克服生物素同效维生素中DAPA氨基转移酶的瓶颈环节

摘要

本发明公开了使用产生利用赖氨酸之DAPA氨基转移酶的细菌增加生物素和生物素前体脱硫生物素生产的方法,所述方法包括使用或在赖氨酸存在时培养,或其赖氨酸生物合成去调控的细菌。

说明书

本发明一般地涉及生物素同效维生素的生物合成领域。

尽管阐明了生物素合成中的一些步骤和组分(Ohshiro等人，Biosci.Biotech.Biochem,58:1738-1741,1994；Ifuku等人，欧洲生物化学杂志，224:173-178,1994；Florentin等人，C.R.Acad.Sci，巴黎，317:485-488,1994；Birch等人，生物化学杂志，270:19158-19165,1995；Sanyal等人，生物化学，33:3625-3631,1995)，但已在生物化学和分子生物学水平上研究了大肠杆菌(E.Coli)和球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)的生物素生物合成(DeMoll,1996,F.C.Neidhardt等人(编辑)，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)：细胞和分子生物学，第2版，第1卷，pp.704-709,ASM出版社，华盛顿；Perkins等人，A.L.Sonenshein等人(编辑)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)和其它革兰氏阳性细菌：生物化学，生理学和分子遗传学，pp.319-334，美国微生物学学会，华盛顿；Eisenberg,1987,F.Neidhardt等人(编辑)，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，p544-550，美国微生物学学会，华盛顿；Cronan，细胞，58:427-429,1989,Izumi等人，农业生物化学，45:1983-1989,1981；Gloeckler等人，基因，87:63-70,1990)。已从上述两种细菌类型中分离和鉴定了涉及庚二酰-CoA转化为生物素的几种酶(Ploux等人，生物化学杂志，283:327-321,1992；Izumi等人，农业生物化学，45:1983-1989,1981；Eisenberg，文献同上，Huang等人，生物化学，34:10985-10995,1995)。KAPA合成酶是bioF的产物，该酶催化庚二酰-CoA和丙氨酸转化为8-氨基-7-酮壬酸(KAPA)。DAPA氨基转移酶是bioA的产物，该酶将供体的氨基转移给KAPA以产生7,8-二氨基壬酸(DAPA)。脱硫生物素合成酶(bioD)催化脲基环的闭合以产生脱硫生物素(DTB)，最终，bioB的产物生物素合成酶与大量其它成分一起作用使脱硫生物素转化为生物素，所述其它成分包括黄素氧还蛋白(Birch等人，文献同上；Ifuku等人，文献同上)，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(Florentin等人，C.R.Acad.Sci，巴黎，317:485-488,1994；Ohshiro等人，文献同上；Sanyal等人，文献同上；Birch等人，文献同上)，Ferrodoxin NADP+还原酶(Birch等人，文献同上；Sanyal等人，Arch.Biochem.Biophys,326:48-56,1996)，可能还包括半胱氨酸(Florentin等人，C.R.Acad.Sci，巴黎，317:485-488,1994；Birch等人，文献同上；Sanyal等人，文献同上)。化合物KAPA,DAPA,DTB和生物素统一地或单独地被称为同效维生素或生物素同效维生素。

在大肠杆菌中，编码这些酶的基因位于两个趋异转录的操纵子上，这两个操纵子由一个与BirA阻遏物相互作用的操纵基因控制(Cronan，细胞，58:427-429,1989)。在球形芽孢杆菌中，所述基因位于两个独立的操纵子上(Gloeckler等人，文献同上)。此途径中那些涉及庚二酰-CoA合成的较早的步骤未被很好地理解(Ifuku等人，欧洲生物化学杂志，224:173-178,1994；Sanyal等人，美国化学学会杂志，116:2637-2638,1994)。球形芽孢杆菌含有一种酶，即庚二酰-coA合成酶(bioW)，它可以将庚二酸转化为庚二酰-CoA(Gloeckler等人，基因，87:63-70,1990；Ploux等人，生物化学杂志，287:685-690,1992)。大肠杆菌缺乏这种酶，因此在生物素合成中不能将庚二酸用作中间体(Gloeckler等人，文献同上；Ifuku等人，欧洲生物化学杂志，224:173-178,1994；Sanyal等人，美国化学学会杂志，116:2637-2638,1994)。大肠杆菌含有两个基因，它们是位于bio操纵子上的bioC和与其它bio基因不相关的bioH，这两个基因似乎都涉及生物素的生物合成中一直导致庚二酰-CoA生成的较早的步骤，但它们确切的作用仍是未知的(Eisenberg，文献同上；Lemoine等人，分子微生物学，19:645-647,1996)。

枯草芽孢杆菌含有大肠杆菌和球形芽孢杆菌的bioA,bioB,bioD和bioF基因的同系物，这四个基因与球形芽孢杆菌的bioW基因的同系物一起以bioWAFDB的次序位于单个操纵子上，其后紧接着两个另外的基因，即bioI和orf2(Bower等人，细菌学杂志，178:4122-4130,1996)。一般情况下，bioI和orf2与其它已知的生物素生物合成基因不相似。bioI基因编码与细胞色素P450相类似的蛋白质，并能与大肠杆菌bioC或bioH中的突变互补(Bower等人，文献同上)。bioI中的突变导致枯草芽孢杆菌在缺乏生物素时生长较差，bioI突变体营养作用徐缓的表型可通过庚二酸来克服，这暗示着bioI的产物在庚二酸合成之前的步骤中起作用(Bower等人，文献同上)。

位于枯草芽孢杆菌bio操纵子之前的是推定的生长(vegetative)启动子序列，紧接该操纵子下游含有与球形芽孢杆菌bio调节区域同源之区域的二重对称区域(Bower等人，文献同上)。对bioW-lacZ翻译的融合蛋白的分析表明：生物素操纵子的表达由生物素和枯草芽孢杆菌的birA基因调控。通过用欧洲专利申请公开(EP)635572中所述的组成型启动子取代启动子和调节区域可以改造生物素合成去调控的菌株，通过整合和扩增枯草芽孢杆菌染色体中的去调控基因可进一步地改善生物素和生物素同效维生素的生产，EP635572中所述的BI282菌株是这种菌株的例子。

