在可食用生物中表达海洋鱼类的抗冻肽以及其在食品生产中的应用

摘要

将具有基本上相应于AFPⅢ型HPLC12之氨基酸序列的重组多肽或蛋白质作为产品添加剂用于所述产品的改进的用途,所述改进在于例如通过防止或抑制冷冻后产品中冰的再结晶,而改变特别是在再生长中,影响冰的大小和形状的冰晶生长过程,从而使可能的冷冻损伤达到最小,所述用途以对于抗冻肽本身已知的方式发生以得到比相同量美洲拟鲽AFP高的特异性的修饰活性,具体地说是抗冻活性。

说明书

1.前言

由于存在抗冻肽而使极地鱼类的血液不会冻结。根据其结构可以将这些抗冻肽分成4种类型(Davies and Hew，1990)。I型AFP含丰富的丙氨酸和有规则间隔的苏氨酸和天冬酰胺并具有α螺旋构型。II型AFP含有高含量的半胱氨酸(8％)。III型AFP是小(约64个氨基酸长)的球形肽。最后一种，抗冻糖蛋白含有与特定二糖相连的重复三肽基元。所有这些肽都有非依数性的冰点降低并抑制冰晶生长的特性。这些特征可在改变冷冻产品的冰晶状态方面有用。由于从鱼类血液中纯化这些肽没有经济上可行的方法，因此用现代生物技术寻找可大量生产AFP的方法。

早期在微生物中生产抗冻肽的工作集中于在酵母和大肠杆菌中表达I型AFP(Warren等，1993，McKown等，1991)。由于大肠杆菌能够生产毒素，因此通常认为这种细菌不安全(GRAS)，这就使将这种细菌用于生产AFP出现了问题，因为所生产的AFP将最终应用于食品工业。

已知象啤酒糖酵母这样的酵母菌株也是GRAS生物，但与大肠杆菌不同，它们能够将异源蛋白质分泌到培养基中，这样有利于产物的下游加工。因此酵母对于生产各种异源蛋白质来说是非常有吸引力的(Romanos等，1992)。

用酵母生产AFP的第一个报道涉及到合成的I型AFP与截短金黄色葡萄球菌蛋白质A之融合产物的细胞内积累(Warren等，1993)。认为这种肽可以保护酵母抵御冷冻的不利影响。未描述I型AFP的细胞外生产。也未提到其他类型的AFP。

在该实验室，已经构建了携带表达载体的酵母转化体，所述载体含有天然美洲拟鲽I型AFP的合成基因(HPLC)(Driedonks等，1995)，这些描述于申请人现在已放弃的PCT申请WO 94/03617中。未说明由这些酵母分泌活性单体AFP。得到明显的冰再结晶抑制活性的唯一方法是表达预期的I型AFP多聚体以便随后由内源酵母蛋白酶产生有活性的单体(Driedonks等，1995)。尽管最终目的是生产有活性的I型AFP，但这种方法会分泌出部分加工过的多聚体AFP的异源形式。认为随后为得到作为单体的活性肽的处理方法对于工业生产来说是不可接受的。除额外的努力和花费外，是否会获得许可应用于食品也是个问题。这首先是由于为得到活性单体而使用了化学物质，其次表达的不是天然序列。

因此似乎不可能用食用生物以一种简单而有效的方式来表达并分泌活性单体AFP，所述方式可提供可用于食品生产的工业化方法。

在努力克服在酵母中表达I型AFP所遇到的问题时，我们试图在酵母中表达来自美洲大绵鳚的III型AFP。III型AFP是小的球形蛋白质，由于这一原因，我们认为它们比α螺旋的I型AFP更适合在酵母中表达。

在极地鱼类如美洲大绵鳚(Maerozoarces americanus)和狼鱼的血液中发现了III型AFP(Davies and Hew，1990)。分离美洲大绵鳚的血液发现存在至少12种不同的III型AFP(图1，Hew等，1984，Davies andHew，1990)。这些肽是高度同源的，有至少60％的氨基酸一致性，而且体外诱变表明一种表面残基群为所有美洲大绵鳚AFP变体所共有，这对于与冰结合是必需的(Chao等，1994)。23位和36位带负电荷的谷氨酸(Glu)可能与热稳定性和热滞后活性有关(Li等，1991)。14位、的天冬酰胺(Asn)、18位的苏氨酸(Thr)和44位的谷氨酰胺(Gln)(另3个保守氨基酸)也可能是AFP-III之冰结合活性中的关键残基(Chao等，1994)。

我们努力在酵母中表达美洲大绵鳚III型AFP的HPLC-1变体，但无法分泌足够的III型AFP活性单体。这显然不能解决上述问题。

此外，我们发现当与从美洲大绵鳚血液中分离的AFP制品相比时，由酵母生产的III型AFP HPLC-1有意想不到的低比活性。这样的低活性可能是由于所述肽的不正确折叠或是由于HPLC-1变体本身就有较低的比活性。这当然没有希望继续这样的研究来生产比美洲拟鲽中的有更高活性的AFP。

我们还将来自美洲大绵鳚血液的AFP分离成不同的HPLC级分并分析其再结晶活性以便确定除HPLC-1外的哪个级分可用于我们所希望的应用。HPLC12似乎是12个AFP III型级分中，以所试验浓度在再结晶抑制中唯一有活性的级分。如果我们可设法克服其已出现在AFP I型和AFP III型之HPLC-1的重组生产中的问题，因此确定HPLC1-12是所需的。

在上述用I型AFP和III型AFP的试验中，非常意想不到的是，我们随后发现表达编码III型AFP氨基酸序列的核酸会得到一种产物，所述产物以单体的形式被表达和分泌，而且没有降低的活性。因此可以得到用重组DNA技术生产纯活性AFP的非常适宜的生产方法。

此外所发现的事实是由酵母作为单体分泌的重组HPLC-12具有从美洲大绵鳚血液分离的AFP混合物的高抗冻肽活性。这种抗冻肽活性几乎是美洲拟鲽I型AFP的两倍。此外，该产物在再结晶试验中更有活性，因此比其它AFP更适合于所需的应用。

已知各种天然III型AFP的氨基酸组成、序列和核酸序列。Davies和Hew(1990)给出了综述并提供了Li等从1985和Hew等从1988的文章，所述文章是关于以噬菌体中鱼基因组DNA的cDNA克隆为基础，确定美洲大绵鳚的HPLC-1，4，5-7，9，11和12的序列。在1994年的蛋白质科学杂志中，Chao等描述了如何在大肠杆菌中合成并表达III型AFPHPLC-12的同种型以进行二维NMR研究，从而有助于理解抗冻肽的结构/功能关系并确定冰结合所需的基元。随后突变核酸以产生突变III型AFP多肽，所述突变体是脯氨酸突变体。将未突变的重组HPLC-12的热滞后值与从美洲大绵鳚中分离的AFP，即III型AFP进行比较。在标准误差的范围内，活性图谱是不可区分的。没有提高与其它AFP类型进行了比较。没有给出不正常的高热滞后值，事实上未给出一个值。未提到对再结晶特性有任何影响。因此我们指出热滞后活性与再结晶特性无关。热滞后值是结合强度的指标，但未给出类似再结晶试验那样的有关抗冻肽活性的测量方法。实施例是已知蛋白质有高滞后值的实施例，但对再结晶没有影响，反过来说明没有关系。

