N－乙酰基－(L)－4－氰基苯丙氨酸Ac(L)Phe(4－CN)－OH与N－乙酰基－(L)－对脒基苯丙氨酸－环己基甘氨酸β－(3－N甲基吡啶鎓)－丙氨酸Ac(L)-PAph－Chg-PalMe(3)－NH2的新颖的制备方法

摘要

本发明涉及一种通过拆分外消旋化合物N－乙酰基－(D,L)－4－氰基苯丙氨酸乙酯来制备N－乙酰基－(L)－4－氰基苯丙氨酸的新方法,还涉及一种用N－乙酰基－(L)－4－氰基苯丙氨酸中间体来制备Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2的立体异构体的新方法。

说明书

Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH与N-乙酰基-(L)-对脒基苯丙氨酸-环己基甘氨酸-

β-(3-N-甲基吡啶鎓)-丙氨酸

Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂

的新颖的制备方法

本发明涉及一种通过拆分外消旋化合物N-乙酰基-(D，L)-4-氰基苯丙氨酸乙酯来制备N-乙酰基-(L)-4-氰基苯丙氨酸的新方法，还涉及一种用N-乙酰基-(L)-4-氰基苯丙氨酸中间体来制备Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂的立体异构体的新方法。

1995年4月25日提交的美国专利08／428404公开并描述了外消旋化合物N-乙酰基-(D，L)-4-氰基苯丙氨酸和Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂，该专利是1994年4月26日提交的08／233054的部分继续申请，结合在此作为参考。最终产物Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂用作Xa因子抑制剂。

由于立体异构体所具有的突出于外消旋体的优点，如功效高、副作用小、毒性低或无毒等，更期望将立体异构体而不是外消旋体开发为药物。某些时候，立体异构体突出于外消旋体的优点直到在药物研究晚期或甚至直到药品已经上市以后才为人所知。很多批准药品投放市场的行政管理机构也倾向于批准一种立体异构体药品而不是外消旋体。因此，亟需一种制备化合物Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂的立体异构体的方法。制备该立体异构体的关键中间体是立体异构体N-乙酰基-(L)-4-氰基苯丙氨酸。

为了达到拆分外消旋体的目的，人们必须对各种已知工艺进行选择。一些工艺的实例有先生成非对映体、再进行结晶或差示吸附(层析法)(见Enantiomers，Racemates，and Resolutions，J．Jacques、A．Collet和S．H．Wilen著，Wiley出版公司(1981))，手性固定相上的层析分离，动力拆分，和酶催化拆分。酶催化拆分、特别是水解酶或酯化酶催化的拆分，已被证实可用于氨基酸的拆分，见Chemistry and Biochemistry of the aminoacids，纽约Chapman and Hall出版公司，1984年版，第10章第338-353页；Applications of Biochemical Systems in Organic Chemistry第I部分，J．B．Jones、C. J．Sih和D．Perlman著，纽约Wiley出版公司1976年版，第4章第107-401页；Chemistry of the Amino Acids第1卷，纽约Wiley出版公司1961年版，第9章第728-750页。

即使在选择了一种方法以后，本领域的技术人员还必须进行广泛的试验以找到恰当的溶剂、助溶剂(如果需要的话)、温度、时间及其他条件，来对外消旋体进行有效、经济的拆分，该拆分应使所需化合物易于回收、产率高、对映体过剩量高，而该方法在实施起来并不太难。本发明在拆分N-乙酰基-(D，L)-4-氰基苯丙氨酸时解决了这些问题，其中的L异构体作为中间体，再用于制备Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂、即化合物(II)。

本发明提供了一种N-乙酰基-(L)-4-氰基苯丙氨酸、即化合物(IA)的制备方法，该方法包括下列步骤：a)结合足量的化合物(Ⅰ)、

足量的含水溶液、足量的乙腈、和足量的枯草溶菌素混合，与基本量的化合物(Ⅰ)反应形成反应介质；以及b)在加入枯草溶菌素时将该反应介质调至适宜的pH，并在生成化合物(IA)的反应过程中保持该适宜的pH。

本发明进一步提供了一种Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂、即化合物(Ⅱ)或其药学上可接受的盐的制备方法，该方法包括下列步骤：a)结合足量的化合物(Ⅰ)、