我们发现当使用经改造的细胞，在补加庚二酸的情况下生物合成生物素时，KAPA向DAPA的转化是重要的瓶颈环节。当除去对生物素生物合成的其它控制时，KAPA向DAPA的转化不能与KAPA的生产保持同步，从而使KAPA集结，却不能使终产物相伴地增加。已发现瓶颈环节的重要组分是KAPA向DAPA的转化中所用的氨基供体的有效性和一致性。一般情况下，提供足够量的氨基供体是克服瓶颈效应的重要策略。另外，能使用赖氨酸和相关化合物作为由KAPA生产DAPA的反应中被转移的氨基来源的DAPA氨基转移酶可显著改善下游生物素同效维生素，尤其是脱硫生物素(DTB)生物合成的产率。看上去提供较高水平的能被可利用的氨基转移酶使用的氨基供体即可基本上改善上述的瓶颈环节。例如，通过或者将赖氨酸包括在发酵培养基中，或者使赖氨酸生物合成途径去调控以制备足够量的可用的赖氨酸，可显著地改善生物素同效维生素的细菌生产，所述细菌的DAPA氨基转移酶使用赖氨酸作为氨基供体。使用枯草芽孢杆菌及其密切相关的菌株，包括以枯草芽孢杆菌为代表的芽孢杆菌种群中的成员的DAPA氨基转移酶时也可使用这种策略。所述种群包括例如枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌(B.pumilus)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，蜡状芽孢杆菌(B.cereus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。枯草芽孢杆菌群的成员在遗传和代谢上与更远相关的以球形芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)为代表的芽孢杆菌种群趋于不同(Priest，枯草芽孢杆菌和其它革兰氏细菌，文献同上，p3-16，引为本文作为参考；Stackbrant等人，微生物遗传学杂志，133:2523-2529,1987)。

因此，本发明的一个方面一般地涉及通过在加富赖氨酸，赖氨酸前体或类似物的环境中培养细菌以生物合成(如酶解或使用经改造的细胞发酵)生物素同效维生素的方法，所述细菌中含有利用赖氨酸的DAPA氨基转移酶，然后从环境中收获所需的生物素同效维生素。可以用任何适当的测定法评价指定的氨基转移酶所使用的氨基供体的能力，所述测定法包括但不限于基于Eisenberg和Stoner(1971，见下文)所述的生物测定法，其中使用大肠杆菌的DAPA敏感菌株测定DAPA氨基转移酶的活性。典型地，如EP635572中所述，有关一个或多个生物素合成途径步骤，细菌也可以去调控。通过细胞的野生型基因材料，通过被导入细胞的外源核酸，或者通过这两者的作用，可产生DAPA氨基转移酶。

本文所用的“利用赖氨酸的DAPA氨基转移酶”指的是利用赖氨酸或能转化成赖氨酸的化合物或能取代赖氨酸以作为氨基供体的化合物，能将8-氨基-7-酮壬酸(KAPA)转化为二氨基壬酸(DAPA)的DAPA氨基转移酶。

本文所用的“富含某物质的环境”指的是细菌培养，其中指定分子的浓度大于标准培养条件下的相应浓度，较高的浓度是生物素同效维生素不能超量产生时为避免细胞生长受限所必需的。

被回收和纯化的生物素同效维生素产物可以是生物素，脱硫生物素，或二氨基壬酸(DAPA)。当回收脱硫生物素或DAPA时，此方法可进一步地包括将回收的脱硫生物素或DAPA转化为生物素的步骤。

在本发明的另一方面，通过超量产生能将氨基供体的氨基转移给8-氨基-7-酮壬酸(KAPA)的DAPA氨基转移酶，也可改造菌株以克服KAPA至DAPA的瓶颈环节。在本发明此方面的优选的实施方案中，通过去调控生物素生物合成步骤而不是KAPA-DAPA步骤，可进一步地改造菌株以超量产生生物素同效维生素。

为了进一步地防止KAPA至DAPA瓶颈环节的发生，可依据不同的氨基供体(如赖氨酸和SAM)，进一步地改造菌株以产生多样的DAPA-氨基转移酶。可按下文详述的方法测定并区分这些活性，简单地说，可通过在赖氨酸，甲硫氨酸，或赖氨酸和甲硫氨酸存在的条件下所培养细菌之产物的同效维生素生物测定和生物自显影来测定KAPA至DAPA转化的水平。

本文所用的“利用SAM的DAPA氨基转移酶”指的是利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)或能转化成SAM的化合物或能取代SAM作为氨基供体的化合物，能将8-氨基-7-酮壬酸(KAPA)转化为二氨基壬酸(DAPA)的DAPA氨基转移酶。

在其它的实施方案中，在培养基中加入甲硫氨酸和赖氨酸，或它们的类似物。

提供富含赖氨酸之环境的一种方法是在培养基中加富能在DAPA氨基转移酶反应中为KAPA提供氨基的赖氨酸或赖氨酸同系物。赖氨酸同系物包括赖氨酸，(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)和能用作DAPA氨基转移酶的氨基供体的其它赖氨酸同系物。提供富含赖氨酸之环境的另一种方法是：通过突变或改造细菌以显著降低对赖氨酸生产的野生型控制，从而在赖氨酸生产方面使细菌去调控。例如，使赖氨酸合成步骤去调控包括降低或除去对赖氨酸合成酶转录或其它表达控制的调控，或者修饰赖氨酸合成酶以降低或除去对赖氨酸生物合成的控制。去调控也包括超量产生作为赖氨酸合成途径的起始物质的化合物，和抑制赖氨酸的生物降解(氨基酸：生物合成和基因调控，E.Hermann和R.Somerville(编辑)，Addison Wesley,Reading,MA 1983,pp147-172,213-244,417)。

生物素合成步骤的去调控包括降低或除去对生物素合成酶转录或其它表达控制的调控，或者修饰生物素合成酶以降低或除去对酶-催化的生物素合成反应的控制。去调控也包括超量产生作为生物素合成途径的起始物质的化合物，和抑制所需生物素同效维生素的生物降解。

通过有意地和特异性地改变野生型基因组来改造细菌可产生所需的生物合成表型，如比相应的野生型，即未经改造的生物体合成更多的赖氨酸，或除去生物素生物合成途径中的瓶颈环节。

