为注射剂，可皮下或静脉注射给药，药物组合物中的载体可使用任何一种适宜的药物可接受的载体，这些载体可以是糖类、纤维素制品、粘合剂、崩解剂、润滑剂、填充剂、增溶剂、缓冲剂、防腐剂、增稠剂、配合剂和其他佐剂。

图一：为rSIFN-co的DNA编码序列以及推断的氨基酸序列

本发明通过以下实验验证了重组高效复合干扰素对乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制作用，实验方法如下：

溶剂及配制方法：受试药物配制时向每支原料瓶内加入1ml生理盐水，溶解后，再根据所设不同剂量组浓度差异用MEM培养液调配。现用现配。保存条件：4℃冰箱保存。

对照药品：先灵公司生产的IFN-α2b干扰能为冻干制剂，每支3×10⁶U实验时用培养液配成3×10⁶IU/ml溶液。2.2.15细胞：乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的

2.2.15细胞系：美国Mount Sinai医学中心构建，我室引进后自行传代培养。

试剂

Eagles MEM干粉，美国Gibco公司产品；胎牛血清，美国Hyclone Lab公司产品；G-418(Geneticin),MEM配制，美国Gibco公司产品；L-谷氨酰胺，京科化学试剂公司进口分装；HBsAg,HBeAg固相放射免疫测定盒，购自中国同位素公司北方免疫试剂研究所；卡那霉素，华北制药厂产品；Lipofectin，美国Gibco公司产品。

实验用品及仪器

培养瓶，丹麦Tunclon TM；培养板96孔板、24孔，美国Corning公司产品；二氧化碳孵箱，美国Shel-Lab产品；

细胞培养液及试剂配制

MEM培养液100ml：含胎牛血清10％,3％谷氨酰胺1％,G418 380μg/ml卡那毒素50U/ml。

试验方法

2.2.15细胞培养

在长满2.2.15细胞的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加培养液吹打，1∶3传代，10天长满。

药物对细胞毒性试验

实验分无药物细胞对照组和不同药物浓度给药组。细胞消化，配制成每毫升10万个细胞，接种培养板，96孔板每孔200μl,37℃5％CO₂培养24小时，细胞长成单层后进行实验。高效重组高效复合干扰素用培养液配制成1.8×10⁷IU/ml溶液，2倍稀释加入96孔细胞培养板，每浓度3孔，每4天换同浓度药液，以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制％。按Reed Muench法计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。 $>>TC>50>=>Anti>log>>(>B>+>>>50>->B>>>A>->B>\; >\times >C>)>>>s>A=log＞50％药物浓度B=log＜50％药物浓度C=log稀释倍数$

对HBeAg、HBsAg抑制试验

试验设HBeAg、HBsAg阳性对照组，阴性对照组，细胞对照组及不同药物浓度给药组。每毫升70万个2.2.15细胞接种6孔细胞培养板，每孔3ml,37℃5％CO₂培养24小时，加无毒浓度以下3倍稀释试验药液，5个稀释度分别为4.5×10⁶IU/ml、1.5×10⁶IU/ml、0.5×10⁶IU/ml、0.17×10⁶IU/ml、和0.056×10⁶，每浓度1孔，37℃5％CO₂培养，每4天换原浓度药液培养，第8天时收获培养液，-20℃冰冻保存。试验重复三批，分别测定HBsAg和HBeAg。HBsAg和HBeAg测定采用中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品，固相放射免疫测定盒测定，方法见说明书，用γ-计数仪测定每孔cpm值。

药物效果计算：计算细胞对照及每浓度cpm均值及标准差，P/N值如抑制百分率(％)，半数有效浓度(IC50)及选择指数(SI)。②计算药物抑制抗原半数有效浓度(IC50)： $>>IC>50>=>Anti>log>>(>B>+>>>50>->B>>>A>->B>\; >\times >C>)>>>s>A=log＞50％药物浓度 B=log＜50％药物浓度 C=log稀释倍数③辉特福重组高效复合干扰素在2.2.15细胞培养内对HBsAg和HBeAg的选择指数(SI)，按其对细胞毒性指标细胞病变(SI)计算。④以t检验法计算各稀释度HBsAg、HBeAg和对照组间cpm的差别。$

对2.2.15细胞DNA抑制实验

2.2.15细胞上清中HBV-DNA提取：每毫升70万个2.2.15细胞接种6孔细胞培养板，每孔3ml接种于培养板，接种后24小时加入干扰素，每4天换原浓度药液培养，加药后培养8天，收取上清液，加入聚乙二醇沉淀，离心去上清，加入酵母t-RNA，加蛋白酶K裂解细胞，等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，高速10,000g离心，取上清，加无水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于TE缓冲液中作为样品。