足量的含水溶液、足量的乙腈、和足量的枯草溶菌素混合，与基本量的化合物(Ⅰ)反应形成反应介质；以及b)在加入枯草溶菌素时将该反应介质调至适宜的pH，并在反应过程中保持该适宜的pH，直至生成化合物(IA)：c)使化合物(IA)与化合物(3)偶合，得到化合物(4)：d)使化合物(4)的氰基转化为脒基，并甲基化吡啶基的氮原子，得到化合物(Ⅱ)。

下列术语具有如下所述的含义：

(a)“Ac”或“乙酰基”指下式的官能团：

(b)“脒基”指下式的官能团：

(c)“吡啶基”指下式的官能团：

立体异构体是所有异构体的通用术语，区别仅在于原子的空间取向不同。它包括具有一个以上手性中心的化合物的异构体，其中一种异构体并非另一种的镜像(非对映体或非对映异构体)。“对映体”指两个彼此为不可叠加镜像的立体异构体。“手性中心”指连接了四个不同基团的碳原子。所用的L／D或R／S命名原则采用国际纯粹化学与应用化学联合会和国际生物化学联合会(IUPAC-IUB)联合发布的生物化学命名原则，见Eur．J．Biochem．138:9-37(1984)。手性物质既可以含等量的R与S异构体(或L与D异构体)，这种情况下它被称为“外消旋的”或“外消旋体”，也可以含有不等量的R与S异构体(或L与D异构体)，这种情况下它被称为“旋光性的”或“非外消旋的”。

“拆分”意为外消旋混合物分离成各旋光性成分。

“对映体过量”或“ee”指两种对映体E1加E2的混合物中一种对映体E1过量的百分比，即

(+)指正对映体，(-)指负对映体。

符号指伸向纸平面外的键。

符号指伸向纸平面内的键。

“药学上可接受的盐”一词包括通过与酸反应生成的酸加成盐，酸例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸或磷酸，以及有机羧酸，如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、2-乙酰氧基苯甲酸，或有机磺酸，例如甲烷磺酸、4-甲苯磺酸及萘磺酸。当然也可使用其他药学领域所熟知的酸。

本文所用“氨基酸”一词含义包括天然来源的氨基酸，天然来源的氨基酸由遗传密码翻译而来，其中含有蛋白质的结构单元。氨基酸一词含义除非另有特别说明，也包括(L)-氨基酸、(D)-氨基酸、诸如氨基酸类似物的化学改性的氨基酸、通常不结合在蛋白质中的天然来源的氨基酸。包含在本说明书范围内的氨基酸的缩写、氨基酸类似物列在表1中。

表1氨基酸符号丙氨酸Ala苯丙氨酸Phe对氰基苯丙氨酸Phe(4-CN)对脒基苯丙氨酸pAphe环己基甘氨酸Chgβ-(3-吡啶基)-丙氨酸Palβ-(3-N-甲基吡啶鎓)-丙氨酸PalMe(3)流程1：N-乙酰基-(D，L)-4-氰基苯丙氨酸乙酯的拆分

乙基酯外消旋体(化合物(Ⅰ))被拆分为L立体异构体酸N-乙酰基-4-氰基苯丙氨酸(化合物(IA))，而其中的D立体异构体酯(化合物D-(Ⅰ))基本上不转化成酸的形式。这种从不需要的酯中分离所需的酸是可以实现的。如下文更为详细的描述，由该方法所得到的酸主要为L异构体，其ee值较高便说明了这一点。

按照本发明的方法，为形成反应介质所结合的足量的化合物(Ⅰ)至少两倍于所回收的L立体异构体的量。反应介质含有足量的乙腈和一种足量的含水溶液。按照本发明的方法，这种足量足以使这些添加剂发生相互作用。本文使用的“添加剂”含义为任何加入到反应介质中的成分。

乙腈的足量应是足以在反应介质中增溶基本量的化合物(Ⅰ)的量。优选地，化合物(Ⅰ)被增溶在乙腈中，并缓慢加入含水溶液，直到含水溶液刚刚变浑浊为止。溶液浑浊说明有部分化合物(Ⅰ)沉淀出来，因此需要额外加入乙腈溶解该沉淀。例如，足量的乙腈占反应介质体积的5至95％，更优选为50至60体积％。优选地，化合物(Ⅰ)的浓度为每升反应介质20g至140g，更优选为35g至65g每升。