可通过任何方法使DTB转化为生物素，所述方法包括但不限于DTB向生物素的生化转化，给经改造可将DTB生物转化为生物素的细菌补加DTB(Fujisawa等人，Biosci.Biotech.Biochem,57:740-744,1993)，由DTB体外合成生物素(Birch等人，生物化学杂志，270:19158-19165,1995；Fujisawa等人，FEMS Microbiology Letters,110:1-4,1993；Ifuku等人，Biosci.Biotech.Biochem,56:1780-1785,1992；Birch,WO 94/08023)或化学合成。

另外，本发明的目的是提供生产生物素同效维生素的方法，所述方法包括：

(a)培养含有利用赖氨酸之DAPA氨基转移酶的细菌，所述培养发生于富含赖氨酸，赖氨酸类似物，或赖氨酸前体的环境中；和

(b)回收所述的生物素同效维生素。

本发明的另一个目的是提供生产生物素同效维生素的方法，所述方法包括：

(a)培养含有利用赖氨酸之DAPA氨基转移酶的细菌，其中所述细菌在赖氨酸生产方面被去调控；和

(b)回收所述的生物素同效维生素。

另外，本发明的目的是提供上述的方法，其中细菌被改造以超量产生利用赖氨酸之DAPA氨基转移酶，更具体地，在这种方法中，在培养基中外源加入赖氨酸，赖氨酸类似物，或赖氨酸前体，所述方法中生物素同效维生素是生物素，二氨基庚二酸(DAPA)或脱硫生物素，回收脱硫生物素之后，此方法进一步地包括通过独立的发酵，生化反应或化学反应将回收的脱硫生物素转化为生物素，并回收生物素，所述方法中细菌对赖氨酸类似物，如(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性。

另外，本发明的目的是提供上述的方法，其中细菌在至少一个生物素合成途径步骤以及bioA表达方面被去调控，所述方法中所述细菌被进一步地改造以产生利用SAM的DAPA氨基转移酶，具体地说在培养基中加入甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，或SAM的类似物。

最后，本发明的另一目的是提供经改造可超量产生利用赖氨酸的DAPA氨基转移酶和利用SAM的DAPA氨基转移酶的细菌。具体地说，通过改造至少一个生物素合成步骤以及bioA表达的去调控，可进一步地改造这种细菌的菌株以超量产生生物素同效维生素，本发明还提供了经改造可超量产生利用赖氨酸的DAPA氨基转移酶的细菌，其中细菌被进一步地改造以超量产生赖氨酸。

可使用下列菌株实施本发明：BI90,BI96,BI603,BI641和BI642。根据布达佩斯条约的规定，于1997年7月11日将这些菌株保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，它们的保藏号分别为ATCC 55999,202000,202003,202002和202001。

以下是图和表的简述。

图1是显示KAPA浓度对枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶活性的影响的数据描述。

图2是在不同浓度的KAPA存在时，枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶初速度数据的倒数图。

图3是如表5所述的，具有赖氨酸和甲硫氨酸，或具有或不具有赖氨酸时，不同菌株发酵肉汤生物自显影结果的描述。

图4是枯草芽孢杆菌生物合成赖氨酸和相关化合物之途径的图解。

表1是通过在反应混合物中加入潜在的氨基供体，测出的BI611提取物的DAPA氨基转移酶数据的描述。

表2是在反应混合物中加入赖氨酸或赖氨酸相关化合物之后，BI611提取物的DAPA氨基转移酶测定结果的描述。

表3是在小试规模发酵罐中，6g赖氨酸/l存在下培养的BI282和BI603的生物素和同效维生素生产的描述。

表4是在小试规模发酵罐的分批补料培养中，3g甲硫氨酸/l存在下培养的BI282,BI96和BI90的生物素和同效维生素生产的描述。

表5A-5B是在小试规模发酵罐中，在6g赖氨酸/l和3g甲硫氨酸/1存在或缺乏的条件下培养的BI603和BI90的生物素和同效维生素生产的描述。

表6是使用不同的赖氨酸补料制度所生产的生物素和同效维生素测定结果的描述。

表7列出了已知的枯草芽孢杆菌赖氨酸-去调控的突变体。

表8是在存在庚二酸的条件下培养的对AEC有抗性的菌株所生产的生物素和同效维生素测定结果的描述。

表9描述了小试发酵罐中用于生产生物素和同效维生素的培养基的组成。

表10描述了生物素和DTB的亲和素-HABA置换试验。

以下简述了本发明优选的实施方案。

在枯草芽孢杆菌补料庚二酸的发酵过程中发生KAPA至DAPA转化的瓶颈环节。在下文描述的实验中，我们发现在枯草芽孢杆菌中，DAPA氨基转移酶使用赖氨酸作为氨基供体，与之形成对照的是在球形芽孢杆菌(Izumi等人，农业生物化学，45:1983-1989,1981)，谷氨酸棒杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)，鼠伤寒沙门氏菌，产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)，玫瑰色芽孢杆菌(Bacillus roseus)，玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)，和划界八叠球菌(Sarcina marginata)(Izumi等人，农业生物化学，39:175-181,1975)，大肠杆菌(Eisenberg等人，细菌学杂志，108:1135-1140,1971)，和S.marcescens中，DAPA氨基转移酶使用S-腺苷甲硫氨酸这种化合物作为氨基供体。

在大肠杆菌和球形芽孢杆菌中，KAPA至DAPA的转化由DAPA氨基转移酶催化，该酶是bioA基因的产物，它利用SAM和KAPA作为底物(Eisenberg等人，细菌学杂志，108:1135-1140,1971；Izumi等人，农业生物化学，45:1983-1989,1981；Stoner等人，生物化学杂志，250:4037-4043,1975；Stoner等人，生物化学杂志，250:4029-4036)。假定该反应与枯草芽孢杆菌中的类似，因为枯草芽孢杆菌氨基转移酶与大肠杆菌氨基转移酶33％同源，并可以与大肠杆菌的bioA突变体互补。然而，枯草芽孢杆菌酶的体外测定使我们惊奇地发现赖氨酸是枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶的氨基供体。另外，在枯草芽孢杆菌生物素生产菌株，如BI282的发酵培养基中加入赖氨酸(2-10g/l)可降低所产生的KAPA的量，并导致显著量的脱硫生物素(DTB)的积累。然后可使用多种发酵或化学方法将DTB转化为生物素。