就重组HPLC-1所得到的结果和已经公开的有关AFP的文献看，重组HPLC-12的高AFP活性是意想不到的。在Hew等(1984)文章的表1中给出了通过Sephadex柱分离得自美洲大绵鳚III型AFP而得到的III型AFP级分的热滞后值，以及小鲽AFP(＝I型)和美洲绒杜父鱼AFP(-II型)的值。这些值是从来自相关种的血液级分中得出的，而不是通过重组DNA技术。AFP的活性之间仅有细微的差别，而QAE-A的活性最高。QAE-A是可从QAE-Sephadex柱上分离的5种不同变体中的一种，并表明它来自HPLC-12。但是由于差异非常小，以致于落入因测量方法改变而引起的偏差内。在同一文章中，Hew等因不相关而忽略了这些热滞后值的差异。他们认为“大部分美洲大绵鳚AFP都有可与其它已知AFGP和AFP相似的热滞后值”。在后一篇文献中，未提到比较了各种类型的或I型和III型之间的热滞后值。就各种级分的再结晶影响而言，没有任何教导或说明。因此，不能预料到任何单种III型AFP对晶体生长的抑制的比活性高于美洲拟鲽AFP的比活性。也未公开或说明HPLC-12比I型AFP肽或其它III型AFP肽有更高的活性。

为了检测III型HPLC-12的AFP活性是否较高，我们用HPLC从血液中分级分离了美洲大绵鳚AFP制品。我们确定HPLC-12的比活性最高。其它组分在等于100mg鱼III型AFP/ml的浓度检测不到活性。

因此我们发现了制备纯食用多肽的方法，所述多肽的AFP活性比I型AFP的几乎高两倍。与I型AFP相反，由于它可作为单体被分泌出来，所以很适合进行大规模生产，与经重组技术生产的I型AFP相比，所需的下游加工更少。此外，作为单体表达，指可以生产出几乎等同于美洲大绵鳚血液中天然肽的产物。由于这种产物更接近于天然食用生物、美洲大绵鳚中的天然AFP，所以更容易获得批准用于食品。

现在本发明使我们第一次可以大规模低成本更容易地生产HPLC-12型的重组III型AFP，这种AFP本身比美洲拟鲽I型AFP有更高的比活性。本发明的III型抗冻肽由于其高特异性再结晶抑制活性而使其成为最有前途的候选者，用于最终将被冷冻的食品如冰淇淋和冻面以及其它冷冻面食。

另一优点是作为活性多肽，优选作为单体的表达产物的分泌可在食品生产过程中的原位进行，从而无需加入AFP。现在在发酵过程中可以用能够分泌实质上相应于III型AFP HPLC-12多肽的酵母生产发酵产品，由此可以在这些产品中生产实质上相应于III型AFP HPLC-12的多肽，而无需增加步骤如所述多肽的纯化以及随后再将其在食品生产过程中加入。现在可以开发具有良好抗冻特性的植物、水果或蔬菜和转基因动物或其部分，原因是在其中表达了实质上相应于III型AFPHPLC-12的多肽。2发明详述

本发明涉及用于制备改进的产品的方法，所述改进在于例如通过防止或抑制冷冻时产品中冰的再结晶，而改变特别是在再生长中，影响冰的大小和形状的冰晶生长过程，从而使可能的冷冻损伤达到最小，所述方法包括将多肽或蛋白质加到未改进的产品或制备未改进产品时常用的成分或混合物中，所述多肽或蛋白质具有基本上相应于AFP III型HPLC12的氨基酸序列，比来自美洲拟鲽AFP I型的AFP活性高，而且以足以影响冰晶生长的量加入重组多肽或蛋白质。所述产品可以是食品或生物材料。生物材料例如可以是动物器官或组织或植物材料。具体地说，可以加入重组多肽。优选的多肽是食用状态的，以便得到的最终产品也是可食用的。根据本发明的方法，其中所述产品优选是食品。适宜多肽的具体实施方案是实施例中所说明的酵母AFP。在生产有改进冷冻特性的改进产品中，所涉及的本发明的生产方法可包括加入在新多肽生产方法中所得到的AFP，所述的新多肽生产方法也在本发明范围内并在说明书的其他地方加以说明。

术语“具有基本上相应于AFP III型HPLC12的氨基酸序列的多肽或蛋白质”含有与分离自美洲大绵鳚的HPLC-12的氨基酸序列相同的氨基酸序列，而且还含有符合下列条件的氨基酸序列，所述氨基酸序列与已知氨基酸序列有一个或两个氨基酸差异，但仍编码与天然蛋白质有相同AFP活性的多肽。所述突变或差异不能是已知对于所述多肽的活性所必需的氨基酸。因此优选不能缺失或取代脯氨酸。优选氨基酸序列中的任何差异均是沉默突变，这样所述取代是不改变所述多肽亲水性图谱的保守取代，因此不会严重影响多肽的结构和活性，即具有疏水侧链的氨基酸优选只用另一具有疏水侧链的氨基酸取代，而具有亲水侧链的氨基酸优选只用另一具有亲水侧链的氨基酸取代。HPLC-12与HPLC-1之间的氨基酸同源性小于60％。预期有60％以上，优选70％以上，最佳80％以上的同源性的氨基酸序列是与HPLC-12有相似特性的代表性多肽，因此认为基本上相应于HPLC-12。此外，由氨基酸序列编码的多肽至少应具有美洲拟鲽之AFP I型的AFP活性，而且优选至少应具有天然HPLC-12的AFP活性。通过将系列稀释度的待测定多肽与从美洲大绵鳚血液的等量和等稀释度的AFP I型和/或天然HPLC-12通过再结晶试验进行比较来确定AFP活性。在实施例中说明了可被完成并评估的再结晶试验的方法。可以认为表现出上述任何或许多特征的多肽基本上相应于HPLC-12。

用于制备改进的产品的方法，所述改进在于例如通过防止或抑制冷冻时产品中冰的再结晶，而改变特别是在再生长中，影响冰的大小和形状的冰晶生长过程，从而使可能的冷冻损伤达到最小，所述方法包括将能够表达食用重组多肽或蛋白质的宿主生物加到未改进的产品或制备未改进产品中常用的成分或混合物中，所述多肽或蛋白质具有基本上相应于AFP III型HPLC12的氨基酸序列，随后，将所述宿主生物置于可使编码AFP III型HPLC12的核酸序列在产品或成分或混合物中表达的条件下，在通常用于制备未改进产品的步骤中加入说明书中所公开的本发明的多肽生产方法也在本发明的范围内。所述产品可以是食品或生物材料。生物材料例如可以是动物器官或组织或植物材料。具体地说，可以加入重组多肽。优选的多肽是食用状态的，以便得到的最终产品也是可食用的。根据本发明的方法，其中所述产品优选是食品。适宜多肽的具体实施方案是实施例中所说明的酵母AFP。可以在生产过程中或之后破坏掉所述宿主生物以便将AFP多肽释放到混合物或产品组分中或释放到产品本身中。可以用本领域专业人员熟知的许多方法进行所述破坏，但必须小心，使所述过程不经历过分剧烈的条件以防止丢失所述多肽或蛋白质的AFP活性。另外，在所述生产方法中，也可以使用能够将AFP多肽或蛋白质分泌到食品组分或混合物中的宿主生物。例如面包酵母可以是生产食品入焙烤食品的方法中的宿主生物。按照常规完成所述生产过程，唯一不同之处在于在焙烤之前或过程中，在生面团中加入了不同的酵母，即能够表达并分泌基本上相应于III型AFP HPLC-12之多肽或蛋白质的DNA构建体，由此可以生产具有改善的冷冻特性的面团或焙烤产品。其中使用细菌如乳酸菌的类似方法构成了本发明适宜的实施方案。制备奶酪和酸奶的方法或需要发酵的生产其他产品的方法也包括在本发明方法的范围内。