含水溶液的足量应是足以在反应介质中增溶基本量的酶枯草溶菌素的量。本文使用的“含水溶液”是含有水的溶液，更优选为含有水及其他有助于提高产率或ee参数的添加剂。“溶液”一词含义不一定指任何加入到含水溶液中的添加剂都溶解了；它也可以指添加剂分散其中而形成的悬浊液。

例如，该含水溶液可进一步含有足量的无机盐作为添加剂成分，无机盐例如氯化钾、氯化钠、氯化锂等。优选的无机盐为氯化钾。据信无机盐能起到稳定枯草溶菌素的作用。足量的无机盐是足以稳定枯草溶菌素的量，约为每升含水溶液0．02mol至0．20mol，更优选为0．05至0．15mol每升。例如，所混合的1M氯化钾溶液占反应介质体积的百分之10至15。

与化合物(Ⅰ)、乙腈和含水溶液混合的是足量的枯草溶菌素。足量的枯草溶菌素是能与基本量的化合物(Ⅰ)(实际上可能的话是全部化合物(Ⅰ))反应的量，为0．5至10毫克当量，以化合物(Ⅰ)的重量计。

在加入酶时测量反应介质的pH，如果需要的话，调节pH至适宜的值。适宜的pH是使酶能够反应的pH。优选地，适宜的pH为5至9，更优选为6．5至7．5。在化合物(Ⅰ)与枯草溶菌素之间的反应过程中保持该适宜的pH。反应持续15分钟至4小时，优选通过搅拌或其他适当方法促进反应。可以使用任何适当的方法来保持该适宜的pH，例如加入一种足量的碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾，优选为它们的1M溶液，或加入缓冲溶液，如乙酸铵、碳酸氢铵、碳酸氢钠，或磷酸盐缓冲液，如磷酸氢铵、磷酸氢钠。可以使用pH计来监测反应介质的pH。

化合物(IA)的收集可采用本领域所熟知的方法，例如通过加入无机盐的碱性溶液、如碳酸氢钠，将溶液稀释。无机相用有机溶剂洗涤，有机溶剂例如醚类，氯代溶剂如二氯甲烷、氯仿，甲苯，庚烷或乙酸乙酯。含水溶液用一种浓酸、如盐酸酸化，至pH为1至3，再用有机溶剂萃取得到化合物(IA)。表2和表3

表2和表3比较了含水溶液与乙腈的反应(表2)，和含水溶液与代替了乙腈的二甲基亚砜的反应(表3)。

A栏给出了试验中所用的化合物(Ⅰ)的量，单位为克。

B栏给出了用于制备含水溶液的二甲基亚砜(DMSO)或乙腈(CH3CN)、水和1M氯化钾溶液的量，单位为毫升(mL)。

C栏给出了所用的枯草溶菌素的量，单位为毫克(mg)，及对应于化合物(Ⅰ)重量的毫克当量(meq)。

D栏给出了试验进行的时间。

E栏给出了所得化合物(IA)的对映体过量值。

F栏给出了所得化合物(IA)的产率。

注1：化合物(IA)中含有DMSO，非常难以除去。

2：在90℃／8托下蒸发除去DMSO，溶于乙酸乙酯，用水洗涤(3次)。

3：化合物(IA)易于分离为固体。表2

项目1中，反应在无机盐(氯化钾)的存在下进行。项目2中，反应在没有无机盐的存在下进行。

栏ABCDEF项目(I)(D：L；60：40)(g)CH₃CN／H₂O／1M>枯草溶菌素(mg)(meq)时间(min)(IA)％ee(IA)％产率1671000／600／214100(3．7)18099．488(固体)³2115／9．5／001．6(3．2)1209890(固体)³表3

使用二甲基亚砜，在不同的时间、枯草溶菌素比例、化合物(Ⅰ)量的条件下进行反应。

这些试验表明，使用乙腈可以进行有效、经济的拆分，而且化合物(IA)易于回收、产率高、对映体过量高。流程2

流程2是流程1的继续，给出了化合物Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂、即化合物(Ⅱ)的制备方法。

