用于DNA测序的具有修饰的核苷酸结合位点的DNA聚合酶

摘要

编码被修饰的DNA聚合酶的被修饰的基因,其中被修饰的聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶相比,结合双脱氧核苷酸的能力比相应的脱氧核苷酸至少增强20倍。

说明书

本申请是1994年10月17日提交的Tabor和Richardson的标题为“用于DNA测序的具有修饰的核苷酸结合位点的DNA聚合酶”的申请的部分继续，后者全文(包括附图)在此引入作为参考。发明背景

本发明是在政府的支持下(包括美国能源部合同号DE-FG02-88ER60688的资助下)完成的。美国政府对本发明享有某些权利。

本发明涉及适于DNA测序的DNA聚合酶和DNA测序的自动与手工方法。

下面是与DNA测序技术相关领域的简述。它仅为阅读本申请者提供一般指导，并不意味着本文所引用的或直接或间接涉及的任何技术对所附权利要求而言是现有技术。

DNA测序一般涉及生成四种具有一个确定末端和一个可变末端的单链DNA片段的群体。可变末端通常在特定核苷酸残基(鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C))终止。四组不同的片段根据其长度而被分开，一种方法是用高分辨率聚丙烯酰胺凝胶；胶上每条带共线性地对应DNA序列中一个特定核苷酸，由此鉴定给定核苷酸残基在序列中的位置。见Tabor和Richardson，美国专利4,942,130和4,962,020。

DNA测序有两种一般方法。一种方法(Maxam和Gilbert测序)涉及分离的DNA片段的化学降解，每个片段在其确定末端用单个放射性标记物标记，每种反应特异性地在4种残基(G、A、T或C)的一种或多种得到有限的切割。另一种方法(双脱氧或链终止测序)涉及一条DNA带的酶促合成。Sanger等(美国国家科学院院刊，74：5463,1977)。通常进行四种独立的合成，每个反应通过加入适当的链终止核苷酸，如双脱氧核苷酸，在特定残基(G、A、T或C)处终止。优选后一种方法，因为DNA片段通过加入放射性标记的核苷三磷酸可被均一地标记(而非末端标记)，因此大的DNA片段含有更多的放射性。进一步可不用32P标记的核苷酸而用35S标记的核苷酸，以提高分辨率；由于每泳道只对应G、A、T或C而更容易解释反应产物。常用于双脱氧法测序的酶有T7 DNA聚合酶和分离自嗜热生物体的DNA聚合酶如Taq、Vent、Tth等。其它的较少用的聚合酶包括AMV反转录酶和大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段。

在双脱氧链终止法中一段短的单链引物退火到单链模板上。掺入脱氧核苷酸(dNMP)将模板3′端延长直到掺入双脱氧核苷酸(ddNMP)为止。掺入ddNMP则延长终止于该残基。可不用ddNTP而用其它链终止剂，并且ddNTP可如下述标记。

用上述方法已研制出DNA序列分析用的自动系统。EG&G制造的一种仪器利用放射性标记的核苷酸的常规双脱氧链终止反应。用凝胶电泳分离得到的DNA产物，Toneguzzo等，生物技术，6，460，1988。放射性物质通过凝胶底部时由检测仪扫描。每个待测序模板需要4种合成反应以及每块胶上4条泳道，每种特定链终止剂的终止产物用单独的一条泳道。    

Kambara等，生物工程6，816，1988，使用了荧光标记的引物。得到的荧光标记产物在凝胶底部用激光激发，用CRT监测仪检测荧光。该方法对每个待测序引物也需要4种合成反应和凝胶上的4条泳道。

应用生物系统公司制造一种采用4种不同引物的仪器，每种引物用一种不同的荧光标记物标记。Smith等，核酸研究，13，2399，1985；自然，321，674，1986。每种不同反应用的引物含有四种核苷酸之一。

4种反应完成后将混合物合并到一起，DNA片段在凝胶上的一条泳道上分级。在凝胶底部用一束激光来检测在凝胶上电泳过的荧光产物。该系统对每个模板需要4种不同的退火反应和4种不同的合成反应，但在凝胶上仅需一条泳道。一条泳道上有4种带使序列更容易用计算机分析。

杜邦公司曾经提供一种仪器，其中四种双脱氧核苷三磷酸上各连上一种不同的荧光标记。Prober等，科学，238，336，1987。需要单一的退火步骤，单一的聚合酶反应(含有4种被标记的双脱氧核苷三磷酸)和测序凝胶上单一泳道。DNA产物的4种不同的荧光标记当其在凝胶上电泳后分别被检测。