有利的是，在已经表达或分泌了具有基本上相应于AFP III型HPLC12之氨基酸序列的重组多肽或蛋白质，从而得到了作为单体产品的AFP多肽或蛋白质后，不需再加入蛋白酶或化学物质就可完成用于生产本发明改进产品的生产方法。

在上述公开的任何实施方案中，将具有基本上相应于AFP III型HPLC12之氨基酸序列的重组多肽或蛋白质作为产品添加剂用于所述产品的改进的用途，所述改进在于例如通过防止或抑制冷冻后产品中冰的再结晶，而改变特别是在再生长中，影响冰的大小和形状的冰晶生长过程，从而使可能的冷冻损伤达到最小，以就AFP本身已知的方式得到比美洲拟鲽AFP高的特异性抗冻活性的用途也在本发明范围内。优选所述产品是食品。所述产品适宜地是生物材料。所述蛋白质或多肽可以是重组蛋白质或多肽。

用于改进产品的方法或用途的优选实施方案是其中所述产品最终是冷冻产品的方法或用途。对于食品，冰激凌是适宜的实例。如上述说明的，面团或焙烤产品也是适宜的。

在上述公开的任何实施方案中，含有将具有基本上相应于AFP III型HPLC12之氨基酸序列的重组多肽或蛋白质作为产品添加剂用于所述产品的改进的食品，所述改进在于例如通过防止或抑制冷冻后产品中冰的再结晶，而改变特别是在再生长中，影响冰的大小和形状的冰晶生长过程，从而使可能的冷冻损伤达到最小，所述食品也在本发明范围内。所述食品不含有天然的可食用生物，如美洲大绵鳚，仅仅以其在美洲拟鲽中的天然形式和数量含有编码所述多肽或蛋白质的序列，所述多肽或蛋白质相应于美洲拟鲽HPLC-12之氨基酸序列。本发明的适宜产品种类不是动物产品。另一适宜的类是人造产品。植物产品也是本发明产品的适宜实例。本发明的食品可通过上述任何实施方案中的用于改进产品的方法或用途来得到。

具体地说，含有具有改进的冷冻耐受性之食用重组宿主生物的食品，所述改进在于例如通过防止或抑制冷冻后产品中冰的再结晶，而改变特别是在再生长中，影响冰的大小和形状的冰晶生长过程，从而使可能的冷冻损伤达到最小，还要求了所述食用宿主生物，所述宿主生物含有上述任何公开的实施方案中基本上相应于AFP III型HPLC12之氨基酸序列的重组多肽或蛋白质和/或被所述多肽或蛋白质所包围，和/或在冷冻前能够表达和/或分泌所述多肽或蛋白质。

此外，所述重组食用宿主生物也在本发明范围内。食用重组宿主生物能够至少表达编码AFP的核酸序列，所述核酸序列包含在DNA构建体中，所述DNA构建体是所述天然宿主生物中所不存在的，而且所述DNA构建体以下列顺序含有：

(a)在所述宿主生物中有活性的强的、任选的可诱导启动子，

(b)ATG起始密码子，可位于任选的DNA信号序列中，所述信号序列能够在表达下列(c)中编码AFP的核酸序列过程中，分泌由宿主生物生产的蛋白质，所述信号序列可以与AFP-编码核酸序列同源或异源并与ATG起始密码子一起在阅读框内，

(c)至少一种编码基本上相应于AFP III型蛋白质HPLC12之氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列与ATG起始密码子一起在阅读框内，以及可选的

(d)与AFP-编码核酸序列3’末端结合的终止密码子。

在下文有关多肽生产的方法中，描述了所述重组宿主生物的适宜实施方案并要求了这些生物。

本发明还涉及用于生产重组多肽或蛋白质的方法，所述重组多肽或蛋白质表现出改进的有关冰晶生长和形成的活性，所谓表现出比美洲拟鲽AFP的特异性抗冻活性高的重组抗冻肽(AFP)，通过

1)在一定的条件下培养食用宿主生物，由此表达或诱导至少一种AFP-编码核酸序列，所述核酸序列被包含在DNA构建体中，所述DNA构建体在天然宿主生物中不存在，并且所述DNA构建体以下列顺序含有：

(a)在所述宿主生物中有活性的强的、任选的可诱导启动子，

(b)ATG密码子，可位于可选DNA信号序列中，所述信号序列能够在表达下列(c)中编码AFP的核酸序列过程中，分泌由宿主生物生产的蛋白质，所述信号序列可以与AFP-编码核酸序列同源或异源并与ATG起始密码子一起在阅读框内，

(c)至少一种编码基本上相应于AFP III型蛋白质HPLC12之氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列与ATG起始密码子一起在阅读框内，以及任选的

(d)与AFP-编码核酸序列3’末端结合的终止密码子。

所述方法或者还可包含收集通过本身已知的方法进一步加工后得到的、从AFP-编码核酸序列表达的产物。为了使核酸序列(所述核酸序列编码基本上相应于AFP III型蛋白质HPLC12的氨基酸序列)的表达产物能够分泌出来，所述DNA构建体还可含有用于宿主生物的信号序列，所述信号序列使在宿主培养过程中能够进行分泌。宿主生物适宜的是微生物。适宜的食用微生物是真菌如酵母和细菌如乳酸菌。酵母细胞啤酒糖酵母、脆壁糖酵母、乳酸糖酵母是适宜酵母宿主细胞的实例。食品生产发酵领域的专业人员均已知酵母细胞是适宜的，而且转化和表达系统是可以得到的(Romanos等，Campbell and Duffus)。乳酸细菌乳酸杆菌、链球菌和双歧杆菌也是适宜的细菌宿主生物的实例，它们的许多菌株是已知的，其适宜的转化和表达系统是现有的，这对于与日常生产有关的从事细菌重组DNA研究的本领域专业人员来说是已知的(Gasson，1993)。FDA有一份食用生物的名单，公众可以得到该名单。本领域专业人员知道什么是食用GRAS(一般认为是安全的)状态的生物。具体地说，与食品发酵和日常生产有关的生物是适宜的。