流程2步骤A中，化合物(3)与化合物(IA)化合得到化合物(4)。化合物(3)的化合可以使用叠氮化物法，例如在惰性气氛下、如氮，将化合物(IA)溶于一种适当的无水有机溶剂，如无水二甲基甲酰胺或无水二氯甲烷。向此溶液中加入二苯基磷酰叠氮化物、1至4当量的适当的碱、如二异丙基乙胺和至少一个当量的被保护的氨基酸、化合物(3)，化合物(3)是先溶解在适当的无水有机溶剂中的，例如无水二甲基甲酰胺或无水二氯甲烷。然后搅拌1至15小时进行反应。化合了的产物(4)的分离与精制采用本领域所熟知的工艺，如萃取、沉淀、结晶和闪式色谱法。例如，挥去溶剂，用乙醚沉淀化合产物(4)，洗涤、过滤收集。

流程2步骤B和D中，使化合物(4)的氰基转化为化合物(Ⅱ)的脒基。按照Wagner等于1982年21号公布、1988年11月9日再审查的155954号民主德国专利的方法，这种转化是通过对应的化合物(5)的甲基硫代亚胺酸盐(methylthioimidate)(由化合物(4)的氰基与硫化氢的反应所生成)的氨解来完成的，该专利结合在此作为参考。

例如在流程2步骤B中，将化合物(4)溶于有机溶剂中，如二甲基亚砜。加入有机碱，如吡啶、三乙胺、二并丙基乙胺、2，6-卢剔啶、可力丁。在室温下向溶液通以硫化氢气，直到化合物(4)被消耗掉。在室温下使反应再进行1至18小时。按照本领域所熟知的方法收集化合物(5)，例如沉淀和过滤。沉淀用有机溶剂、如二乙醚洗涤，真空干燥。流程2：Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂的合成流程2步骤C中，甲基化化合物(5)的吡啶基，得到化合物(6)。较为普遍的甲基化方法是使用甲基卤，如甲基碘、甲基溴或甲基氯。也可以使用氟代磺酸甲酯、硫酸二甲酯、对甲苯磺酸甲酯及其他甲基化试剂，例如公开在Zoltewicz和Deady、Adv．Heterocycl．Chem．22，71-121(1978)，和Duffin、Adv．Heterocycl．Chem．3，1-56(1964)中，结合在此作为参考。优选使用过量的甲基卤，更优选使用过量的甲基碘。反应是在溶剂中进行的，例如诸如甲醇和乙醇的醇、丙酮、氯仿、乙腈、硝基苯和二甲基甲酰胺。更优选地，反应是在丙酮与二甲基亚砜的混合物中完成的，并在室温下搅拌1至24小时。按照本领域所熟知的方法分离化合物(6)，例如蒸去过量的甲基碘，用乙醚沉淀化合物(6)，倾滗法收集，洗涤、干燥。

流程2步骤D中，使化合物(6)的甲基硫代亚氨酸盐进一步转化为对应的化合物(Ⅱ)的脒基。优选地，将化合物(6)溶于有机溶剂、如甲醇中，更优选为在乙酸的存在下进行溶解。向此溶液中加入乙酸铵。优选地，反应加热至40℃至65℃的温度范围，更优选为50℃至60℃，保持该温度2至3小时。按照本领域所熟知的方法分离化合物(Ⅱ)，而且可以分离为一种药学上可接受的盐。例如，挥去溶剂，将残余物溶于乙腈，加入三氟乙酸进行沉淀，过滤并真空干燥。

下列实施例代表了如流程1与流程2所述的典型合成法。这些实施例被认作起到说明性的作用，无论如何也不是对本发明范围的限制。

正如本领域技术人员所知，流程中各步骤进行的顺序是任意的。

原料是商业上可得到的，或按照本领域所熟知的方法是易于制备的。

下文所用下列术语的含义为：“g”指克；“mol”指摩尔；“mmol”指毫摩尔；“L”指升；“mL”指毫升；“μL”指微升；“mp”指熔点；“℃”指摄氏度；“TLC”指薄层色谱法；“M”指摩尔浓度；“Rf”指保留因子。实施例1(D，L)-N-乙酰基-4-氰基苯丙氨酸Ac-(D，L)-Phe(4-CN)-OH

