同时含有乙肝病毒和丙肝病毒核心抗原的双重抗原

摘要

利用基因重组技术,构建乙型肝炎病毒核心抗原(氨基酸1—144)与丙型肝炎病毒核心蛋白(氨基酸1—69)或(氨基酸1—40)基因融合的克隆,在大肠杆菌中表达可获得水溶性的、具有双重抗原性和免疫原性的融合蛋白颗粒。它可应用于乙肝和丙肝的预防、治疗、检测和抗体制备。含该融合基因的DNA也可插入适当的表达载体直接应用于乙肝和丙肝的DNA免疫和治疗。

说明书

本发明涉及利用基因重组技术获得的肝炎病毒抗原，尤指乙肝病毒核心抗原和丙肝病毒核心蛋白基因的融合克隆，并表达获得的双重抗原。

现已查明丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus，HCV)是引起输血后传染的非甲非乙肝炎的主要病原体。据统计，目前世界人口的1％已被HCV所感染，其中的25％为急性感染并出现黄疸，而其中的一半则将可能发展成慢性肝炎。而慢性感染者将发展演变为肝硬化和肝癌的可能性高达20％，因此危害性很大。同时，在世界范围内有3亿人口已被乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)所感染，如果不作适当预防和治疗可能会有1.4亿感染者将死于乙肝，同样，危害性也是十分大的。因此乙肝和丙肝的预防和治疗仍然是目前各国学者急待研究解决的重大课题。

研制乙型肝炎疫苗、预防接种乙肝疫苗是目前预防乙肝流行的根本途径。同时应用疫苗于慢性乙肝的治疗方面当今已显露出一些可喜的结果。乙肝疫苗已由应用血源疫苗发展到基因工程重组乙肝表面抗原疫苗。而新型基因工程疫苗，即带多重免疫决定簇的基因工程表面抗原疫苗也正在研制中。

近来研究表明，乙肝病毒核心抗原(HBcAg)在原核和真核表达系统中均能自行组装成直径为27nm的颗粒(Pasek，M.等，Nature 1979，282，575；Roossinck，M.J.等，Mol.Cell.Biol.1986，6，1393)。颗粒具有良好的免疫原性和稳定性，在体内能诱导产生依赖T细胞和不依赖T细胞的高滴度的抗体(Milich，D.R.等，Science 1986，234，1398)。利用乙肝核心抗原为免疫载体蛋白在合适的位点融合外源片段已有一些成功的例子，如口蹄疫病毒(Clake，B.E.等，Nature 1987，330，381；Beeretag，K.M.等，Bio/Technology 1990，8，644)，脊髓灰质炎病毒(Clake，B.E.等，J.Gen.Virol.1990，71，1109)，乙肝病毒preSl(Schodel，F.等，J.Virol.1992，66，106)等等。他们发现HBcAg在外源片段融合后仍能形成颗粒，被融合片段的免疫原性有一定的提高。

HCV研究由于起步较晚，目前尚未有合适的体外培养增殖系统，还不能直接研究其病毒蛋白。又由于HCV基因型变异多，而至今其保护性抗原尚未精确定位，因而目前HCV疫苗的研制仍未有重大突破。为防止HCV的传播，应加强对HCV感染的临床诊断和血源的检测。研制HCV疫苗、发展HCV的检测技术显得尤为重要。

大量的研究者报道，不同来源的HCV核心蛋白基因被认为是最为保守的区域，且受感染人群大多数都有核心蛋白抗体。HCV核心蛋白在HCV预防和治疗中的作用受到人们的重视，但如何获得具有良好免疫原性的HCV核心蛋白的问题尚未得到解决。各种表达体系中尚未成功地发现所获得的HCV全核心蛋白形成颗粒结构。

为此，本发明的目的是提供一种同时含有乙型肝炎病毒核心抗原与丙型肝炎病毒核心蛋白的双重抗原。该抗原是颗粒状融合蛋白，可通过一个含有HBcAg主要抗原决定簇基因(对应于1-144位氨基酸的乙肝病毒核心抗原基因)与HCV核心蛋白主要抗原决定簇基因(对应于1-69位氨基酸或1-40位氨基酸的丙肝病毒核心蛋白基因)的融合，再通过融合基因在大肠杆菌系统中表达后获得。