短语“编码基本上相应于AFP III型蛋白质HPLC12之氨基酸序列的一种核酸序列”包含精确编码美洲大绵鳚天然HPLC-12的氨基酸序列的任何核酸。所述核酸序列由于遗传密码的简并性可能有所不同，简并性指不同的核酸密码子编码相同的氨基酸。此外，本发明范围内还包括编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与已知氨基酸序列有一个或两个氨基酸的不同，但仍编码与天然蛋白质有相同AFP活性的多肽。突变或差异不能存在于对于所述多肽活性所必需的氨基酸中。因此，优选不能缺失或取代脯氨酸残基。优选氨基酸序列中的任何差异均是沉默突变，这样所述取代是不改变所述多肽亲水性图谱的保守取代，因此不会严重影响多肽的结构和活性，即具有疏水侧链的氨基酸优选只用另一具有疏水侧链的氨基酸取代，而具有亲水侧链的氨基酸优选只用另一具有亲水侧链的氨基酸取代。HPLC-12与HPLC-1之间的氨基酸同源性小于60％。预期有60％以上，优选70％以上，最佳80％以上的同源性的氨基酸序列是与HPLC-12有相似特性的代表性多肽，因此认为基本上相应于HPLC-12。因此，词组“基本上相应于”包括编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与天然HPLC-12的氨基酸序列有60％以上的同源性。此外，由氨基酸序列编码的多肽应至少具有美洲拟鲽AFPI型的活性并优选至少具有天然HPLC-12的AFP活性。通过将系列稀释度的待定多肽与从美洲大绵鳚血液中得到的AFP I型和/或天然HPLC-12(两者与待定多肽的稀释度相同)用再结晶试验进行比较，即比较多肽或蛋白质的相同w/v来确定AFP活性。在实施例中说明了完成所述再结晶试验的方法并进行评估。可将表现出任何或多种上述特征的多肽认为基本上相应于HPLC-12。

在本发明优选的实施方案中，DNA构建体和宿主生物的培养条件要使所述宿主分泌出单体多肽，所述单体多肽应具有基本上相应于AFPIII型蛋白质HPLC12的氨基酸序列。因此DNA构建体优选不表达基本上相应于AFP III型蛋白质HPLC12之氨基酸序列的串联二聚体或多聚体。二聚体或多聚体的生产还需要其他的下游加工步骤，或抑制活性多肽的分泌。因此，优选DNA构建使含有单体形式的编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列基本上相应于AFP III型蛋白质HPLC12的氨基酸序列。当然，DNA构建体可以以单体形式，串联含有多拷贝的编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列基本上相应于AFP III型蛋白质HPLC12的氨基酸序列。

本发明其他优选的实施方案包含DNA构建体，其中编码基本上相应于AFP III型蛋白质HPLC12之氨基酸序列的核酸序列含有对于所述方法的宿主生物优选的密码子。从在特定的宿主生物中，避免特定的密码子，从而提高翻译效率的角度看，这样做是优选的。优选密码子的使用在原核、酵母和植物中与在美洲拟鲽中的有所不同。例如，GCA、GCG和GCT共占大肠杆菌、啤酒酵母和Z.mays已知基因丙氨酸密码子的65％以上，而它们只占鱼如美洲拟鲽丙氨酸密码子的25％以下。同样，这种情况也出现在苏氨酸密码子ACA、ACG和ACT上(PCT/US90/02626)。乳酸细菌和酵母优选的密码子使用可从这些微生物的具体文献中得到。用这些特定的表达生物完成重组DNA技术的本领域专业人员可以知道哪个密码子是优选的。

当宿主生物是酵母时，DNA构建体的优选实施方案将含有啤酒酵母的α交配因子的DNA前序列作为信号。在另一实施方案中，还在原序列和AFP-编码核酸序列之间含有α交配因子的DNA原序列，这样前序列、原序列和AFP-编码核酸序列在相同的阅读框中。另外，当宿主生物是酵母时，DNA构建体的优选实施方案在编码AFP的核酸序列前，含有啤酒酵母的转化酶信号序列。

当宿主生物是酵母时，DNA构建体的优选实施方案含有啤酒酵母的可诱导GAL7启动子或组成性GAPDH启动子。对于其他宿主生物，DNA构建体中所含的适宜启动子是熟知的。

引述下列参考文献，提供可能的转化系统或其元件：对于酵母Campbell和Duffus，对于植物PCT/US90/02626和van den Elzen等(1985)，对于动物Hannhan(1988)。

在本发明之前，尚未生产出基本上分离和纯化的、基本上等同于III型AFP HPLC-12的，表现出高AFP活性的食用重组多肽或蛋白质。这是第一次生产出基本上分离和纯化的、基本上等同于III型AFPHPLC-12的，表现出比美洲拟鲽的AFP活性高的食用重组多肽或蛋白质。本发明包括基本上纯的分离的重组食用多肽或蛋白质，所述多肽或蛋白质有改变冰晶生长过程的改善的特性，例如通过防止或抑制冷冻时产品中冰的再结晶，而改变特别是在再生长中，所述冰晶生长过程影响冰的大小和形状，从而使可能的冷冻损伤达到最小，所谓抗冻肽(AFP)比等量美洲拟鲽AFP I型的AFP活性高，所述多肽或蛋白质具有基本上相应于AFP III型蛋白质HPLC12的氨基酸序列。所述重组多肽，特别是具有上述改善活性如冰晶生长抑制活性的多肽或蛋白质，用本发明的任何前述实施方案的方法制备的所谓重组抗冻肽(AFP)也在本发明范围内，所述抗冻肽具有比美洲拟鲽AFP高的特异性抗冻活性。2.材料和方法2.1菌株和生长条件

将大肠杆菌菌株JM109(endA1、recA1，syrA96、thi、hsdR17、rk^-、mk⁺、relA1、supE44，Yanisch-Perron等，1985)用于质粒扩增。将啤酒酵母菌株SU50(MATa、cir°、leu2、his4、can1；Verbakel，1991)用于多拷贝整合质粒的转化。在含100μg氨苄青霉素/ml(Sambrook等，1989)的Luria琼脂平板上筛选大肠杆菌转化体。将酵母菌株保持在用必需氨基酸(组氨酸20μg/ml，尿嘧啶20μg/ml)补充的选择性YNB平板(0.67％不含氨基酸的Difo酵母氮基，2％葡萄糖，2％琼脂)上。将相同的液体培养基用于预培养，30℃生长48小时，用含5％用于诱导GAL7启动子的半乳糖的YP培养基(1％Difco酵母提取物，2％Difco胨)以1∶10稀释。质粒

在表1中给出了含AFP-III质粒的详细描述。转化

按照Chung等(1989)所述转化JM109。主要根据Becker等(1991)所述，通过电穿孔转化酵母菌株。在选择性YNB平板上回收转化体。本领域专业人员可以知道各种转化方法均是可行的。可以根据待转化的生物加以改变，而且在各种手册如Sambrook等(1989)和Campbell andDuffus(1988)中有描述。分子生物学方法

按照供应商的说使用限制酶和DNA修饰酶。

在Applied Biosystems 380A DNA合成仪上合成寡核苷酸并用标准方法纯化。纯化AFP-III

从在纽芬兰沿岸水域捕捞的鱼血液中纯化来自美洲大绵鳚，Macrozoarces americanus的AFP III。按Hew等(1984)所述，通过离心凝结的鱼血清来制备AFP III样品。阳离子交换色谱