SAM不是枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶有效的氨基供体，这一观察提供了克服上述瓶颈环节的线索。对真正的氨基供体进行研究，试验了26个不同的氨基酸和相关化合物之后，只发现赖氨酸可显著刺激枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶在体外将KAPA转化为DAPA。在随后的试验中，发现D-和L-赖氨酸，和赖氨酸类似物，(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)可被枯草芽孢杆菌的酶用作氨基供体。因此，这些化合物中的任何一个，或它们的任何组合都可用于本发明。尽管存在其它已知的利用赖氨酸为氨基供体的氨基转移酶(Tobin等人，1991，细菌学杂志，173:6223-6229；Coque等人，1991，细菌学杂志，173:6258-6264；Soda等人，1968，生物化学，7:4102-4109；Soda和Misono,1968，生物化学，7:4110-4119；Schmidt等人，1988,FEMSMicrobiol.Lett.,49:203；Lowe和Rowe,1986,Mol.Biochem.Parasitol,21:65)，但没有其它已知的DAPA氨基转移酶利用赖氨酸。大肠杆菌和球形芽孢杆菌的BioA酶都利用SAM(Eisenberg等人，细菌学杂志，108:1135-1140,1971；Izumi等人，农业生物化学，45:1983-1989,1981；Stoner等人，生物化学杂志，250:4037-4043,1975；Stoner等人，生物化学杂志，250:4029-4036)。

对枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶的鉴定表明赖氨酸的K_m高，该值受KAPA底物抑制。我们得出结论：KAPA至DAPA的瓶颈环节是由不充足的赖氨酸，或KAPA/赖氨酸的不适当的比率引起的，在发酵培养基中加入赖氨酸可克服这一瓶颈环节。

当添加了赖氨酸(6g/l)，以及庚二酸(1g/l)进行发酵时，经改造的枯草芽孢杆菌菌株BI282(bio∷[P₁₅bio]_7-8)的DTB生产显示出显著的增长(＞10倍)。在这些发酵条件下，BI282产生了约300-700mg/l的DTB。根据精确的发酵培养基和条件，几乎所有的KAPA都能被转化为DTB。另外，在6g/l赖氨酸，3g/l甲硫氨酸(因为大肠杆菌的DAPA氨基转移酶利用SAM，而甲硫氨酸是SAM的前体)，和1g/l庚二酸存在的条件下，发酵菌株BI90可导致KAPA至DTB＞90％的转化和高水平的DTB生产，600-900mg/l，菌株BI90是BI282的衍生物，它含有单拷贝的盒，其中的大肠杆菌bioA基因由枯草芽孢杆菌的veg启动子起始转录，并从合成的枯草芽孢杆菌核糖体结合位点处翻译(PvegbioAec盒)。使用生物自显影进一步地证实可测量的KAPA的缺乏。这些数据表明在添加庚二酸的发酵中，KAPA的积累至少部分地是由氨基供体的不充足的胞内水平所引起的。增加培养基中赖氨酸的浓度可克服KAPA至DAPA的瓶颈环节，并可导致DTB生产的显著改善。

可在BI282中引入使赖氨酸生物合成途径去调控的突变(见图4)。生物素生产菌株的两个赖氨酸类似物(AEC)抗性突变体的发酵实验表明在未添加赖氨酸的条件下，DTB的滴度有所改善。然而，在这些突变体菌株中，赖氨酸仍是限制的。如果希望消除赖氨酸补料，则需要引入另外的突变以进一步地使赖氨酸的生物合成去调控。这种突变包括那些导致1)天冬氨酸激酶Ⅰ,Ⅱ或Ⅲ中的任何一种或全部的去调控表达，2)对天冬氨酸激酶Ⅰ,Ⅱ或Ⅲ的反馈抗性，3)二氨基庚二酸脱羧酶的去调控表达，4)对二氨基庚二酸脱羧酶的反馈抗性，或5)上述的任何联合的突变(枯草杆菌和其它革兰氏阳性细菌(1993),A.Sowenstein J.Hoch,R.Losick(编辑)，pp.237-267，美国微生物学学会，华盛顿)。

实施例实施例1DAPA氨基转移酶的酶测定

DAPA氨基转移酶的测定如Eisenberg和Stoner在1971年的描述(细菌学杂志，108:1135-1140)。在此试验中，在辅因子吡哆醛5’-磷酸和细胞提取物的存在下，将底物KAPA与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)一起保温。测量利用大肠杆菌bioA菌株的平板生物试验中产生的DAPA的量。由于被检测的很多菌株的提取物中含有显著量的生物素和脱硫生物素可补料给生物测定中所用的大肠杆菌指示菌株，因此在试验混合物中加入链霉亲和素(8mg/ml)。通过将用作底物的KAPA制品穿过亲和素-琼脂糖柱，从中除去痕量生物素和脱硫生物素的污染。在生物测定中使用大肠杆菌bioA109菌株(MEC1)测量DAPA氨基转移酶的活性。相对任何其它的bioA突变体而言，由Eisenberg发展起来的用于此试验的大肠杆菌bioA菌株被多次报道对DAPA更敏感。Eisenberg的DAPA-敏感菌株得自耶鲁大学大肠杆菌基因库中心(Genetic Stock Center)。实施例2枯草芽孢杆菌的DAPA氨基转移酶不能利用SAM作为氨基供体

测定经改造可超量表达枯草芽孢杆菌BioA蛋白的枯草芽孢杆菌菌株BI282的DAPA氨基转移酶的活性：BI282含有如EP635572所述的在bio基因座处扩增的P15bio盒。缺失了bio操纵子的枯草芽孢杆菌菌株BI9(Dbio∷neo)被用作阴性对照。将已知浓度的DAPA溶液点在生物测定板上以使每次测定时产生的DAPA的量能被估计。在BI282提取物中发现了可测的DAPA氨基转移酶活性，但在BI9提取物中未发现上述活性。