本发明是一种同时含有乙肝病毒和丙肝病毒核心抗原的双重抗原，该抗原是通过融合基因表达获得的具有双重抗原的融合蛋白颗粒，所述融合基因是乙肝病毒核心抗原中去除羧端精氨酸富集区后的主要抗原决定簇基因即对应于1-144位氨基酸的乙肝病毒核心抗原基因与丙肝病毒核心蛋白主要抗原决定簇基因即与对应于1-69位氨基酸或1-40位氨基酸的丙肝病毒核心蛋白基因的融合。

本发明选用羧端精氨酸富集区去除的HBcAg主要抗原决定簇作为载体，它的去除不影响HBcAg装配成颗粒的性质，也不影响其抗原性和免疫原性，然而，羧端被融合的外源片段长度可以增加，而且表达的融合蛋白的水溶性也可提高，有利于融合蛋白的纯化和应用。本发明选用包含HCV核心抗原主要抗原决定簇的氨端69个氨基酸或40个氨基酸作为被融合片段，在不影响HCV核心蛋白的抗原性和免疫原性的基础上，尽量缩短被融合片段的长度而使融合蛋白在大肠杆菌中的表达量提高，而且水溶性不受影响。本发明得到的这一新型双重抗原，它包含HBcAg和HCV核心蛋白的主要抗原决定簇部位，且能自发装配成颗粒，从而大大提高HCV核心蛋白的免疫原性，可以应用于乙肝和丙肝的检测，发展为乙肝和丙肝的预防和治疗疫苗，具有较广的应用范围和较高的应用价值。

本发明利用基因重组技术，在HBcAg(全长共183个氨基酸)基因中原先就含有的两个BspMII酶切点，用限制性内切酶BspMII局部酶解，选择单切开处于精氨酸富集区前第144位的BspMII切点，然后在去除了羧端富含精氨酸区后的相对应于羧端第144位氨基酸的位置上引入一个EcoRI酶切位点，构建了一个可在HBcAg的第144位氨基酸处与任何能对齐阅读框架的外源基因片段融合的通用融合载体pBc144E(见图1)。然后通过基因重组技术将HCV核心蛋白(全长共191个氨基酸)基因融合于构建的通用融合载体上的EcoRI位点后，得到HBcAg(氨基酸1-144)基因与HCV核心蛋白(氨基酸1-191)全基因的融合重组质粒pBc144Cc191(见图2)。在其基础上通过在HCV核心蛋白基因上对应于第69位氨基酸处的StyI位点或对应于第40位氨基酸处的ApaI位点经相应酶解后，再补平，回联得到羧端已缩短的融合克隆，即HBcAg(氨基酸1-144)基因与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)基因的融合克隆得含融合基因的重组表达质粒pBc144Cc69或pBc144Cc49(见图3)，其中重组表达质粒pBc144Cc69转入大肠杆菌TG-1中存放(由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，1997年4月14日，保藏编号为CGMCC No0302。)，该大肠杆菌经过表达，得到具有颗粒形状，为水溶性，并具有双重抗原性和良好的免疫原性的融合蛋白Bc144Cc69和Bc144Cc40。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)表明，表达的融合蛋白Bc144Cc69和Bc144Cc40都同时具有乙肝病毒核心抗原和丙肝病毒核心蛋白的双重抗原性。通过蛋白质印迹反应(Western Blot)的鉴定表明，融合蛋白Bc144Cc69和Bc144cc40既能与乙肝病毒核心抗原的抗体杂交反应，同时又能与丙肝病毒核心蛋白的抗体杂交反应(见图4)。这说明获得的该融合蛋白为水溶性良好的具有乙肝核心抗原和丙肝核心蛋白双重抗原性的融合抗原。另外，通过CsCl密度梯度超离心分析表明，Bc144Cc69具有1.31克/毫升和1.35克/毫升的密度峰，Bc144Cc40具有1.28克/毫升的密度峰(见图5)。通过电子显微镜直接观察表明(见图6)，经过初步纯化的该融合抗原能形成直径约为27nm的颗粒，颗粒形状与报道的HBcAg颗粒(Cohen，B.J.等，Nature，1982，296：677)相似。该融合抗原免疫BALB/C小鼠能同时产生高滴度的抗HBcAg和抗HCc抗体，具有良好的双重免疫原性，表明它可应用于制造预防、治疗、检测乙肝和丙肝的药物，还可用于抗体的制备。