在SMART系统(Pharmacia Biotech)的Mono S柱(HR5/5，Pharmacia Biotech)上进行阳离子交换色谱。样品缓冲液是10 mM磷酸氢二钠/磷酸二氢钠(Merck)pH 6.0，用0-0.5M NaCl(Merck)线性梯度进行洗脱，流速为100μl/分。用μ峰监测仪(Pharmacia Biotech)在214和280nm检测肽。监测在214nm的信号，用集成SMART系统收集器收集级分，系统温度为15℃。反相高效液相色谱

在SMART系统(Pharmacia Biotech)的μRPC C4/C18 SC2.1/10柱(Pharmacia Biotech)上完成反相高效液相色谱。用在Milli Q水中的0.6％三氟乙酸(溶剂A)(TFA，Merck)将样品上到柱上，用80％乙腈(Merck)、在MilliQ水中的0.54％TFA(溶剂B)洗脱。所用的标准梯度程序如下：0分钟，100％溶剂A；5分钟，100％溶剂A；10分钟，65％溶剂A；50分钟，40％溶剂A；55分钟，0％溶剂A；57.5分钟，0％溶剂A，58分钟，100％溶剂A，流速为100μl/分钟。用μPeak Monitor(Pharmacia Biotech)在214、256和280nm检测肽。监测在214nm的信号，用集成SMART系统收集器收集级分，系统温度为20℃。

通过下列修改的梯度分离AFP-III同种型1，2和3：0分钟100％溶剂A；10分钟，60％溶剂A；35分钟，55％溶剂A；36分钟，45％溶剂A；45分钟，45％溶剂A；46分钟，0％溶剂A；50分钟，0％溶剂A；50.1分钟，100％溶剂A和60分钟100％溶剂A。缓冲液和所有关SMART系统的详细描述均与标准梯度的相同。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

按照供应商的方法，在Xcell电泳槽(Novex)上跑16％的聚丙烯酰胺Tricine凝胶(Novex)。样品缓冲液来自Novex，由3.0ml TRIS-HCl 3.0M，2.4ml甘油，0.8g SDS，1.5ml 0.1％考马斯兰G，0.5ml 0.1％酚红和5％-β巯基乙醇组成，用蒸馏水将终体积调到10ml(pH8.45)。展开缓冲液也来自Novex，并在总体积为1升的蒸馏水中含有12.1gTRIS，17.9g Tricine和1g SDS，pH约8.3。用溶解在40％乙醇(Merek)、10％乙酸(Merck)和50％蒸馏水溶液中的10％考马斯兰R250(Bio-Rad)染色，将该溶液在微波炉中加热45秒，然后，将凝胶在旋转振荡器上染色15分钟。用10％乙醇(Merck)、7.5％乙酸(Merck)和82.5％蒸馏水溶液将凝胶脱色。在确定分子量的情况下，用MARK 12预染的标记(Novex)。Western印迹

按照供应商的方法，用转印迹转移介质(Bio-Rad)，将Novex Tricine凝胶印迹到Western转移印迹模具(Novex)中。印迹后，用在150mMNaCl，50mM Tris/HCl pH7.4中的5％脱脂奶粉封闭膜，此后保温于150mM NaCl，50mM Tris/HCl、吐温20pH7.4中的1％脱脂奶和抗美洲大绵鳚抗冻肽的单克隆抗血清中。得到两种不同的抗体(M.M.Gani，Unilever Research，Colworth House Laboratory的礼物)，一种用于确定S组，另一种用于确定Q组。在温和的搅拌下，室温保温过夜。通过用保温缓冲液洗涤(3×5分钟)来除去未吸附的抗体。在室温将膜与二级抗体(山羊抗小鼠IgG(H+L)，碱性磷酸酶结合物；BioRad，Richmond)保温2小时。用BCIP/NBT(BioRad)将酶显色。胰蛋白酶消化

为了进行胰蛋白酶消化，将样品溶解在0.1M NH₄HCO₃缓冲液pH8.3中。以酶∶底物1∶100的比率加入胰蛋白酶(TPCK处理的，Worthington，Millipore Corporation)。30分钟后，检测pH，再次加入相同量的胰蛋白酶。37℃保温过夜。通过加入TFA使pH值达到2，从而停止消化。在SMART系统(Pharmacia)的RP-HPLC上分离肽。N末端氨基酸序列分析

按照供应商的方法在LF 3000蛋白质测序仪(Beckman)上完成N末端氨基酸序列分析。在自动RP-HPLC系统、Gold系统(Beckman)上分析氨基酸的PTH衍生物。通过氨基酸分析确定蛋白质

在真空110℃，在含1％酚的6M HCl中将AFP-III样品水解24小时然后干燥。用供应商的方法，在α+系列2氨基酸分析仪(PharmaciaBiotech)上进行分析。再结晶试验

将待测AFP-III活性的样品与蔗糖粉末混合得到30％(体积)的蔗糖溶液。将该溶液的一部分放在显微镜载玻片上，用盖玻片覆盖以防止蒸发，然后放在Linkam THMS冷载物台上，用Linkam CS 196冷却系统连接，并用Linkam TMS 91控制仪控制。将该溶液骤冷到-40℃(δ99℃/分)，随后加热到-6℃。在于-6℃培养的30分钟过程中，显微镜检查冰晶生长。

为了检测HPLC纯化的肽，将来自RP-HPLC柱的含纯化AFP-III同种型的样品在用Milli Q水进行了一次再水合步骤后，用Speed VacConcentrator(Savant)干燥两次。第二个干燥步骤后，将样品溶解在100μl Milli Q水中，然后检测pH，以确保除去来自RP-HPLC缓冲液的所有TFA。将样品稀释到在λ＝214nm的吸收值为0.700，这相当于约0.1μg/ml的鱼AFP-III溶液。为了确保样品含等量的AFP-III，用氨基酸分析对其进行检测。若使用纯化的样品AFP-III同种型时，用N末端氨基酸序列分析检测其纯度。补料分批发酵

接种方法：将适宜转化体的培养物生长在25ml基本培养基中，在30℃和300rpm过夜培养。随后将培养物转移到含500mlYP(含2％葡萄糖)的1000ml振荡烧瓶中，然后在30℃和300rpm过夜培养。用该培养物作为补料分批试验的接种物。

使用下列分批培养基：110g葡萄糖.1H₂O，用去矿物质水制成500g。25g Trusoy，50g酵母提取物(Ohly)，10.5g磷酸氢二钾，5ml1000XEgli维生素溶液，50ml 100XEgli痕量金属(Egli，1980)，0.25g L-组氨酸.HCl(Sigma)，3g硫酸镁，2g消泡剂，用去矿物质水制成4500g。将葡萄糖溶液加热灭菌，再将维生素溶液分别过滤灭菌。在发酵罐中，将所有其他组分均加热灭菌。将温度调到30℃，pH调到5.0。接种发酵罐，以2 l/分的空气流速，600rpm的搅拌速度培养细胞。18小时后，开始补料期。

使用下列补料培养基：1100g葡萄糖.1H₂O，用去矿物质水制成1750g。62.5g酵母提取物(Ohly)，30g磷酸氢二钾，5ml 1000XEgli维生素溶液，50ml 100XEgli痕量金属(Egli，1980)，6.25g L-组氨酸.HCl(Sigma)，6.25g7水硫酸镁，2g消泡剂，用去矿物质水制成850g。