斑点杂浆：←点样：取20ul(DNA含量25μg)，加变性液，变性，并用中和液将其中和，并以20X SSC缓冲液对倍稀释各点至1∶128倍稀释于硝酸纤维素膜上，膜置室温凉干后放置到80℃烤箱中干烤，以固定DNA↑预杂交：将硝酸纤维素膜装于塑料袋中加预杂交液6ml，置水浴中预杂交2小时。→杂交：加入5X10⁷cpmα-³²P-dCTP标记的变性HBV-DNA探针，于42℃水浴中杂交14-18小时。↓洗膜：以0.1×SSC/0.1％SDS分别在室温和65℃洗膜。放射自显影：吸干膜上流动水分，夹片、爆光。以常规方法冲洗X光片，扫描仪扫描光片，用gel-pro软件测定密度，计算抑制率及IC50。

Southern blot:2215细胞内HBV——DNA提取：2215细胞加药后培养8天，吸除培养液收取细胞，加入细胞裂解液，裂解细胞，等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，高速10,000g离心，取上清，加无水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于20μl TE缓冲液中，加入6X DNA样品缓冲液，将样品加于1.5％琼脂糖胶上电泳，IV/cm，恒压，14-18小时。→变性、杂交：将胶分别浸于HCl、变性液、中和液中。↓转膜：按程序将DNA转至Hybond-N膜上。同斑点杂交一同进行烤膜、杂交、爆光。扫描仪扫描光片，以gel-pro凝胶分析软件分析相对密度，计算抑制率及IC50。

统计与分析方法：

各组计量资料结果用算术平均数(7)±标准差(S)表示。根据中国《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》的有关新药药效学研究中统计处理的指导原则，计数资料用Fisher精确检验，计量资料选择Student t检验进行各组均数差异显著性。

本发明通过几批实验的结果(表一、表二)证明，重组高效复合干扰素具有明显的抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原活性，而对照组干扰能组不具有上述活性。有限的临床病例也证实了慢性活动性乙型肝炎患者，通过服用重组高效复合干扰素使乙型肝炎表面抗原和e抗原阳性降低或恢复到正常水平。

本发明应用的重组高效复合干扰素制剂可通过如下实施例制备：实施例一：冻干注射剂的制备

a．重组高效复合干扰素            300万IU；

b．枸橼酸                        0.2毫克；

c．磷酸氢二钠                    2.5毫克；

d．氯化钠                        4.0毫克；

e．右旋糖酐                      20毫克；

f．聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯    0.1毫升；g．注射用水                      适量加至1.0毫升。制备工艺：按处方称料，用无菌无热原注射水溶解，除菌过滤用0.22μm孔径滤膜除菌过滤，保存于8±2℃，取样作无菌和热原检查合格后分装于西林瓶中，单剂量装每瓶1.1ml。分装后放置到冻干机中冷冻干燥。实施例二：水溶液注射剂的制备a．重组高效复合干扰素            300万IU；b．枸橼酸                        0.2毫克；c．磷酸氢二钠                    2.5毫克；d．氯化钠                        4.0毫克；e．右旋糖酐                      20毫克；f．聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯    0.1毫升；g．注射用水                      适量加至1.0毫升。制备工艺：按处方称料，用无菌无热原注射水溶解，除菌过滤用0.22μm孔径滤膜除菌过滤，保存于8±2℃，取样作无菌和热原检查合格后分装于密闭容器中。分装于西林瓶中，单剂量装每瓶1.1ml。分装后成品置2-10℃下暗处保存。

表一：测定rSIFN-con对乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制率的实验结果：第一批实验