步骤A：4-氰基苄基乙酰氨基丙二酸二乙酯

将乙酰氨基丙二酸二乙酯(44g，0．203mol)、α-溴-对甲苯基腈(40g，0．204mol)、碘化钾(10g)悬浮在二噁烷(400mL)中，再加入乙醇钠溶液(200mL无水乙醇中4．6g钠)。混合物回流加热3-4小时，放置过夜。将混合物倾倒在冰(2L)上，过滤沉淀，用水洗涤并用冷冻干燥器干燥。用甲醇重结晶，得到4-氰基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯，为白色结晶(61g，91％)。

步骤B：N-(D，L)-乙酰基-4-氰基苯丙氨酸乙酯，Ac-(D，L)-Phe(4-CN)-OEt

将4-氰基苄基乙酰氨基丙二酸二乙酯(41．97g，0．126mol)悬浮在乙醇中(0．6L)。在下列时间间隔加入氢氧化钠(6M)：在0分钟加入10ml(60mmol)，30分钟后加入10 ml(60mmol)，3小时后加入5ml(30mmol)。边加入氢氧化钠(6M)边搅拌，直到原料消失(TLC，乙酸乙酯，Rf=0．63)。用水(100mL)稀释溶液，加入浓盐酸调节pH至3。挥去乙醇并用冷冻干燥器干燥半固体状产物过夜，得到N-乙酰基-4-氰基苄基乙酰氨基丙二酸单乙酯。

将所得到的N-乙酰基-4-氰基苄基乙酰氨基丙二酸单乙酯悬浮在无水二噁烷(0．5L)中，回流加热2．5-3小时。挥去二噁烷，将固体悬浮在乙酸乙酯(250mL)中，再用饱和碳酸氢钠的饱和水溶液(3次)、水、盐酸(0．5M)、和盐水萃取。用硫酸镁干燥乙酸乙酯溶液，过滤、蒸发。用乙酸乙酯／己烷重结晶，得到28．95(88％)N-(L，D)-乙酰基-4-氰基苯丙氨酸乙酯。实施例2Ac-(D，L)-Phe(4-CN)-OEt(6∶4；D∶L)的酶催化拆分和(L)-N-乙酰基-4-氰基苯丙氨酸Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH的制备

向Ac-(D，L)-Phe(4-CN)-OEt(6∶4；D∶L，67g)的乙腈(1L)溶液中加入氯化钾溶液(1M，241mL)和水(600mL)。调节溶液的pH为7．3至6．9，加入枯草溶菌素Carlsberg(50mg)的含水氯化钾(8mL，0．1M)溶液。用氢氧化钠(1M)滴定来保持溶液的pH。一小时后加入枯草溶菌素(50mg)的含水氯化钾(8mL，0．1M)溶液，用氢氧化钠(1M)滴定保持溶液的pH。2．5小时后加入碳酸氢钠溶液(800mL)，用乙酸乙酯萃取(4×800mL)。用硫酸镁干燥乙酸乙酯溶液，并将混合物过滤。滤液浓缩得到Ac-(D)-Phe(4-CN)-OEt，为固体(38g，95％，90％ee)。用浓盐酸(56mL)酸化含水层至pH1。用乙酸乙酯萃取含水层(4×800mL)。用硫酸镁干燥有机层，将混合物过滤。滤液浓缩得到Ac-(L)-Phe(4-CN)-OEt，为固体(21g，88％)。mp 124-126℃。99．4％ee实施例3N-乙酰基-(L)-对脒基苯丙氨酸，Ac-(L)-pAph-(L)-Chg-(L)-PalMe(3)-NH₂

步骤A：N-叔丁氧基羰基-(L)-β-(3-吡啶基)-丙氨酰胺，Boc-(L)-Pal-NH₂

将Boc-(L)-Pal-OH(1．34g，5mmol)悬浮在二氯甲烷(50mL)中，冷却至-15℃。加入二异丙基乙胺(963μL，5．5mmol)和氯代甲酸异丁酯(715μL，5．5mmol)。在-15℃下搅拌15分钟。向溶液剧烈地通以无水氨气(经固体氢氧化钠)约3分钟。混合物在-15℃下搅拌10分钟，再在室温下搅拌20分钟。挥去二氯甲烷，加入乙酸乙酯(70mL)，用碳酸氢钠的饱和水溶液洗涤。硫酸镁干燥，蒸发。用乙酸乙酯／己烷结晶得到Boc-(L)-Pal-NH₂(0．98g，75％)。