以Keulers(1993)描述的软件工具为基础，将补料泵调到1.05的恒定RQ值(生产的二氧化碳摩尔数和消耗的氧气摩尔数之比)。37小时后收集培养物。实施例1  构建编码III型AFP的合成基因

按如下构建编码HPLC I抗冻肽的核苷酸序列，该序列对于在啤酒酵母中表达是最佳的：合成一组12个寡核苷酸(invafp1、invafp2、invafp3、invafp4、invafp5、invafp6、invafp7、invafp8、invafp9、invafp10、invafp11和invafp12)，主要含有成熟AFP的DNA序列，该序列优先使用啤酒酵母密码子。设计合成的基因，以使其含有与产生粘性末端的PstI和HindIII相容的5’单链区(图2)。

为了组装合成的AFP基因，将各50pmol的寡核苷酸溶解在12μl水中，95℃保温2分钟，然后直接放在冰上。该变性步骤后，37℃，在含2.5mM ATP，5mM DTT和约10U多核苷酸激酶的20μl终体积中将所述寡核苷酸磷酸化40分钟，然后在95℃变性2分钟，接着置于冰上。将各10μl的磷酸化寡核苷酸与其大部分互补的DNA寡核苷酸混合以形成双螺旋。95℃保温2分钟变性后，将各双螺旋缓慢冷却到30℃。再合并所有6个10μl的双螺旋混合物，然后20℃在含50mMTris/HCl，pH7.5，8mM MgCl₂，8mM DTT和40μg/ml明胶和10UDNA连接酶的100μl终体积中保温2小时。然后沉淀连接混合物，并再溶解在30μl的TE缓冲液中。将15μl混合物放在2％琼脂糖凝胶上，从凝胶上切下预期大小(约224个碱基对)的DNA带，最后按照供应商的说明，用Gene Clean II方法纯化。

然后将得到的DNA片段连接到PstI/HindIII线性化载体pTZ19R(Pharmacia)中，然后用标准方法转化到大肠杆菌JM109中。用稍加改进的碱溶解小量制备方法来分离数个转化体的质粒DNA，然后用数种酶进行限制分析。用双链质粒的Sanger双脱氧测序法(Sanger等，1977)确定了在一种所述质粒中所含的插入序列。将含有合成AFP-III盒编码区的该中间构建体命名为pUR7700(图3)。实施例2构建含编码AFP-III HPLC-1合成基因的酵母表达载体

由pUR7700携带的合成AFP-III基因不含有在酵母中表达该肽所需的信息。为了进行该基因的表达和分泌，必需构建含AFP-III基因与适宜分泌信号序列的翻译融合序列的构建体，并将这些融合序列置于酵母基因启动子的控制下。

适宜的分泌信号序列可选自编码酵母可有效分泌的蛋白质的基因，如有SUC2或α交配因子、MFα1和MFα2编码的转化酶。为了得到含有转化酶信号序列的适宜融合序列，产生含有转化酶信号序列、GAL7启动子和适宜限制酶位点的PCR片段，以确保带有合成AFP-III基因的转化酶信号序列的融合序列在框中。

为了得到该片段，用下列序列设计PCR引物invafp14：

                                NheI   BamHI

3′CCA AAA CGT CGG TTT TAT AGA CGATCG CCTAGGGC 5′invafp14

    G   F   A   A   K   I   S   A

将该引物在PCR反应中作为3’引物，5’引物为与GAL7启动子中的序列杂交的PG705 AF(Verbakel，1991)。用pUR2778质粒DNA作为模板(图4，van gorcom等，1991)，反应产生一约243bp的片段。从琼脂糖凝胶上洗脱该片段，然后按照制造商的说明，用Gene Clean方法纯化。随后用SacI和BamHI消化纯化的片段，将所得约88bp片段连接到质粒pTZ19R中的适宜位点。通过转化将连接混合物导入大肠杆菌JM109中，从转化体中分离质粒DNA，并进行测序以确定克隆插入片段的一致性。将该质粒命名为pUR7701(图5)。

为了得到转化酶信号序列与合成AFP-III基因的框架融合序列，用NheI和HindIII消化pUR7700，分离约196bp的片段，并与通过用NheI和HindIII消化pUR7701而形成的约2911bp片段相连。将所得质粒命名为pUR7702(图6)。用相似的方法，用引物MFαAFPIII作为3’引物，产生含α交配因子前原信号序列的PCR片段：

                           NheI

3′CTA TTT TCT CTC CGA CTT CGATCGCC 5′    MFαAFPIII

    D   K   R   E   A   E   A

用MFαAFPIII和PG 05 AF为引物，从pUR2660(WO 94/03617)产生含部分GAL7启动子和全部前原α交配因子编码序列的PCR片段。pUR2660含有位于GAL7启动子控制下的前原α交配因子编码序列。按上述纯化所得的约462bp片段，并SacI和NheI消化。将所得的约292bp片段连接到通过用SacI和NheI消化pUR7702而得到的约3025bp片段中。将来自用该连接产物转化的数个大肠杆菌的质粒DNA进行测序以确定是否克隆了正确的片段。将这些质粒之一命名为pUR7703(图7)。

为了构建能够在酵母中表达AFP-III盒的质粒，将合成基因-信号序列融合序列按如下导入到各种酵母表达载体中：

用标准技术，将pUR7702的约278bp SacI/HindIII片段和pUR7703的约488bp SacI/HindIII片段(分别携带有转化酶和α交配因子与AFP-III的融合序列)分别克隆到也用SacI和HindIII消化的酵母表达载体中。这些表达载体均携带了啤酒酵母GAL7启动子，这样在SacI位点插入的基因片段可以在GAL7的控制下进行插入基因的转录。

通过将来自pUR7702的转化酶信号序列AFP-III盒插入到多拷贝的核糖体DNA整合载体pUR2778中来制备pUR7704(图8)，而pUR7706(图9)是含有衍生于pUR7703的α交配因子AFP-III盒的pUR2778，插入在SacI和HindIII位点之间。实施例3在啤酒糖酵母中表达AFP-III

通过HpaI消化而将质粒pUR7704和pUR7706线性化，目的是将质粒整合到酵母rDNA区，然后通过电穿孔分别导入啤酒糖酵母菌株SU50中。通过其在不含亮氨酸时的生长能力来筛选转化体。为了表达克隆的AFP-III，首先使携带pUR7704或pUR7706的转化体在液体基本培养基中于30℃生长40小时，随后以1∶10用新鲜制备的诱导培养基(酵母提取物1％，Difco胨2％，半乳糖5％)稀释，并在30℃再保温48小时。在该过程结束时，检测培养上清液样品抑制冰晶生长的能力。

在-6℃30分钟后，显微镜下检查冰晶的生长。清楚地表明：与从未整合酵母或携带表达载体但没有AFP-III合成基因之酵母的上清液样品相比，来自携带合成AFP-III之酵母的上清液对冰晶生长有抑制作用。但是，酵母产生物质的再结晶抑制活性明显低于等量鱼AFP制品的抑制活性。

为了进一步分析所产生的抗冻肽，以4000rpm将来自pUR7704和pUR7706转化体诱导培养物的10ml样品离心5分钟，收集细胞和上清液，然后于-20℃贮存。用变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然用抗AFP特异性单克隆抗体通过Western印迹检测AFP。

