利用远缘杂交和孤雌生殖生产玉米杂交种子的方法

摘要

本发明提供了一种利用远缘杂交和孤雌生殖生产玉米杂交种子的方法。为克服现有技术中结实率低,杂种后代疯狂分离等缺点,本发明将远缘杂交和该良的孤雌生殖相结合生产玉米杂交种子。用本发明的方法已培育出多个优良品种。

说明书

本发明涉及生产玉米杂交种子的方法，具体地说，本发明涉及利用远缘杂交和孤雌生殖生产玉米杂交种子的方法。

在玉米育种上的主要问题是种质遗传基础狭窄。长期以来，国内外玉米育种一直沿用品种间杂交和系统选育方法，亲缘关系近，不能解决遗传基础贫乏，育种工作的水平和进展受到很大局限。为了种质遗传基础的拓宽并创造新种质资源，提高育种水平，许多遗传育种学家都把注意力集中在野生资源的开发利用上。通过远缘杂交途径将野生近缘种属的有经济价值的基因导入栽培玉米，以创造出遗传多样性的新种质。

玉米远缘杂交育种方法是以玉米作母本，以近缘种属作父本进行杂交。杂交时将父本花粉授在母本的花丝上。第2年将杂种一代(F₁)植株与玉米回交获得回交一代(BC₁)。第3年从BC₁中选优良单株与玉米回交获得回交二代(BC₂)。直至第8至10年，甚至更长时间如此连续进行回交下去。在回交过程中，也可采用回交与自交交替进行。

利用这种方法结实率很低，以二倍体多年生大刍草为例，一般情况每个果穗结实在10粒以下或更低，甚至不结实。再者，其远缘杂种后代长期疯狂分离不能稳定。自70年代以来，中外遗传育种学家就开展了玉米远缘杂交育种研究，一直采用这种常规的经典的连续多代回交方法，或自交与回交交替等方法，以至经过连续回交8代以上，甚至更多世代仍不能得到稳定后代，用此方法至今尚未获得遗传性稳定的在育种上利用的优良异源种质纯系(Petrov 1976，In：S.S.khokhlov，Apomixis and Breeding，pp18-28，Amerind publishing co.pvt，ltd，New Delhi；Zhelegnova 1976，Tr.-Biol.-in-ta.-sib.-otd.-AN-SSSR.No.30.109-115；Magoja等1994 In：Biotechnology inAgricuture and Forestry.Vol.25，maize(ed.by Y.P.S.Bajaj)springer-verlag BerlinHeidelberg；牛应峰等1993四川农业大学学报，11(4)579-584和赖仲铭等1991中国的遗传学研究，中国科学出版社，P.85-87.)。为此，必须寻找新的途径。

本发明的目的是提供一种利用远缘杂交和孤雌生殖生产玉米杂交种子的方法。

现有技术中诱导玉米孤雌生殖的方法有：(1)生物学因素诱导，它包括品种间和远缘杂交法，延迟授粉法，异源细胞质法，双生苗分选法等；(2)物理学因素诱导，它包括射线照射(X射线，r射线，紫外线等)，热中子流辐射，温度处理等；(3)化学因素诱导，它包括生长素类，激素类，诱变剂类和其他类化学物质。其处理方法有两种，一种是药物处理与授粉相结合，另一种是单独药物处理。

过去玉米的孤雌生殖诱导，主要是通过生物学因素，如品种间杂交和远缘杂交法，延迟授粉法，异源细胞质法和双生苗选择法等，物理学因素，如X或r射线照射，紫外线照射，热中子流辐射，温度处理等，化学因素，如化学药剂处理花粉结合授粉等，这些方法所获得的孤雌生殖为单倍体，其诱导频率低，所用材料均为自交系或品种间杂交种(Chase 1969，Bot，Rev.35(2)117-167；1974，Advances and potential(Ed.K.Kasha)univ.of Guelph.Guelph，ontario，canada，P.2 11-230；Deanon 1957 philipp.Agric.41：364-377)。