e抗原细胞对照        16010空白              0稀释倍数    3   IC50       602.74446016浓度第一孔第二孔第三孔第一抑制率第二抑制率第三抑制率平均抑制率累加  1-累加累加抑制率 900 9026 8976 10476 0.436227 0.43935 0.345659 0.407079 0.945909 0.592921 0.614693546 300 9616 12082 10098 0.3993754 0.245347 0.369269 0.337997 0.5388299 1.254924 0.300392321 100 9822 16002 12800 0.386508 0.0005 0.2005 0.195836 0.200833 2.059088 0.08867188 33.33333 15770 19306 16824 0.014991 0 0 0.004997 0.0049969 3.054091 0 001633453 11.11111 19172 22270 18934 0 0 0 0 0 4.054091 0表面抗原细胞对照     11714空白           0稀释倍数    3 IC50          641.7736749浓度第一孔第二孔第三孔第一抑制率第二抑制率第三抑制率平均抑制率累加 1-累加累加抑制率 900 7706 7240 7114 0.342155 0.381936 0.392693 0.372261 0.922258 0.627739 0.595006426 300 8856 7778 9476 0.2439816 0.336008 0.191053 0.257014 0.5499972 1.370724 0.286349225 100 10818 10720 10330 0.07649 0.084856 0.118149 0.093165 0.292983 2.27756 0.113977019 33.33333 10744 11114 10570 0.082807 0.051221 0.097661 0.07723 0.1998179 3.20033 0.058767408 11.11111 10672 9352 10810 0.088953 0.201639 0.077173 0.122588 0.122588 4.077742 0.02918541第二批实验e抗原细胞对照        16962空白           0稀释倍数    3 IC50          365.9357846浓度第一孔第二孔第三孔第一抑制率第二抑制率第三抑制率平均抑制率累加1-累加累加抑制率 900 7818 8516 9350 0.554378 0.514592 0.467054 0.512008 1.371181 0.487992 0.737521972 300 10344 10628 9160 0.4103967 0.394209 0.477884 0.427497 0.8591731 1.060496 0.447563245 100 12296 14228 13262 0.299134 0.18901 0.244072 0.244072 0.4316577 1.816423 0.19201839 33.33333 15364 17414 16188 0.124259 0.00741 0.77291 0.069653 0.1876045 2.74677 0.063933386 11.11111 17386 13632 15406 0.009006 0.222982 0.121865 0.117951 0.117951 3.628819 0.03148073表面抗原细胞对照空白             0稀释倍数    3 IC50         611.0919568浓度第一孔第二孔第三孔第一抑制率第二抑制率第三抑制率平均抑制率累加 1-累加累加抑制率 900 5784 6198 5792 0.498265 0.462353 0.497571 0.486063 0.893477 0.513937 0.634835847 300 7150 8534 8318 0.379771 0.259715 0.278452 0.30598 0.4074138 1.207957 0.252210647 100 9830 11212 10210 0.147294 0.027412 0.11433 0.096345 0.101434 2.111612 0.04583464 33.33333 13942 12368 13478 0 0 0 0 0.0050891 3.111612 0.001632835 11.11111 12418 11634 11352 0 0 0 015267 0.005089 0.005089 4.106523 0.001237728第三批实验e抗原细胞对照        17544空白             0稀释倍数    3 IC50          382.0496935浓度第一孔第二孔第三孔第一抑制率第二抑制率第三抑制率平均抑制率累加1-累加累加抑制率 900 9702 9614 8110 0.428016 0.433204 0.521872 0.461031 1.316983 0.538969 0.709599543 300 8914 10032 8870 0.4744723 0.40856 0.477066 0.453366 0.8559525 1.085603 0.440859127 100 16312 12688 13934 0.038321 0.251975 0.178517 0.156271 0.402586 1.929332 0.172641621 33.33333 15080 12814 13288 0.110954 0.244547 0.216602 0.190701 0.2463153 2.738631 0.082519158 11.11111 21928 15366 15728 0 0.094093 0.072751 0.0055615 0.055615 3.683017 0.014875633表面抗原细胞对照        11528空白           0稀释倍数    3 IC50          694.7027149浓度第一孔第二孔第三孔第一抑制率第二抑制率第三抑制率平均抑制率累加1-累加累加抑制率 900 5616 6228 5346 0.496864 0.442035 0.521054 0.486651 0.763125 0.513349 0.597838293 300 8542 8590 7096 0.234725 0.230425 0.364272 0.276474 0.2764738 1.236875 0.182690031 100 11420 11360 11394 0 0 0 0 0 2.236875 0 33.33333 12656 11582 13110 0 0 0 0 0 3.236872 0 11.11111 13142 12336 13342 0 0 0 0 0 4.236875 0

E抗原：   IC50均值450.2434    标准差132.315479

表面抗原：IC50均值649.1894    标准差42.29580表二：干扰能(IFN-α2b)第一批实验

e抗原细胞对照        17544空白           0稀释倍数    3 IC50         FALSE浓度第一孔第二孔第三孔第一抑制率第二抑制率第三抑制率平均抑制率累加1-累加累加抑制率 300 14918 11724 9950 0 0.029711 0.176529 0.068747 0.068747 0.931253 0.068746724 100 14868 16890 15182 0 0 0 0 0 1.931253 0 33.33333 16760 21716 16400 0 0 0 0 0 2.931253 0 11.11111 20854 15042 16168 0 0 0 0 0 3.931253 0 3.703704 12083 12083 12083 0 0 0 0 0 4.931253 0表面抗原细胞对照    10886空白           0稀释倍数    3 IC50    FALSE浓度第一孔第二孔第三孔第一抑制率第二抑制率第三抑制率平均抑制率累加1-累加累加抑制率 300 9226 8196 9658 0.152489 0.247106 0.521054 0.1708 0.189295 0.8292 0.185857736 100 10946 10340 10828 0 0.050156 0.364272 0.018495 0.0184947 1.810705 0.010110817 33.33333 12250 12980 13934 0 0 0 0 0 2.810705 0 11.11111 12634 12342 12000 0 0 0 0 0 3.810705 0 3.703704 10886 10886 10886 0 0 0 0 0 4.810705 0