在来自携带pUR7704和pUR7706上清液样品中，有一表现分子量为6.5kD的带，这清楚地表明这些转化体能够生产AFP-III。用反相HPLC纯化所述肽，并确定N末端序列。该序列表明酵母正确加工并分泌了HPLC-1肽。实施例4鉴定最有活性的美洲大绵鳚抗冻肽亚型

用两步法纯化AFP-III同种型。首先将样品上样到阳离子Mono S柱上，用所述梯度洗脱。图10中列出了洗脱图谱。从柱上分离出一个非拖尾峰(Q峰)和4个洗脱峰(S1到S4)。S1表示在这些条件下，与MonoS阳离子交换柱有最低结合能力的蛋白质，S4含有与柱有最大结合能力的蛋白质。收集峰，并用上述梯度上样到RP-HPLC柱上。图11中列出了层析谱。峰是AFP-III同种型。并用具体的条件，根据其在该柱上的行为从1标到12。所有AFP-III同种型均是在25到45分钟之间洗脱的。在图12到16中列出了Q和S1到S4级分的RP-HPLC层析谱。各级分得到不同的AFP-III同种型。，在表2中总结了在各峰中所含的AFP-III同种型。用小鼠抗-AFP-III抗血清检测从Mono S和RP-HPLC柱收集的级分，来自S1到S4的所有级分均与S型抗血清有阳性反应，来自Q组的同种型12与Q型抗血清有阳性反应。从同种型中的5个来确定N末端氨基酸序列(表3)。鱼溶菌酶污染了AFP-III HPLC 7峰，但鉴定的其他氨基酸序列与AFP-III同种型的已知序列相关。检测等量纯化蛋白质的抗冻活性。

正如用再结晶试验所表明的，只有AFP-III的HPLC-12同种型有显著的抗冻活性。为了证实这一发现，在存在或不存在HPLC-12同种型的条件下，重建美洲大绵鳚AFP-III同种型。完整重建的肽制品保持了粗鱼制品的活性，而不含HPLC-12同种型的制品通过再结晶试验表明，其抗冻活性大为降低。

用同种型12的胰蛋白酶消化产物，确定该同种型的全部氨基酸序列。发现该序列与文献中描述的序列相同(Davies and Chow，1990)。实施例5构建编码AFP-III的HPLC-12变异体的合成基因

按照如下构建与转化酶信号序列相连的编码HPLC-12抗冻肽的核苷酸序列，试验在啤酒酵母中表达优选的密码子：合成15个核苷酸的组(HPLC 12.1、HPLC 12.2、HPLC 12.3、HPLC 12.4、HPLC 12.5、HPLC 12.6、HPLC 12.7、HPLC 12.8、HPLC 12.9、HPLC 12.10、HPLC 12.11、HPLC 12.12、HPLC 12.13、HPLC 12.14和HPLC12.15)，主要含有成熟AFP的DNA序列，该序列优先使用啤酒酵母密码子。设计合成的基因，以使其含有与产生粘性末端的PstI和HindIII相容的单链区(图17)。

为了组装合成的HPLC-12基因，将各50pmol的寡核苷酸溶解在12μl水中，95℃保温2分钟，然后直接放在冰上。该变性步骤后，37℃，在含2.5mM ATP，5mM DTT和约10U多核苷酸激酶的20μl终体积中将所述寡核苷酸磷酸化40分钟，然后在95℃变性2分钟，接着置于冰上。将各10μl的磷酸化寡核苷酸与其大部分互补的DNA寡核苷酸混合以形成双螺旋。95℃保温2分钟变性后，将各双螺旋缓慢冷却到30℃。再合并所有10μl的双螺旋混合物，然后20℃在含50mMTris/HCl，pH7.5，8mM MgCl₂，8mM DTT和40μg/ml明胶和10UDNA连接酶的100μl终体积中保温2小时。然后沉淀连接混合物，并再溶解在30μl的TE缓冲液中。将15μl混合物放在2％琼脂糖凝胶上，从凝胶上切下预期大小(约291个碱基对)的DNA带，最后按照供应商的说明，用Gene Clean II方法纯化。

将该片段与衍生于通过SacI和HindIII消化而产生的多拷贝整合载体pUR2778的载体片段相连。确定所述插入片段的序列并将所得质粒命名为pUR7718(图18)。

通过HpaI消化而将质粒pUR7718线性化，目的是将质粒整合到酵母rDNA区，然后通过电穿孔分别导入啤酒酵母菌株SU50中。通过其在不含亮氨酸时的生长能力来筛选转化体。

为了表达克隆的HPLC-12，首先使携带pUR7718的转化体在液体基本培养基中于30℃生长40小时，随后以1∶10用新鲜制备的诱导培养基(酵母提取物1％，Difco胨2％，半乳糖5％)稀释，并在30℃再培养48小时。在该过程结束时，检测培养上清液样品抑制冰晶生长的能力。

结果(再结晶试验)清楚地表明培养上清液有高水平的抗冻活性。将这些结果与表达HPLC-1变异体之酵母而得到的结果进行比较，表明来自产生最低HPLC-12抗冻活性水平的转化体的上清液优于来自最佳HPLC-1转化体的上清液。

用携带pUR7718的SU50转化体完成补料分批发酵。在补料期结束时，用1升的吊桶(bucket)，用Jouan LR 5.22离心机，以4650rpm(7200g)离心30分钟收集细胞。用冰再结晶抑制试验，检测上清液的抗冻活性。未稀释的上清液明显抑制晶体生长，这表明在培养上清液中存在高水平的活性抗冻肽。