步骤B：(L)-β-(3-吡啶基)-丙氨酰胺的盐酸盐，H-(L)-Pal-NH₂·2HCl

在稍微加热的条件下，将Boc-(L)-Pal-NH₂(0．98g)悬浮在二氯甲烷(15mL)中，加入氢氯酸(4M，10mL)的二噁烷溶液。30分钟后挥去二氯甲烷和二噁烷。将固体溶于甲醇，加入乙醚进行沉淀，过滤得到H-(L)-Pal-NH₂·2HCl(0．86g，98％)。

步骤C：N-叔丁氧基羰基-(L)-环己基甘氨酸-(L)-β-(3-吡啶基)-丙氨酰胺Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂

将二甲基甲酰胺(15mL)中的H-(L)-Pal-NH₂·2Hcl(432mg，1．82mmol)、Boc-(L)-Chg-OH(609mg，2．37mmol，1．3当量)、二环己基碳二亚胺(494mg，2．4mmol)、羟基苯并三唑(324mg，2．4mmol)和二异丙基乙胺(4mmol)搅拌过夜。挥去二甲基甲酰胺，加入乙酸乙酯，将此混合物在室温下保持1小时。过滤除去所生成的二异丙基碳二亚胺环已基脲，溶液用碳酸氢钠的饱和溶液萃取(3次)，经硫酸镁干燥，蒸发。加入己烷进行结晶得到Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂(598mg，81％)。

步骤D：(L)-环己基甘氨酸-(L)-β-(3-吡啶基)-丙氨酰胺的盐酸盐H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂·2HCl

将Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂(1．27g，3．12mmol)悬浮在二氯甲烷(50mL)中，加入氢氯酸(10mL，4M二噁烷中)。30分钟后，挥去二噁烷和二氯甲烷，将固体溶于甲醇中，加入乙醚(200mL)使产物沉淀出来，过滤得到H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂·2HCl(1．12g，95％)。

步骤E：N-乙酰基-对氰基苯丙氨酸-(L)-环己基甘氨酸-(L)-β-(3-吡啶基)-丙氨酰胺Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂

将二甲基甲酰胺(30mL)中的H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂·2HCl(1．13g，3mmol)、Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH(0．84g，3．6mmol)、二异丙基乙胺(10mmol)和二苯基磷酰基叠氮化物(803μL，3．6mmol)搅拌过夜。挥去二甲基甲酰胺，用乙醚沉淀，过滤并用乙醚洗涤，得到Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂(1．282g，82％)。

步骤F：N-乙酰基-(L)-对硫代酰胺苯丙氨酸-(L)-环己基甘氨酸-(L)-β-(3-吡啶基)-丙氨酰胺Ac-(L)-Phe(4-硫代酰胺)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂

将Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂(1．18g，2．28mmol)溶于二甲基亚砜(20-40mL)中，加入吡啶(40mL)和三乙胺(14mL)。在室温下向此溶液中通以硫化氢30分钟。保持溶液在室温下过夜，蒸发至较小体积，用二乙醚使产物沉淀出来。在冰箱中放置数小时，过滤，用二乙醚洗涤并真空干燥，得到Ac-(L)-Phe(4-硫代酰胺)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂(1．26g)，为黄色固体。

步骤G：N-乙酰基-(L)-对甲基硫代酰胺苯丙氨酸-环己基甘氨酸-(L)-β-(3-甲基吡啶鎓)-丙氨酸的氢碘酸盐Ac-(L)-Phe(4-甲基硫代酰胺)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH₂·2HI

将Ac-(L)-Phe(4-硫代酰胺)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂(1．2g)悬浮在二甲基亚砜(10-20mL)和丙酮(80mL)中。加入甲基碘(14mL，50当量)。保持反应混合物在室温下过夜，挥去丙酮和过量的甲基碘。用二乙醚(0．5-1．1)进行沉淀。4℃下数小时后，倾滗或过滤二乙醚，用二乙醚和乙酸乙酯洗涤容器壁上的半固体状物。将产物进行真空干燥，得到Ac-(L)-Phe(4-甲基硫代酰胺)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH₂·2HI(1．31g)。