上述融合基因可插入适当的表达载体以后，如pcDNA3、pMPSVHE、pBHE等，直接以DNA形式用于乙肝和丙肝的DNA免疫和治疗。下面实施例7和8将以pcDNA3为例说明。

上述融合基因也能在哺乳动物细胞、酵母、重组痘苗、昆虫细胞等真核系统中表达，其表达产物的性质应和在大肠杆菌系统中的基本相同。

本发明的优点：本发明构建了一个通用的HBcAg可融合任何外源基因的通用融合载体，它是删去了精氨酸富集区的核心抗原(氨基酸1-144)，其羧端引入了限制酶EcoRI酶切位点后构建而成。本发明提供了一个在EcoRI切点后与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)相融合，构成一个同时含有HBcAg和HCV核心蛋白的融合基因。该融合基因可通过大肠杆菌系统表达获得本发明双重抗原，为水溶性的融合蛋白颗粒，具有双重抗原性和良好的免疫原性，可应用于制造对乙肝和丙肝的预防，治疗及检测药物。含该融合基因的DNA也可插入适当的表达载体直接应用于作为乙肝和丙肝的DNA免疫和治疗的药物。

本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

本发明的附图说明如下：图1.含有HBcAg(氨基酸1-144)通用融合载体(pBc144E)的构建示意图。

各种符号说明：BcHBcAg(氨基酸1-183)；pKK223-3，载体质粒；

E/N，EcoRI和NcoI补平后接点；

H，HindIII；Bs，BspmII；E.linker(8mer)，EcoRI接头(8核苷酸)；

Klenow，大片段酶； lig.，连接酶；TAA，终止码。图2.含有HBcAg(氨基酸1-144)基因与HCV完整核心蛋白(氨基酸1-191)全

基因的融合重组质粒构建示意图。CcHCV核心蛋白(氨基酸1-191)；EHCV包膜蛋白；

Bc144HBcAg(氨基酸1-144)；5′5′端引物；3′，3′端引物；

pGEM3zf，载体质粒；PCR，聚合酶链式反应；

E/N，EcoRI和NcoI补平后接点；lig.，连接酶；

E，EcoRI；H，HindIII；B，BamHI；Bg，BglII。图3.含有HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)

融合基因的克隆构建示意图。Cc191HCV核心蛋白(氨基酸1-191)；Bc144HBV核心抗原(氨基酸1-144)；Cc69HCV核心蛋白(氨基酸1-69)；Cc40HCV核心蛋白(氨基酸1-40)；

pKK223-3，载体质粒；Ptac，tac启动子；

E/N，EcoRI和NcoI补平后接点；

E，EcoRI；H，HindIII；B，BamHI；Bg，BglII；

St，StyI；Ap，ApaI；Klenow，大片段酶；lig.，连接酶。图4.含HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)

融合基因表达产物的蛋白质印迹鉴定。

a.用抗HBcAg多抗的蛋白质印迹结果。

M.蛋白分子量标准  1.pBc144 2.重组表达质粒pBc144Cc69 3.

重组表达质粒pBc144Cc40

b.用抗HCV核心蛋白单抗的蛋白质印迹结果。

1.pBc144 2.重组表达质粒pBc144Cc69 3.重组表达质粒pBc144Cc40

注：融合蛋白与未融合蛋白的位置用▲标示，分子量略小的条带为

其降解产物，分子量大的条带为其二聚体形式。图5.含HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)

融合基因表达产物的CsCl密度梯度超离心分析。

a.Bc144Cc69

b.Bc144Cc40

○，CsCl密度；▲，HBcAg的抗原性分布；■，HCV核心蛋白的抗

原性分布。图6.含HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)

融合基因表达产物的电子显微镜观察(标尺长度为100nm)。

a.Bc144Cc69

b.Bc144Cc40图7.表达的Bc144Cc69和Bc144Cc40免疫小鼠产生抗HBcAg抗体水平的示意图。B144■B144C191□B144C69■B144C40图8.表达的Bc144Cc69和Bc144Cc40免疫小鼠产生抗HCcAg抗体水平的示意图。B144■B144C191□B144C69■B144C40图9.带CMV启动子的动物细胞表达载体pcDNA3(Invitrogen公司)