在至少60分钟内，酶反应与时间大致呈线性关系。使用薄层层析显示出反应产物为DAPA。尽管在10％ DMSO存在下冷冻提取物似乎能使酶稳定化，但通过将提取物煮沸，或冷冻和解冻可破坏酶活性。活性取决于KAPA的存在，但令人惊奇的是活性不取决于SAM的存在。然而，从缺乏原有的bioA基因但含有得自大肠杆菌或S.marcescens之bioA基因的枯草芽孢杆菌菌株测定的提取物具有DAPA氨基转移酶活性，该活性取决于外源SAM的存在。我们得出结论：枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶利用的氨基供体与大肠杆菌或S.marcescens之酶所利用的有所不同。在所使用的试验条件下，发现枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶的比活比大肠杆菌或S.marcescens之酶的要低100倍。这种低比活可能是提取物中有限浓度的氨基供体引起的。实施例3鉴定作为枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶氨基供体的赖氨酸

为了测定通过在反应混合物中加入其它氨基供体是否能刺激枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶的活性，在体外筛选了多种氨基供体刺激酶活性的能力。透析由枯草芽孢杆菌菌株BI611(Dbio∷cat,bpr∷[P₂₆bioA]_4-6)制备的无细胞提取物以除去任何内源性水平的氨基供体，并在各种标准氨基酸和几种其它的胺化合物存在的条件下检测此提取物，菌株BI611缺失了bio操纵子，但含有多拷贝(4-6)的枯草芽孢杆菌bioA基因，该基因由噬菌体SP01-26启动子起始转录，盒整合于bpr基因座。在26个被检测的化合物中，只有L-赖氨酸盐酸盐(＞98％纯)能刺激DAPA氨基转移酶的活性(表1)。在随后的实验中，检测了多种赖氨酸衍生物和类似物的刺激活性(表2)。更纯的L-赖氨酸制品(＞99％纯)刺激活性的能力支持这样一个结论，即：L-赖氨酸是酶真正的氨基供体，而反对真正的氨基供赖氨酸制品中的污染物这一结论。L-赖氨酸的类似物，即(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)刺激活性的能力进一步地支持这样一个结论，即：L-赖氨酸是枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶真正的氨基供体。除了g碳已被硫原子取代外，(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸的结构与L-赖氨酸相同。

赖氨酸作为枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶氨基供体的用途区分了使用SAM作为氨基供体的其它细菌(大肠杆菌，S.marcescens和球形芽孢杆菌)的DAPA氨基转移酶。实施例4枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶的动力学研究

使用制备自BI611(Dbio∷cat,bpr∷[P₂₆bioA]_4-6)的无细胞的粗提取物研究枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶的动力学特性。由KAPA和赖氨酸生产DAPA显示出与时间大致呈线性。在20分钟内，约10-40％的底物转化为产物。在标准的20分钟反应过程中所产生的DAPA的总量显示出与反应混合物中所加入的蛋白质的量直接成比例。经测定，氨基交换反应最适的pH为8.6。当赖氨酸的浓度在饱和水平上(19mM)维持恒定时，KAPA浓度(＜20mM)和比活之间表现出线性关系(图1)。当KAPA浓度为20mM-80mM时，酶活性保持稳定，当KAPA浓度约为80mM时，观察到活性抑制。Eisenberg和Stoner也已阐明对大肠杆菌DAPA氨基转移酶的KAPA底物抑制(1971，细菌学杂志，108:1135-1140)。约20mM水平的KAPA会抑制大肠杆菌酶。当KAPA浓度保持恒定时，枯草芽孢杆菌bioA酶活性和赖氨酸浓度(0-20mM)之间呈现出大致的线性关系。对于浓度为20-40mM的赖氨酸而言，酶变得饱和。

KAPA对枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶的底物抑制提供了双置换或乒乓反应机制的证据，在大肠杆菌DAPA氨基转移酶中已阐明了该机制(Stoner等人，生物化学杂志，250:4037-4043,1975)。图2所示的实验提供了支持此结论的另外的证据。在4个不同的固定的赖氨酸浓度下，KAPA的浓度是不同的，收集初速度的数据，并以双倒数形式作图。在显示乒乓型反应机制的低KAPA浓度区域，线大致平行(Stoner等人，生物化学杂志，250:4037-4043)。

对于枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶的反应，测定出赖氨酸和KAPA的表观K_m值范围分别为2-25mM和1-5mM。以前，Eisenberg和Stoner估计对于大肠杆菌DAPA氨基转移酶而言，KAPA的K_m值为1.2mM(1975，生物化学杂志，250:4037-4043)。由于KAPA是底物抑制剂，在较低的赖氨酸浓度下，它可能与赖氨酸竞争同活性位点的结合，因此难以准确地测量赖氨酸的K_m值。然而，经Stoner和Eisenberg测定，对于枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶而言，赖氨酸的表观K_m值(2-25mM)比对于纯化的大肠杆菌酶而言的SAM的K_m值(0.2mM)显著较高(1975，生物化学杂志，250:4037-4043)。实施例5具有增强的枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，或S.marcescens的DAPA氨基转移酶活性的菌株的发酵

为了检测对于适当的氨基供体而言，经改造的生物素生产菌株的发酵是否受到限制，进行了一系列实验，其中在含有适当bioA盒之菌株的发酵过程中补加赖氨酸，甲硫氨酸(SAM的前体)或赖氨酸+甲硫氨酸，通过同效维生素生物测定法和生物自显影测量KAPA至DAPA的转化水平。

在计算机控制的14升Chemap发酵罐中进行所有的发酵，所述发酵使用溶解氧控制，限制葡萄糖的补料分批发酵策略。使用表9所示的培养基进行发酵，按指示在发酵罐中分批补加庚二酸，赖氨酸和甲硫氨酸。使用HABA-亲和素置换试验测定摇瓶和发酵样品中脱硫生物素和生物素的总量。将此化学测定法与测定生物素水平的生物测定法(如EP635572所述，和Tanaka等人，微生物学方法杂志，6:237-247,1987)联合以另外测定脱硫生物素的生产。

HABA-亲和素置换试验基于两个事实：1)相对HABA在溶液中游离时而言，HABA与亲和素结合时在500nm下有更强的吸收，和2)DTB或生物素会等量地将HABA从亲和素上置换下来。表10中给出了此试验的描述，在2-14mg/l脱硫生物素(DTB)的范围内，HABA试验是线性的。