步骤H：N-乙酰基-(L)-对乙酰氨基苯丙氨酸-环己基甘氨酸-(L)-β-(3-N-甲基吡啶鎓)-丙氨酰胺的三氟乙酸盐Ac-(L)-pAphe-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH₂·TFA

将Ac-(L)-Phe(4-甲基硫代酰胺)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH₂·2HI(1．31g)溶于甲醇(50mL)和乙酸(0．5mL)中。加入乙酸铵(0．8g)。混合物加热至55℃达3小时，蒸发，溶于乙腈／水(0．1％三氟乙酸)(1∶1)，过滤并冷冻干燥，得到Ac-(L)-pAphe-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH₂·TFA(1．22g)。

本发明涉及中间体N-乙酰基-L-苯丙氨酸化合物(IA)的制备，该中间体化合物可用于Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂、即化合物(Ⅱ)的制备。后一种化合物可用于抑制血凝蛋白，更具体说，可用于抑制凝血酶因子“Xa”，这在1995年4月25日提交的美国专利申请08／428404中有更为详细的描述，结合在此作为参考。

本文所使用的术语“Xa因子活性”指的是Xa因子本身或在已知作为凝血酶原酶复合物的亚单元装配时的活性，该活性可催化凝血酶原转化为凝血酶。当用于表述有关Xa因子活性时，“抑制”一词包括了对Xa因子活性的直接和间接的抑制作用。对Xa因子活性的直接抑制作用例如可以通过使肽与Xa因子或凝血酶原酶结合来实现，这样就防止了凝血酶原与凝血酶原酶复合物活性部位的结合。

本文在用于表述有关Xa因子活性抑制作用时所使用的术语“特异性的”含义为，化合物在抑制Xa因子活性的同时基本上不抑制其它指定的蛋白酶的活性(采用相同抑制剂浓度)。其它指定的蛋白酶例如包括涉及凝血阶段的蛋白酶，如凝血酶、血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶。

尽管在某些疾病状态下，循环系统中形成的凝血块本身即为疾病的根源所在，完全抑制凝血系统也并非人们所需要的，因为这样会发生危及生命的出血。

凝血是一个复杂的过程，它牵涉到一系列渐进增强的酶活化反应，其中血浆酶原依次被有限的蛋白水解作用激活。从机理上来说，凝血阶段分为两种途径，即“内在途径”与“外在途径”。这两种途径汇合在X因子的活化上，其后按照单一的“常规途径”生成凝血酶。

已有证据表明，内在途径在维持纤维蛋白的形成和促进其生长上起到重要作用，而外在途径在凝血过程的最初阶段是关键。目前普遍接受的看法是，凝血是在组织因子／Ⅶa因子复合物的形成这一物理作用的基础上被引发的。该复合物一旦形成，通过激活IX因子和X因子，迅速引发凝血过程。后来生成的Xa因子再通过磷脂与因子及磷脂形成一对一的复合物。这种所谓的凝血酶原酶复合物能使可溶的纤维蛋白原转化为不溶的纤维蛋白。随时间的推移，Ⅶa因子／组织因子复合物(外在途径)的活性被Kunitz型蛋白酶抑制蛋白TFPI所抑制，TFPI在与Xa因子进行复合时，能直接抑制Ⅶa因子／组织因子的蛋白水解活性。为了在外在途径系统被抑制的情况下维持凝血过程的进行，又有Xa因子通过以凝血酶为媒介的内在途径活性产生。因此，凝血酶在其本身的产生过程和纤维蛋白原转化为纤维蛋白的过程之间扮演了双重“自动催化”的角色。

纤维蛋白生成的自动催化性是失控出血的重要保护手段。它确保了一旦有一个给定的凝血酶原酶阈值浓度，凝血将进行到底，例如可有效地终止出血。因此最需要研制的试剂是抑制了凝血而不直接抑制凝血酶。

按照本发明方法合成的化合物Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂是一种肽的类似物，可用作Xa因子活性的抑制剂，而且基本上不抑制其他涉及凝血过程的蛋白酶活性。