单独使用化学药物诱导孤雌生殖的研究在棉花、番茄、黄瓜、黑穗状醋栗等植物上有报道。但在80年代以前，主要粮食作物之一的玉米尚未有这方面的研究。

我们实验室自80年代初以来，首先开展了化学药物诱导玉米孤雌生殖技术的研究，其目的在于诱导玉米孤雌生殖单倍体，经加倍得到纯合二倍体，这种方法对杂种优势强的作物玉米的育种是一条快捷的新途径。

本发明的利用远缘杂交和孤雌生殖生产玉米杂交种子的方法包括以下步骤：

(1)以玉米作母本，以二倍体大刍草作父本，将父本于抽穗前进行暗处理25-30天，在授粉前花丝吐出后在靠近果穗顶部剪去花丝，或剪掉果穗轴顶尖0.1-0.5公分及花丝，1-3天后，当花丝再长出0.5-1.5公分时授粉，得到杂种F₁；

(2)以玉米作母本，以远缘杂种F₁作父本进行回交获得回交一代(BC₁)；

(3)在BC₁植株群中选玉米型的优良植株进行如下处理：

果穗吐丝后4-6天，在距果穗轴顶部0.0-0.5厘米处剪掉花丝，于次日或当天花丝长至1.0-2.0公分左右时将含有2-4％二甲基亚砜和30-50ppm马来酰胼MS水溶液喷雾在花丝上，得到孤雌生殖纯合二倍体种子(Pa₁)；

(3)从孤雌生殖一代(Pa₁)植株群体中对单株的抗性，综合农艺性状进行鉴定，评选出若干优良单株，其植株结实的种子为Pa₂；

(4)从孤雌生殖二代(Pa₂)株系中对株系的遗传稳定性，综合农艺性状，抗性等鉴定，评选出优良纯系，并同时配制测交组合，得到玉米杂交种子。

上述方法中的二倍体大刍草可以是二倍体多年生大刍草。

上述方法中，第2步骤的剪花丝的时间以上午8时以前为佳，主要防止空气中花粉污染；喷雾药液时间以下午7时以后为佳，其一是为了避免温度过高，减少药液过快蒸发，其二防止空气中花粉污染。

上述方法中，第2步骤的组成为2-4％二甲基亚砜+30-40ppm马来酰胼MS水溶液中加入500-700ppm PEG(6000)，其诱导孤雌生殖结实效果提高；在该药液中加入500-700ppm PEG(6000)+2-4％Tween20，其诱导孤雌生殖结实效果更佳。

上述方法中，第2步骤的药液喷雾若连续两天内喷雾两次效果更好。

单独化学药物诱导孤雌生殖的优点是，它不需要授粉者的花粉或雄配子的刺激参与受精，仅靠药物诱发产生单性生殖，这就免去了上面所述的生物因素，以及其授粉结合的物理因素和药物诱导等多种方法处理后，必须从杂种中挑选单倍体或纯合二倍体进行鉴别，选择等程序，大大简化了孤雌生殖诱导的手续，和节省了大量的工作量。

用本发明的化学药物诱导玉米孤雌生殖方法处理未授粉的玉米自交系、改良种、农家种、杂交种，均获得比以往的孤雌方法更好的效果，其诱导孤雌生殖结实率按处理小花计算平均为0.193％，最高达到0.456％，自然孤雌生殖结实率为0.0005％。

如上所述其他方法诱导的孤雌生殖为单倍体，而我们的药物诱导玉米孤雌生殖技术的突出优点是，这一方法诱导孤雌生殖直接产生纯合二倍体，而不是单倍体，这就逾越了玉米单倍体加倍困难的障碍。