PCMV：巨细胞病毒早期启动子；

T7：T7噬菌体启动子；SP6：SP6噬菌体启动子；

Amp：氨苄青霉素抗性基因；

BGHPA：牛生长因子多聚腺嘌呤核苷；

nco：新霉素抗性基因。图10.含HBV的HBcAg(1-144)与HCV的HCc(1-69)或HCc(1-40)融合基因在pcDNA3上的重组克隆pcDNA3B144c69及pcDNA3B144c40结构示意图。

pCMV：巨细胞病毒早期启动子；

HBcAg(1-144)：乙肝核心抗原基因(氨基酸1-144位)；HCc(1-191)：丙肝核心抗原基因(氨基酸1-191位)；HCc(1-69)：丙肝核心抗原基因(氨基酸1-69位)；HCc(1-40)：丙肝核心抗原基因(氨基酸1-40位)；H：HindIII酶切位点；E：EcoRI酶切位点；GNSDP：依次代表甘氨酸，天门冬酰胺，丝氨酸，天门冬氨酸，脯氨酸。图11.pcDNA3B144c69及pcDNA3B144c40免疫BALB/c小鼠产生抗乙肝HBcAg抗体水平变化的示意图。pcDNA3B144■pcDNA3B144C191□pcDNA3B144C69■pcDNA3B144C69图12.pcDNA3B144c69及pcDNA3B144c40免疫BALB/c小鼠产生抗丙肝HCcAg抗体的水平变化的示意图。pcDNA3B144■pcDNA3B144C191□pcDNA3B144C69■pcDNA3B144C69

实施例1.含有HBcAg(氨基酸1-144)通用融合载体的构建

采用含有HBcAg基因的表达质粒pBc183(中国科学院上海生物化学研究所提供)为起始质粒。pBc183是在质粒pKK223-3(Pharmacia产品)上重组有HBcAg基因的表达质粒。主要构建过程是：将含有完整的HBcAg基因的NcoI-HindIII片段分出，并将NcoI酶切点末端用大片段酶补平，再将该片段插入先经EcoRI和HindIII酶切开后，并将EcoRI切点末端用大片段酶补平的pKK223-3质粒上，基因重组所用限制性内切酶，连接酶，合成的EcoRI接头皆为德国Boehringer公司产品，质粒DNA制备按德国Qiagen公司提供的试剂和方法进行。质粒重组和细菌转化参照Sambrork，J.等人的《分子克隆》上的常规方法进行，所用受体菌为大肠杆菌TG-1。由于HBcAg中有两个BspmII位点，故采用局部酶解法，选择单切开相应于第144位氨基酸位点的质粒，经电泳胶回收后用大片段酶补平后加入EcoRI接头(GGAATTCC 8mer)，得到在HBcAg第144位氨基酸处加入了EcoRI切点的重组质粒，构建成可与HBcAg的第144位氨基酸融合的通用融合载体(pBc144E)，该通用融合载体在EcoRI切点处可引入任何能对齐框架的含有终止码的外源基因片段(见图1)。

上述质粒若经EcoRI酶切后，再用大片段酶补平后回连即可产生一个终止码，得到重组质粒pBc144，则可用于单独表达乙肝核心抗原蛋白Bc144(HBcAg(氨基酸1-144))(见图1)。实施例2.含有HBcAg(氨基酸1-144)基因与HCV核心蛋白(氨基酸1-191)全基

因融合重组质粒的构建

采用含HCV核心蛋白的表达质粒pGEM3zf/HCV-CE(由上海医科大学闻玉梅教授提供)为PCR合成的模板，PCR用试剂盒为美国Promega公司产品。pGEM3zf/HCV-CE为质粒pGEM3zf(Pharamcia产品)上重组有HCV核心蛋白和部分包膜蛋白基因的表达质粒。为使在完整的HCV核心蛋白基因上便于操作，设计合成的23mer的5′端引物5′GCTCGGTGAATTC GGATCCCATG 3′引入EcoRI和BamHI酶切点，3′端引物25mer 5′GGAGTAAGCTTATAGATCTGCTGAC3′引入HindIII和BglII酶切点。在HindIII前还同时含有TAA终止码。用PCR合成了全长1-191位的完整的HCV核心蛋白基因，用EcoRI和HindIII双酶解后直接插入实施例1中的经同样酶解后的重组质粒pBc144E中即可得到含有HBcAg(氨基酸1-144)基因与HCV核心蛋白(氨基酸1-191)全基因的融合重组质粒pBc144Cc191(见图2)。实施例3.含有HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸

1-40)融合基因的克隆构建

将含有丙肝核心蛋白全基因的融合重组质粒pBc144Cc191经StyI(丙肝核心蛋白基因对应69位氨基酸处)和BglII双酶切，分去StyI-BglII所含HCV核心蛋白部分后(即删除了HCV核心蛋白中自69位氨基酸后的部分)，用大片段酶补平后回连，就构建成了在pKK223-3上由tac启动子控制下表达HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)融合基因的重组表达质粒(pBc144Cc69)(见图3)。含有HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)融合基因的重组表达质粒可转入大肠杆菌TG-1中存放。

同样，若在pBc144Cc191质粒上用ApaI(40位氨基酸处)和BglII双酶切，删去HCV核心蛋白中第40位氨基酸以后的部分，即可构建成表达含HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-40)融合基因的重组质粒(pBc144Cc40)(见图3)。实施例4.含HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-

    40)融合基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的双重抗原性的

    酶联免疫吸附测定

融合基因重组表达质粒pBc144Cc69(或pBc144Cc40)在大肠杆菌TG-1中进行表达，37℃培养3小时后，用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，至终浓度为0.1mM/ml)诱导，继续培养6小时后收获菌体。制备初步纯化蛋白，HBcAg的酶联免疫测定(ELISA)，用上海科华实业公司的核心抗原试剂盒和方法进行。融合蛋白中的HCV核心蛋白的测定，采用科华测定HBeAg试剂盒中所提供的包被板，在与样品反应后，再用HCV核心蛋白单抗(针对氨基酸1-120，WAKE-CHEMIE，1∶50稀释)结合，再用与兔抗鼠IgG酶联结合物(DAKO，1∶1000稀释)反应，最后再用显色液显色。对表达产物中HBcAg和HCV核心蛋白的抗原性进行了ELISA测定，结果见表1。表1.含HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)

融合基因在大肠杆菌中表达产物的双重抗原性的ELISA测定

    HBcAg    HCc  pBc144    1.608    0.041  pBc144Cc69    1.307    1.288  pBc144Cc40    1.371    1.217

HBcAg，HBV核心抗原；HCc，HCV核心蛋白。

注：初步纯化蛋白1/16μg分别用ELISA法检测HBcAg和HCV核心蛋白抗原性。

表中所示为ELISA测定的A450值。

结果表明，本发明构建的含HBcAg(氨基酸1-144)和HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)的融合基因都同时表达了HBcAg和HCV核心蛋白，而pBc144中因没有HCV核心蛋白基因故仅有HBcAg的表达。实施例5.含HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-

     40)融合基因在大肠杆菌中表达产物的蛋白质印迹反应

表达产物的蛋白电泳分析，采用15％SDS聚丙烯酰胺电泳参照Laemmli法进行(Laemmli，U.K.等，Nature 1970，223，680)。表达产物的免疫印迹反应采用ECL非放射性标记检测法，按美国Amersham公司提供的试剂与操作方法进行。其中针对HBcAg的一抗用兔抗HBcAg多抗(DAKO，1∶500稀释)，针对HCV核心蛋白的一抗用其单抗(WAKE-CHEMIE，1∶50稀释)。分别用抗HBcAg多抗及抗HCV核心蛋白单抗进行杂交，对表达产物进行WesternBlot鉴定，结果见图4。

结果再一次说明融合的HBcAg(氨基酸1-144)-HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或HBcAg(氨基酸1-144)-HCV核心蛋白(氨基酸1-40)基因都同时获得了HBcAg与HCV核心蛋白的表达。

由Western Blot得到的特异条带的分子量大小与预计的相符：融合蛋白Bc144Cc69在26Kd处，Bc144Cc40在22Kd处。而且分别与抗HBcAg多抗和与HCV核心蛋白单抗杂交所得的特异条带位置吻合，这表明表达的融合蛋白同时具有HBcAg和HCV核心蛋白的抗原性。实施例6.含HBcAg(氨基酸1-144)与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-