该发酵上清液的Western印迹表明分泌了AFPIII-HPLC12物质。酵母产生的HPLC12的表观分子量等于鱼产生的HPLC12的表观分子量。酵母产生肽的纯化和氨基酸测序证实不能将该物质与美洲大绵鳚产生的HPLC12肽区分开。参考文献：Campbell，I and Duffus，J.H.(1988)酵母，实践方法，IRL出版社，牛津。Chao，H.，Davies，P.L.，Sykes，B.D.and Sonnichsen(1993)用脯氨酸突变来帮助解决III型抗冻蛋白质的NMR溶液结构。蛋白质科学2 1411-1428。Chao，H.，Sonnichsen，F.D.，Deluca，C.I.，Sykes，B.D andDavies，P.L.(1994)在球形III型抗冻蛋白质中结构与功能的关系：鉴定与冰结合所需的表面残基簇。蛋白质科学3 1760-1769。Chung，C.T.，Niemela，S.L.Miller，R.H.，(1989)，一步法制备感受态大肠杆菌：在相同溶液中转化并贮存细菌细胞。美国国家科学院研究进展，86；2172-2175。Davis，P.L.and Chow，H.L.，(1990)，鱼抗冻蛋白质的生物化学，FASEB杂志，4 R2460-2468。Driedonks，R.A.Toschka，H.Y.van Almkerk，J.W，Schaffers andVerbakel，J.M.A.(1995)抗冻肽在啤酒糖酵母11中的表达与分泌。Egli，T.(1980)，Wachstum von methanol Assimelerende Hefen，博士论文Zurich 6538。van den Elzen等(1985)植物分子生物学，5：149-154。Erhart，E.，Hollenberg，C.P.(1981)通过的转化消除啤酒酵母2μm DNA，遗传学现状，3，83-89。Fletcher，G.L.Hew，C.L.Joshi，S.B.and Wu，Y.(1994)将表达抗冻多肽的微生物用于食品发酵和冷藏。美国专利申请。Gasson，M.J.(1993)，乳酸菌在生物技术中的发展和潜力，F.E.M.S.微生物学综述12，3-20。Hahahan(1988)遗传学研究年鉴(Ann.Rev.Genetics)22：479-519。Hew，C.L.Shaughter，D.，Shasbikant，B.J.，Fletcher G.L.andAnanthanarayanan V.S.(1984)来自纽芬兰美洲大绵鳚Macrozoarcesamericanus的抗冻肽：多种和组成性有害组分的存在，J.Comp PhysiolB.155，81-88。Hew，C.L.，Wang，N-C.，Joshi，S.，Fletcher，G.L.，Scott，G.K.，Hayes，P.H.，Buettner，B.and Davies，P.L.，(1988)多基因提供了抗冻蛋白多样性的基础和美洲大绵鳚中的含量，J.Biol.Chem.263，12049-12055。Keulers，M.(1993)Eindhoven技术大学的博士论文Li，X.，Trinh，K.Y.and Hew，C.L.(1992)在大肠杆菌中表达并表征来自美洲拟鲽、Macrozoarces americanus的活性和热更稳定性重组抗冻多肽：通过修饰mRNA的二级结构来提高表达。蛋白质工程，4：995-1002。McKown，R.L.and Warren G.J.(1991)表达抗冻基因类似物的酵母存活提高。低温生物学28，474-482。Romanos，M.A.，Seorer，C.A.and Clare，J.J.(1992)外源基因在酵母中的表达：综述，酵母8 423-488。Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约。Sanger，F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1977)，用链终止抑制剂进行DNA测序，美国国家科学院院报74：5463-5467。Sonnichsen，F.D.，Sykes，B.D.，Chao，H.and Davies，P.L.(1993)，III型抗冻蛋白的非螺旋结构，科学259，1154-1157。Toschka H.Y.，Verbakel，J.M.，Almkerk J.W.(1992)，优先权为7月29日的荷兰专利申请92202338.7的PCT专利申请WO94/03617，用于生产抗冻肽(AFP)的方法。Van Gorcom，R.F.M.，Hessing，J.G.M.，Maat，J.andVerbakel，J.M.A.(1991)木聚糖酶生产，国际专利中请WO91/19782。Verbakel，J.M.A.(1991)在啤酒酵母中表达异源基因。Utrecht大学的博士论文。Warren，G.J.，Hague，C.M.，Corroto，L.V.and Mueller，G.M.(1993)遗传工程抗冻肽的特性。FEBS Letters 321，116-120。Yanisch-Perron，C.，Viera，J.，Messing，J.(1985)改进的M13噬菌体克隆载体和宿主菌质：M13 mp18和pUC19载体的核苷酸序列。基因33，103-119附图描述

图1.III型AFP的同种型。划框区表示一致性区，阴影部分的氨基酸是对于所述肽的抗冻特性重要的氨基酸。

图2.编码AFP-III型HPLC1的合成基因。

图3.图示说明构建pUR7700，是携带合成AFP-III基因的质粒。

图4.酵母表达载体pUR2778的限制性图谱。

图5.图示说明构建pUR7701，是携带转化酶信号序列的质粒。

图6.图示说明构建pUR7702，是携带与转化酶信号序列在框架中相连的合成AFP-III基因的质粒。

图7.图示说明构建pUR7703，是携带与交配因子前原分泌信号序列在框内融合的合成AFP-III基因的质粒。

图8.图示说明构建pUR7704，是携带与转化酶信号序列在框内相连的合成AFP-III基因的多拷贝rDNA整合载体。

图9.图示说明构建pUR7703，是携带与交配因子前原分泌信号序列在框架中相连的合成AFP-III基因多拷贝rDNA整合载体。

图10.美洲大绵鳚抗冻肽从Mono S柱的洗脱图谱。

图11.用反相HPLC分离的抗冻肽的层析谱。

图12.用反相HPLC分离的Mono S S1抗冻肽的层析谱。

图13.用反相HPLC分离的Mono S S2抗冻肽的层析谱。

图14.用反相HPLC分离的Mono S S3抗冻肽的层析谱。

图15.用反相HPLC分离的Mono S S4抗冻肽的层析谱。

图16.用反相HPLC分离的Mono S S1抗冻肽的层析谱。

图17.编码III型AFP HPLC12转化酶信号序列融合蛋白的合成基因。

图18.质粒pUR7718的图。

                        表1

质粒名称相关特征pUR7700携带HPLC-1合成基因的pTZ19pUR7701携带转化酶信号序列的pTZ19pUR7702携带转化酶信号序列-HPLC-1融合基因的pTZ19pUR7703携带α交配因子信号序列-HPLC-1融合基因的pTZ19pUR7704携带转化酶信号序列-HPLC-1融合基因的酵母表达载体pUR7706携带α交配因子信号序列-HPLC-1融合基因的酵母表达载体pUR7718携带转化酶信号序列-HPLC-1融合基因的酵母表达载体

              表2：含AFP-III3同种型的Mono S级分

Mono S级分AFP-III 3同种型    Q    12    S1    4    5    6    S2    1    2    3    11    S3    7    S4    7    9

      表3：AFP-III同种型的N末端氨基酸序列。

 美洲大绵鳚的溶菌酶，正是称为AFP 3同种型7的肽：

                                        10                                      20Lys-Val-Phe-Asp-Arg-？-Glu-Trp-Ala-Arg-Val-Leu-Lys-Ala-Asn-Gty-Met-Asp-Gly-Tyr-21                                          30                                      40Arg-Gly-Ile-Ser-Leu-Ala-Asn-Trp-Val-？-Leu-Ser-Lys-Trp-Glu-Ser-？-Tyr-？-Thr-同种型编号：9

                                        10                                      20Ser-Gln-Ser-Val-Val-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ile-Pro-Met-Asn-Thr-Ala-Leu-Thr-Pro-Ala-Met-同种型编号：121                                            10Asn-Gln-Ala-Ser-Val-Val-Ala-Asn-Gln-Leu-Ile-Pro-Ile-Asn-Thr-Ala-Leu-

表4：AFP-III同种型编号12的胰蛋白酶肽的氨基酸序列肽编号1：N-末端1-231                                            10                                               20Asn-Gln-Ala-Ser-Val-Val-Ala-Asn-Gln-Leu-Ile-Pro-Ilc-Asn-Thr-Ala-Leu-Thr-Leu-Val-

         23Met-Met-Arg肽编号2：24到391                                            10Ser-Glu-Val-Val-Thr-Pro-Val-Gly-Ile-Pro-Ala-Glu-Asp-Ile-Pro-Arg肽编号3：40到471Leu-Val-Ser-Met-Gln-Val-Asn-Arg肽编号4：48到611                                            10Ala-Val-Pro-Leu-Gly-Thr-Thr-Leu-Met-Pro-Asp-Met-Val-Lys肽编号5：62到661Gly-Tyr-Pro-Pro-Ala