80年代以来我们将经过改进的化学药物诱导孤雌生殖产生纯合二倍体技术应用于玉米与二倍体多年生大刍草的远缘杂交育种上，获得了很好的效果。关于二倍体多年生大刍草与玉米的亲缘关系，有学者认为是同一属的两个种，另一些学者认为是两个不同的属，至今尚无定论。在玉米远缘杂交育种中应用化学药物诱导孤雌生殖技术，迄今国内外尚无这方面的研究。通过多年的育种实践证明，化学药物诱导孤雌生殖技术用于玉米远缘杂交育种，提高了结实频率，克服了杂种后代长期疯狂分离不稳定的老大难问题，使之在早代(Pa₂)遗传性稳定下来。迄今我们已先后选用不同遗传背景的不同生态型玉米作母本与二倍体多年生大刍草作父本杂交的远缘杂种BC₁作诱导孤雌生殖的供体亲本，均能在其孤雌生殖早代(Pa₂)获得遗传性稳定的纯系，这表明该方法具有高度重复性。现在我们已经选育出一批优异的异源种质纯系，如，540，540优，445A，515A，pt101，pt103，中1575，中1580等。它们已配制出优良杂交种，有的如遗单6号品种(5003×540)已通过审定在生产上推广，有的如540×H₂₁，1302×540，1302×445A，8112×515A等杂交种正在参加省级区试，表现良好。还有一批优良杂交种正在各地进行适应性试验，试种、示范。除此，还创造出一大批具有经济价值的新种质资源。玉米远缘杂交育种方法选育的孤雌纯系540等及其配制的远缘杂交品种遗单6号等属于我们首创。

实施例实施例1

全部试验在北京中科院遗传所试验场进行。

我们于1985年以玉米自交系330为母本，以二倍体多年生大刍草为父本进行杂交。于抽穗前，在7月上旬至8月上旬进行遮光暗处理，从下午4时遮光至次日上午9时打开。母本于6月6-15日分两期播种，父本于4月初播种温室，于5月20日前后移栽大田。当8月下旬母本花丝抽出，用剪刀齐果穗轴顶部剪掉花丝。待花丝再长出1.0公分左右授粉，杂交果穗5个，得到杂交种子(F₁)143粒，平均每穗结实28.6粒。

第二年4月25日播种F₁种子。以F₁植株为父本，以自交系330为母本，于8月中、下旬开花抽丝期进行杂交，回交果穗6个，得到回交一代(BC₁)种子573粒，平均每穗结实95.5粒；

第三年4月25-26日播种BC₁种子。从BC₁植株群体中选玉米型生长势强、健壮、优良植株386株进行孤雌生殖处理，直接生产纯合二倍体种子(Pa₁)，处理方法如下：

果穗抽丝4天后，于上午7时半齐果穗轴顶部剪掉花丝，于次日花丝再长出1.0公分左右时，于下午7时半将药液喷雾在花丝上；

处理1药液组成为：2％二甲基亚砜+40ppm马来酰胼MS水溶液，处理果穗242个，结实34粒，每穗平均为0.141粒；

处理2药液组成为：处理1药液中加入600ppm PEG(6000)，处理果穗144个，结实43粒，每穗平均为0.299粒；

第2处理比第1处理提高结实率1.1倍，得到孤雌生殖种子77粒(Pa₁)。

1988年将孤雌生殖Pa₁种子于4月26日播种。从74株Pa₁植株群体中鉴定评选出植株生长势强、抗逆性强、抗病、抗倒伏，株型紧凑，果穗大，穗位适中，籽粒品质好，单株生产潜力大等综合农艺性状优良的单株31株，其收获种子为Pa₂。

1989年将孤雌生殖Pa₂种子于4月26日按株系播种。从Pa₂株系群中，按株系植株的整齐一致鉴定评选其纯度高和遗传性稳定，以及综合农艺性状优良(与上述标准同)株系，从其中评选出优良纯系540等，并同时将纯系540配制测交组合。