    40)融合基因在大肠杆菌中表达产物的CsCl密度梯度超离心分析

    和电子显微镜观察

融合基因在大肠杆菌TG-1中的表达裂解物经CsCl密度梯度超离心(日立，水平头PPS65T)45krpm，8℃，48小时，由管底打孔，分管收集，对每管中的HBcAg和HCV核心蛋白分别进行ELISA测定，用上海科华实业公司的核心抗原试剂盒和方法进行(参考实例4)。两者ELISA峰值完全重合，融合蛋白Bc144Cc69都在密度为1.35g/ml及1.31g/ml处，而融合蛋白Bc144Cc40在密度为1.28g/ml处(见图5)。

将峰值处的融合蛋白经2％醋酸铀负染后在日立电子显微镜下观察，两种融合蛋白均可见直径约为27nm的均匀颗粒。颗粒形状与报道的HBcAg颗粒相似(Cohen，B.J.等，Nature 1982，296，677)(见图6)。实施例7.表达的融合抗原Bc144Cc69和Bc144Cc40免疫原性的试验

    表达的融合蛋白Bc144Cc69和Bc144Cc40以及对照Bc144和Bc144Cc191初步纯化基本按Jian Zheng等人(J.B.C.1992，267，9422-9429)报道的方法进行，即经过羟基磷灰石和Sepharose CL-4B两步柱层析纯化。用ELISA法(实施例4)测定乙肝核心抗原或丙肝核心蛋白的活性峰，收集活性部分即为初步纯化的融合蛋白。

选用6-8周龄的BALB/C雄性小鼠(每组5只)，每只小鼠经腹腔注射10微克初步纯化的表达蛋白或融合蛋白Bc144，Bc144Cc191，Bc144Cc69及Bc144Cc40(先与等体积的完全佐剂混匀)，4周后用相同量加强一次(先与等体积的不完全佐剂混匀)。用注射生理盐水作为空白对照。在第一次注射后的第2，4，6，8和13周采血，测定血清中抗乙肝核心抗原抗体和抗丙肝核心蛋白抗体的变化，结果见图7和图8。由图7中可以看出，本发明构建的融合抗原Bc144Cc69和Bc144Cc40与载体蛋白Bc144及乙肝核心抗原与丙肝全长核心蛋白的融合蛋白Bc144Cc191，在免疫后的第2周即有104高滴度的抗HBcAg抗体产生，第4周后滴度上升了10倍达105。同时可以看出Bc144Cc69和Bc144Cc40与Bc144及Bc144Cc191，6周后产生的抗HBcAg抗体的滴度处于同一个水平上。

融合抗原Bc144Cc69和Bc144Cc40在第一次免疫后的第6周后，血清中检测到抗丙肝HCcAg抗体的产生，到13周时抗体滴度水平也可达104(见图8)。Bc144Cc69和Bc144Cc40与Bc144Cc191相比，产生抗丙肝HCcAg的水平明显要高过一个数量级。其中Bc144蛋白中因没有丙肝核心蛋白，故不能产生抗HCcAg抗体。

上述结果表明，本发明构建的含乙肝核心抗原(氨基酸1-144)和丙肝核心蛋白(氨基酸1-69)或(氨基酸1-40)的融合基因表达的Bc144Cc69和Bc144Cc40免疫小鼠都能产生抗乙肝核心抗原抗体和抗丙肝核心蛋白抗体，具有良好的免疫原性，产生抗乙肝核心抗原抗体水平与载体蛋白Bc144及融合有全长丙肝核心蛋白的Bc144Cc191相当。产生抗丙肝核心蛋白抗体的水平比Bc144Cc191为高。实施例8.含HBcAg(氨基酸1-144)基因与HCV核心蛋白(氨基酸1-69)

    或(氨基酸1-40)融合基因在动物细胞表达载体pcDNA3上的重

    组克隆(pcDNA3B144c69及pcDNA3B144c40)的构建

采用含CMV(巨细胞病毒)启动子的质粒pcDNA3(Invitrogen公司产品)为动物细胞表达载体(见图9)。

首先以含有乙肝核心抗原(氨基酸1-144)基因的通用融合载体pBC144E(见实施例1)为PCR底物。用含HindIII酶切位点的5′引物5′CTCAAGCTTCCATGGACATCGACCCTTATAA3′和用含EcoRI酶切位点的3′引物5′GGAATTCCCCGGAAGTG3′采用PCR法扩增出5′端为HindIII切点，3′端为EcoRI切点的乙肝HBc(1-144)片段，插入经同样酶解开的pcDNA3得到重组质粒pcDNA3B144(见图10中的A)。