总的同效维生素被测定为发酵样品中DTB等价物，所述样品在高压灭菌之前已被酸化以防止KAPA分解。按EP635572所述测定总的同效维生素。实施例6具有增强的枯草芽胞杆菌bioA活性之菌株的补加赖氨酸的发酵

通过使用超量表达枯草芽胞杆菌DAPA氨基转移酶的菌株BI282和BI603来研究补加赖氨酸对KAPA转化为DAPA的影响。BI282超量表达多拷贝盒(P₁₅bio)上的所有生物素生物合成基因，所述盒整合于bio基因座上。BI603是BI282的衍生物，它含有整合于bpr基因座上的多拷贝的额外的bioA盒(P₂₆bioA)，可进一步地增加DAPA氨基转移酶的水平。表3(上部)表示在分批和补料发酵中，添加了1g/l庚二酸和6g/l赖氨酸培养的BI603和BI282的光密度，生物素和同效维生素生产。在分批和补料发酵中，添加了赖氨酸培养的BI603和BI282所生产的总的同效维生素分别约为1300mg/l和1000mg/l。3组发酵的生物素生产水平差不多(20-22mg/l)。与以前不加赖氨酸的发酵相比，赖氨酸分批发酵中的HABA同效维生素(生物素+DTB)水平要高很多。典型地，BI282和BI603产生了20-40mg/l的HABA同效维生素。加入赖氨酸将BI603生产的HABA同效维生素增加到570mg/l，将BI282生产的HABA同效维生素增加到330mg/l。根据生物素的滴度，由补加赖氨酸生产的大多数HABA同效维生素似乎是脱硫生物素的形式。由于生物素由脱硫生物素形成，HABA滴度代表细胞中脱硫生物素的总生产水平(为了简单起见，从此脱硫生物素的生产和HABA同效维生素的滴度可互换使用)。BI603的30小时发酵样品的生物自显影证实了脱硫生物素的积累，并显示出DAPA没有大量地积累(大约10mg/l)。实施例7具有增强的大肠杆菌或S.marcescens的BioA活性之菌株的补加甲硫氨酸的发酵

通过发酵分别表达大肠杆菌或S.marcescens ATCC 31809 DAPA氨基转移酶的菌株BI90和BI96，研究补加甲硫氨酸(SAM的前体)对KAPA转化为DAPA的影响。BI90(bio∷[P₁₅bio]_7-8sacB∷[P_vegbioA_ec]₁)和BI96(bio∷[P₁₅bio]_7-8sacB∷[P_vegbioA_sm]₁)是BI282的衍生物，它们分别含有整合于sacB基因座的单拷贝的大肠杆菌P_vegbioA_ec或S.marcescens P_vegbioA_sm盒。在分批和补料发酵中，添加了1g/l庚二酸和3g/l甲硫氨酸；在这些发酵中不加入外源的赖氨酸以仅观察对革兰氏阴性细菌DAPA氨基转移酶将KAPA转化为DAPA的影响。BI282用作阴性对照，它不含经改造的革兰氏阴性细菌的bioA基因，在与上相同的条件下培养BI282。如表4所示，BI90,BI96和BI282总的同效维生素生产类似。生物素的生产比平常稍低(5-10mg/l)。与对照BI282的发酵相比，BI90和BI96补加甲硫氨酸的发酵中的HABA同效维生素(生物素+DTB)水平较高。表达S.marcescens ATCC 31809 P_vegbioA_sm盒的BI96比BI282多生产3-4倍的HABA同效维生素。表达大肠杆菌P_vegbioA_ec盒的BI90产生的HABA同效维生素水平高出5-6倍。与上述的表达经改造的枯草芽胞杆菌bioA基因之菌株的补加赖氨酸的发酵相同，大多数HABA同效维生素是脱硫生物素。在具有增强的大肠杆菌或S.marcescens DAPA氨基转移酶活性之菌株的发酵中补加甲硫氨酸，即可通过增加细胞中SAM的水平来减少KAPA至DAPA的障碍。另外，在这些菌株中，由经改造的P₁₅bio操纵子合成的枯草芽胞杆菌BioA酶在某种程度上受不充足的赖氨酸限制，当在BI90或BI96的发酵中补加赖氨酸+甲硫氨酸时，KAPA至DAPA的转化可以增加。实施例8具有增强的枯草芽胞杆菌和大肠杆菌BioA活性之菌株的补加赖氨酸和甲硫氨酸的发酵

通过在分批和补料发酵中，添加1g/l庚二酸，6g/l赖氨酸和3g/l甲硫氨酸，研究赖氨酸和甲硫氨酸(SAM的前体)的联合对表达大肠杆菌和枯草芽胞杆菌DAPA氨基转移酶的菌株BI90的发酵中KAPA转化为DAPA的影响。作为对照，在分批和补料发酵中加或不加6g/l赖氨酸培养BI603。如表5A所示，不加赖氨酸的BI603产生了很少的HABA同效维生素(30mg/l)，其中约10mg/l是脱硫生物素。然而，加入赖氨酸后BI603中产生的脱硫生物素增加了10倍以上(510mg/l)。另外，加入赖氨酸+甲硫氨酸的BI90发酵比仅加入赖氨酸的BI603发酵所产生的脱硫生物素几乎高2倍(930mg/l)。加入赖氨酸+甲硫氨酸+1g/l庚二酸的BI90发酵中产生的脱硫生物素范围约为600-900mg/l，但在所有的情况下，大多数的KAPA都转化为DTB。

通过使用E.coli_bioH作为指示菌的生物自显影分析30小时的发酵样品，证实了这些菌株中保留的KAPA水平(图3和表5B)。在使用E.coliMEC1指示菌的独立的生物自显影中，对于补加了赖氨酸和甲硫氨酸的BI90而言，DAPA未被大量地测出(15mg/l)，对于补加了赖氨酸的BI603而言，测出的DAPA为40mg/l(表6，底部)；这与上述的补加了赖氨酸的BI603发酵一致(表3，底部)。实施例9在Amberex基础培养基中培养的具有增强的枯草芽孢杆菌DAPA氨基转移酶活性之菌株的补加赖氨酸的发酵