以后按常规程序经测交鉴定、品比等试验中选育出优良杂交种遗单6号(5003×540)，其特点是抗大、小斑病，抗倒伏、抗旱耐涝、不早衰，果穗粗而长，品质好，适宜粮饲兼用，已通过审定在生产应用，科试7号(H₂₁×540)已通过区试待审定。实施例2

我们于1987年以玉米自交系旅9为母本，以二倍体多年大刍草为父本进行杂交。母本于6月6-15日分两期播种，父本于4月初播种温室，于5月20日前后移栽大田。暗处理同实施例1。当8月下旬母本花丝抽出，用剪刀将果穗轴顶部0.3公分及花丝剪掉。待花丝再长出1.0公分左右授粉，杂交果穗4个，得到杂交种子(F₁)156粒，平均每穗结实39粒。

1988年4月27日播种F₁种子。以F₁植株为父本，以自交系旅9为母本，于8月中下旬开花抽丝期进行杂交，回交果穗5个，得到回交一代(BC₁)种子634粒，平均每穗结实126.8粒。

1989年将BC₁种子于4月26-28日播种。从BC₁植株群体中选玉米型生长势强、健壮、优良植株415株进行孤雌生殖处理，直接生产纯合二倍体种子(Pa₁)。处理方法如下：

果穗抽丝5天后，于上午7时齐果穗顶端剪掉花丝。于次日花丝再长出1.0公分左右时，于下午7时半将药液喷雾在花丝上。

处理药液组成为：2％二甲基亚砜+40ppm马来酰胼+600ppmPEG(6000)MS水溶液，处理果穗356个，结实110粒，每穗平均为0.309粒。

1990年将Pa₁种子于4月26日播种。从103株Pa₁植株群体中鉴定评选出优良单株46株，其收获种子为Pa₂。其鉴定评选内容，标准与实例1相同。

1991年将Pa₂种子于4月28日按株系播种。从Pa₂株系群中，按实例1相同内容，标准鉴定评选优良株系，从其中评选出优良纯系，并命名为445A，515A，并同时将纯系445A，515A纯系配制测交组合。

以后按常规程序经测交，鉴定，品比等试验中选育出优良杂交种科试12(1302×445A)和科试18(C₉×515A)正在参加省级区试。实施例3

我们于1990年以玉米单交种中单120为母本，以二倍体多年生大刍草为父本进行杂交。母本于6月6-15日分两期播种，父本于4月初播种温室，于5月20日前后移栽大田。暗处理同实施例1。当8月下旬母本花丝抽出，用剪刀齐果穗轴顶部剪掉花丝。待花丝再长出1.0公分左右授粉。杂交果穗5个，得到杂交种子(F₁)215粒，平均每穗结实43粒。

1991年4月28日播种F₁种子。以F₁植株为父本，以单交种中单120为母本，于8月中、下旬开花抽丝期进行杂交。回交果穗5个，得到回交一代(BC₁)种子814粒，平均每穗结实162.8粒。

1992年将BC₁种子于4月26-29日播种。从BC₁植株群体中选玉米型生长势强、健壮、优良植株531株进行孤雌生殖处理，直接生产纯合二倍体种子(Pa₁)。处理方法如下：

果穗抽丝4天后，于上午7时齐果穗顶端剪掉花丝，于次日花丝再长出1.0公分左右时，于下午7时半将药液喷雾在花丝上。

处理药液组成为：2％二甲基亚砜+40ppm马来酰胼+600ppmPEG(6000)+2％Tween20 MS水溶液。处理果穗436个，结实167粒，平均每穗为0.383粒。

1993年将Pa₁种子于4月28日播种。从153株Pa₁植株群体中鉴定评选出优良单株61株，其收获种子为Pa₂。其鉴定评选内容，标准与实例1相同。

1994年将Pa₂种子于4月28日按株系播种。从Pa₂株系群中，按实例1相同内容，标准鉴定评选优良株系，从中评选出优良纯系中1580等，并同时将纯系中1580配制测交组合。

以后按常规程序正在进行测交、品比等试验进行优良杂交种的评选。