在重组质粒pBc144Cc69(见实施例3)上，用HindIII切开并补平，再用EcoRI酶切开，解下含HCV核心抗原(氨基酸1-69)基因片段，插入经EcoRI和EcoRV双酶解的上述pcDNA3B144，即构建成了在CMV启动子控制下的含乙肝HBcAg(氨基酸1-144)与丙肝HCcAg(氨基酸1-69)的重组融合基因表达克隆pcDNA3B144c69(见图10中的C)，另外，在重组质粒pBc144Cc40上(见实施例3)，同样先用HindIII酶切开，并补平，再用EcoRI酶切开，解下含有HCV核心蛋白(氨基酸1-40)基因片段，插入经EcoRI和EcoRV双酶解的上述pcDNA3B144质粒，即构建成在CMV启动子控制下含乙肝HBcAg(氨基酸1-144)与丙肝HCcAg(氨基酸1-140)的重组融合基因表达克隆pcDNA3B144c40(见图10中的D)。

所构建成的上述含乙肝核心抗原基因与丙肝核心蛋白融合基因的重组表达质粒pcDNA3B144c69与pcDNA3B144c40，都经转染COS细胞后，用ELISA法(参见实施例4)分别测定了细胞裂解物中表达的乙肝和丙肝核心抗原为阳性，并经蛋白质印迹反应为阳性，证明结构正确后备用。实施例9.含乙肝核心抗原与丙肝核心蛋白融合基因的克隆pcDNA3B144c69

    和pcDNA3B144c40的DNA直接免疫试验

选用6-8周龄的BALB/c雌性小鼠(每组7只)，在小鼠一侧后腿的前胫骨肌肉注射100μl10-5M心脏毒素(cardiotoxin，Sigma公司产品)5天后，在同一部位注射由上述100ugDNA样品溶于100μlPBS缓冲液配制的溶液，4周后以相同剂量在另一侧后腿的前胫骨肌肉加强一次(在该侧部位加强前5天也同样用心脏毒素处理)。

用只含有HBV核心抗原(氨基酸1-144)的pcDNA3B144以及含HBV核心抗原(氨基酸1-144)与完整的丙肝核心蛋白(氨基酸1-191)的pcDNA3B144C191为对照。

在初次免疫后的第2，4，6，8，及11周，尾静脉采血，对血清中的抗乙肝核心抗体和抗丙肝核心抗体水平用ELISA进行了测定。

血清中抗乙肝HBcAg抗体或抗丙肝HCcAg抗体分别用在大肠杆菌表达的经纯化的乙肝核心抗原(氨基酸1-144)蛋白或丙肝核心抗原(氨基酸1-40)与谷胱甘肽巯基转移酶的融合蛋白(由中科院上海生化所提供)，每孔0.1μg包板，用兔抗鼠IgG辣根过氧化酶结合物反应(DAKO公司产品1∶1000稀释)，用TMB(四甲基联苯胺)为显色底物，在酶标仪上测定450nm波长吸收值，结果见图11和图12。

可以看出pcDNA3B144c69和pcDNA3B144c40DNA直接免疫小鼠都能在2周后产生抗乙肝HBcAg的抗体，4周后达到103水平，同时也能诱发小鼠产生抗丙肝HCcAg抗体，6周后达到102水平。pcDNA3B144c69与pcDNA3B144c40产生两种抗体的水平与融合有完整的丙肝核心抗原基因(氨基酸1-191)的pcDNA3B144c191相比，几乎相当，甚至略显稍高。

上述结果表明，本发明构建的乙肝核心抗原(氨基酸1-144位)与丙肝核心蛋白(氨基酸1-69位)或(氨基酸1-40位)的融合基因在真核细胞的表达载体pCDNA3上的克隆：pCDNA3B144C69和pCDNA3B144C40用DNA直接免疫BALB/C小鼠后能同时产生抗乙肝核心抗原抗体和抗丙肝核心蛋白抗体，同时具有良好的双重的乙肝核心抗原的免疫原性和丙肝核心蛋白免疫原性。