我们检查了补加不同量的赖氨酸对BI282的生物素，DTB(HABA同效维生素)和同效维生素生产的影响，BI282在由Amberex代替VY的发酵培养基(表6)中培养。在这些发酵条件下，在分批和补料发酵中加入7.5g/l赖氨酸足以使KAPA约100％地转化为DTB。似乎并不需要在补料发酵中加入更高水平的赖氨酸(24.8g/l)。BI282添加了赖氨酸和庚二酸的发酵比不添加赖氨酸的发酵所产生的DTB约多10倍(660-780mg/l)。不添加赖氨酸的发酵比具有高10倍水平之DTB的发酵(4-5mg/l生物素)所产生的生物素多2-3倍(12mg/l)。实施例10超量产生赖氨酸的BI282衍生物的构建

我们也尝试通过另一种方法，即促进内部赖氨酸生物合成的能力来增加细胞的赖氨酸库存。已开发了短杆菌和棒状杆菌菌株以生产约80g/l的赖氨酸，因此应该可以改造枯草芽孢杆菌以超量产生赖氨酸至刺激DTB合成所必需的程度。可采用两个基本的方法，1)收集赖氨酸生物合成去调控的已知突变体，并将相关的突变转移至生物素生产菌株中，和2)通过在生物素生产菌株背景中直接选择赖氨酸类似物抗性菌株来分离赖氨酸生产去调控的突变体。实施例11枯草芽孢杆菌已知的赖氨酸去调控突变体

枯草芽孢杆菌从天冬氨酸至赖氨酸的生物合成途径列于图4。两个被调控的步骤是天冬氨酸激酶催化的第一个步骤，和由二氨基庚二酸(DAP)脱羧酶催化的最后一个步骤，此最后的步骤是单独指定用于赖氨酸的第一个步骤。这两个步骤在基因表达水平上受反馈抑制的调控。表7中给出了被调控的酶的概要。

导致赖氨酸合成去调控的4种类型的突变是已知的，1)DAP抗性的天冬氨酸激酶Ⅰ,2)组成型的天冬氨酸激酶Ⅱ,3)赖氨酸抗性的DAP脱羧酶，和4)与任何已知的赖氨酸基因无联系的不确定的S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)抗性突变。这些已知的突变概述于表7。最后的3个都具有AEC抗性表型，因此通过转导，转化，或中板集合可将这3种中的每种突变转移到生物素生产菌株中。实施例12在生物素生产菌株背景中直接分离超量产生赖氨酸的菌株

通过选择赖氨酸类似物抗性从4种典型的赖氨酸去调控突变体中分离出3种。在没有添加物，添加苏氨酸，或添加DAP+苏氨酸的极限培养基中检测枯草芽孢杆菌菌株PY79(Youngman等人，质粒，12:1-9,1984),BI282和BI603对4种赖氨酸类似物的敏感性。添加物的目的是集中选择lysC基因，该基因编码对赖氨酸敏感的天冬氨酸激酶Ⅱ。在任何条件下都抑制生长的唯一的类似物是AEC，所有3个菌株的行为类似；在所有3种培养基中都对AEC敏感。

从PY79,BI282和BI603中分离AEC抗性的自发突变体。这些菌株中的突变最可能是lysC组成型突变，因为根据文献记载，大多数AEC抗性突变体都是种类型。在极限培养基中检测得自每个母菌株的11个突变体的赖氨酸分泌情况。所用测定法是使用枯草芽孢杆菌lA615(trpC2 lys∷Tn917)作为指示菌株的生物测定法。经测定母菌株中没有一个分泌出可测浓度的赖氨酸(2mg/l)。然而，11个PY79突变体中有10个分泌出20-70mg/l的赖氨酸，1个BI282突变体分泌出30mg/l赖氨酸，1个BI603突变体分泌出26mg/l赖氨酸。然后在未补加赖氨酸的发酵罐中检测被称为BI641和BI642的BI282和BI603突变体的生物素生产情况，并与补加了赖氨酸的BI282的相应生产情况比较。如表5,6和8所示，在缺乏赖氨酸时，BI641和BI642与它们各自的母菌株相比，生产出较高水平的DTB，但不如补加了6g/l赖氨酸时生产的DTB多。通过导入如上所述的第二个赖氨酸去调控突变可进一步地使赖氨酸的生物合成去调控。表1

受试的氨基供体活性的刺激受试的氨基供体活性的刺激无      -L-谷氨酸      -L-甲硫氨酸      -L-赖氨酸      +L-天冬氨酸      -L-色氨酸      -L-天冬酰胺      -L-缬氨酸      -L-酪氨酸      -L-亮氨酸      -L-半胱氨酸      -L-丙氨酸      -L-脯氨酸      -L-异亮氨酸      -L-丝氨酸      -L-鸟氨酸      -L-甘氨酸      -L-高丝氨酸      -L-谷氨酰胺      -DL-高半胱氨酸      -L-苏氨酸      -精胺      -L-组氨酸      -S-腺苷-L-甲硫氨酸      -L-苯丙氨酸      -S-腺苷-L-高半胱氨酸      -L-精氨酸      -表2

提取物中加入的化合物DAPA氨基转移酶的比活(nmol/min/mg)无    0L-赖氨酸(＞98％)    0.76L-赖氨酸(＞99％)    0.56D-赖氨酸(＞98％)    0.19DL-赖氨酸(＞98％)    0.35Na-乙酰基-L-赖氨酸    0Nε-乙酰基-L-赖氨酸    0Nε-甲基-L-赖氨酸    0甘氨酸-赖氨酸    0赖氨酸-甘氨酸    0(s)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸    0.48二氨基庚二酸    0表3

        赖氨酸(6g/l)发酵#/     分批  补料 时间  OD₆₀₀总同效维生素 生物素  HABA  同效维生素经计算的DTB菌株                (小时)         (mg/l)     (mg/l) (mg/l)        (mg/l)BI60/BI603    +    -    24    150    740          16    330           314BI60/BI603    +    -    30    160    950          22    400           378BI61/BI603    +    +    24    140    1100         14    420           406BI61/BI603    +    +    30    160    1290         20    570           550BI62/BI282    +    +    24    132    1100         10    220           210BI62/BI282    +    +    30    140    1000         22    330           308同效维生素的降解

        赖氨酸(6g/l)发酵#/     分批 补料   时间  KAPA   DAPA*  DTB   生物素  总量菌株                  (小时)(mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l)BI61/BI603    +    +      30    710    10    550     20    1290^a由使用大肠杆菌MEC1指示菌的酸性高压灭菌样品的生物自显影估计出的值。表4发酵#/    时间  OD₆₀₀总同效维  生物素  HABA同效维生 经计算的DTB菌株     (小时)       生    素  (mg/l)  素(mg/l)      (mg/l)

                    (mg/l)BI63/BI90    24    150    760       8      126          118BI63/BI90    30    160    720       9      145          136BI64/BI96    24    170    830       9      84            75BI64/BI96    30    160    850       10     88            78BI65/BI282   24    140    610       5      17            12BI65/BI282   30    150    590       6      25            19表5A

          分批和补料发酵#/       Lys   Met  时间    OD₆₀₀    总同效维 生物素 HABA同效维  经计算的菌株       (6g/l)(3g/l)(小时)              生素   (mg/l) 生素(mg/l)  DTB(mg/l)

                                        (mg/l)BI66/BI603      -     -    24      150       800      20      30        10BI66/BI603      -     -    30      155       600      21      30        9BI67/BI603      +     -    24      143       800      6       460       454BI67/BI603      +     -    30      166       870      5       510       506BI68/BI90       +     +    24      128       800      5       890       885BI68/BI90       +     +    30      165       1000     5       930       925表5B同效维生素的降解

                  分批和补料   KAPA(mg/l)发酵#/菌株Lys(6g/l)Met(3g/l)时间(小时)  ^a   bDAPA^c(mg/l)DTB(mg/l)生物素(mg/l)总量(mg/l)BI66/BI603BI67/BI603BI68/BI90   -++    --+    303030 57032055  47025060    04015   9505925  2155 6008701000^a通过从总的同效维生素中减去DAPA,DTB和生物素滴度计算出的值。^b由使用大肠杆菌△bioH指示菌的酸性高压灭菌样品的生物自显影估计出的值。^c由使用大肠杆菌MEC1指示菌的酸性高压灭菌样品的生物自显影估计出的值。表6                 赖氨酸(g/l)Run/菌株(药物)   分批   补料  时间(小时) OD₆₀₀总同效维生素(mg/l)生物素(mg/l)HABA同效维生素(mg/l)KAPA至DTB转化百分比(mg/l)B235/B1282   7.5  24.8    24  107    590  4    600    100(CAM60)    30  122    830  4    660    89236/BI282   …   …    24  123    410  11    40    10(CAM60)    30  130    450  12    60    13B237/BI282   7.5   7.5    24  115    630  4    780    100(CAM60)    30  124    670  5    750    100*分批培养基(Amberex)和补料培养基都含有1g/l庚二酸和指定量的赖氨酸。表7

酶突变类型基因 图谱位置抑制剂协阻抑物稳定性的降低天冬氨酸激酶ⅠDAP^rdapG   149 DAP未知否天冬氨酸激酶Ⅱ组成型lrsC   252赖氨酸赖氨酸是天冬氨酸激酶Ⅲ……   …赖氨酸和苏氨酸苏氨酸是DAP脱羧酶lys^rlysA   210赖氨酸赖氨酸和？是……aecB   282………表8                赖氨酸(6g/l)发酵#/菌株分批补料时间(小时)OD₆₀₀总同效维生素(mg/l)生物素(mg/l)HABA同效维生素(mg/l)经计算的DTB(mg/l)BI90/BI282BI90/BI282  ++  ++  2430  84125    240390    67    270360  264353BI91/BI641(BI282aec7)  -  -  24  74    470    5    130  125BI91/BI641(BI282aec7)  -  -  30  129    500    6    144  138BI92/BI642(BI603aec11)  -  -  24  86    540    4    160  156BI92/BI642(BI603aec11)  -  -  30  120    560    5    110  105表9

                   浓度培养基成分      分批        补料葡萄糖          15.0g/l     750g/lVeal肉浸汁      25.0g/l酵母提取物      5.0g/l谷氨酸钠        5.0g/lKH₂PO₄       7.5g/l      13.7g/lMgCl₂.6H₂O    1.0g/l      1.5g/l(NH₄)₂SO₄   2.0g/lMAZU DF-37C     2.5g/lCaCl₂.2H₂O    1.0g/lCuSO₄.5H₂O    0.4g/l      4.0mg/lZnSO₄.7H₂O    0.5mg/l     5.0mg/lMnSO₄.H₂O    25.0mg/l    35.0mg/lCoCl₂.6H₂O    1.0mg/l     10.0mg/l钼酸钠.2H₂O    0.2mg/l     2.0mg/lFeSO₄.7H₂O    50.0mg/l    100.0mg/l柠檬酸钠.2H₂O  50.0mg/l    100.0mg/l表10试剂和溶液：

缓冲液：0.1M NaPO₄,pH7.0。

亲和素：得自Sigma(Cat#A-9275)，以5mg/ml溶于缓冲液中。

HABA：得自Aldrich(Cat#14,803-2)，以0.375M溶于水+1当

      量NaOH中。制备混合物：

    20份样品 50份样品亲和素    1ml     2.5mlHABA     0.08ml   0.2ml缓冲液   38.9ml  97.3ml试验：Zero分光光度计；

在一次性的5ml小池中加入2ml缓冲液；记录OD₅₀₀。为了读数样品：

将一次性的5ml小池置于分光光度计中。

加入2ml混合物；搅拌；记录OD₅₀₀。

加入0.1ml体积的样品；搅拌；记录OD₅₀₀。标准：

使用0.1ml 2mg/ml-14mg/ml的DTB作为样品。

使用0.1ml缓冲液作为“0”点。计算：

计算ΔOD₅₀₀减去ΔOD₅₀₀。

对标准作图并使用曲线测定样品中的HABA同效维生素。注意：1．有用的范围是2-14mg/l的生物素+脱硫生物素。

  2．在小池中加入混合物，读出OD₅₀₀，然后不必将小池从分

 光光度计中取出即加入样品和混合物。

  3．当使用体积恒定的一套样品和标准时可得到最佳结果，使用缓冲液将所有样品调节成相同体积。