Englert等，美国专利4,707,235(1987)描述一种多道电泳仪，它具有一种基本上跨越凝胶全长的检测装置，当4条泳道上的标记的DNA产物通过检测装置时它们可以被检测到，并且鉴定出样品所处通道或泳道。优选地用放射性同位素标记。

当前所用的DNA序列分析方法本质上必需用凝胶渗透如聚丙烯酰胺凝胶电泳将放射性或荧光标记的DNA产物分开，然后确定在沿通过凝胶的轴上它们之间的相对位置。该方法的准确度部分地取决于在凝胶上迁移了大约相等的距离的带上信号的均一程度。相邻带之间信号强度区别或差异造成几种问题。首先，这降低该方法的敏感性，而该敏感性受检测含最小信号的带的能力的限制。第二，这在确定一条信号弱的带是加入链终止剂的真实信号，还是DNA上聚合酶解离的停顿位点造成的伪迹时会产生困难。第三，由于一条带的强信号会屏蔽相邻带的弱信号而降低确定紧邻带上DNA序列的准确度。见Tabor和Richardson，引文见上。

带的强度的差别可能源于多数DNA聚合酶的内在性质。多数DNA聚合酶对用于DNA序列分析的链终止双脱氧核苷酸区别对待(discriminate)。T4DNA聚合酶对ddNTP区别对待太强，不能用于DNA测序。大肠杆菌DNA聚合酶I Taq和Vent DNA聚合酶也对ddNTP强烈地区别对待，各酶掺入ddNMP的能力比掺入相应的dNTP少一千倍。Tabor和Richardson，引文见上(均在此引入作为参考)显示T7 DNA聚合酶处于另一极端，它对ddNTP的区别对待仅有几倍。如果DNA聚合酶在所有序列对ddNTP均以同样程度区别对待，调整ddNTP对dNTP的比例即可简单地解决这个问题。这种方法已用于大肠杆菌DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。但是区别对待的程度随相邻DNA序列而变，导致相邻放射性片段的强度差别很大。对大肠杆菌DNA聚合酶I，具体的片段强度可相差50倍，而对T7 DNA聚合酶仅相差几倍。因而DNA测序胶上T7 DNA聚合酶产生的带的强度相似，可以方便地用自动方法来检测与分析。另外有描述进一步降低T7 DNA聚合酶对双脱氧核苷酸区别对待程度的方法，能平等地掺入双脱氧核苷酸和脱氧核苷酸。这些方法也减少其它DNA聚合酶如Klenow和Taq DNA聚合酶的区别对待程度，但不能完全消除区别对待。例如在反应混合液中用锰而不用镁或既用镁又用锰可以降低或消除对双脱氧核苷酸的区别对待。这种条件下，T7 DNA聚合酶不对两种分子进行区分而其它DNA聚合酶如Klenow片段，Taq和Vent仍在一定程度上区别对待。例如当锰存在时，Klenow仍对ddNTP区别对待4倍。更为重要的是，尽管这些酶如Klenow和Taq DNA聚合酶的区别对待的整体程度降低了，但由于在DNA中特定序列上高的区别对待使特定片段强度相差4倍以上。如今这些聚合酶和操作方法广泛用于手工DNA测序(即，不借助上述测序仪器)和普遍用于自动方法。使用锰以及在所有位点对ddNTP不再区别对待可以得到统一强度的带，使得手工或自动操作方法中阅读测序胶更加便利。而且由于不再区别对待，可以用新操作方法来做序列分析(Tabor和Richardson，引文见上)。提供一种基于该发现的方法，在含有不同比例的所有4种ddNTP的一个反应中，通过测量凝胶电泳后每个峰的相对强度来确定DNA序列。作者们指出：

本发明的DNA聚合酶对双脱氧核苷酸类似物和正常核苷酸区别不大。即掺入类似物的机率与掺入正常核苷酸的几率近乎相等，或掺入类似物的几率至少是掺入正常核苷酸的几率的1/10。本发明的聚合酶对某些其它类似物区别也不大。因为除了四种正常的脱氧核苷三磷酸(dGTP，dATP，dTTP和dCTP)，测序反应要掺入其它类型的核苷衍生物如：通常用来用³⁵S，³²P标记合成链的放射性或荧光标记的核苷三磷酸，或其它化学试剂，故而这一点很重要。若DNA聚合酶不对类似物区别对待，则掺入类似物与掺入正常的核苷酸有相同的几率。对于标记的核苷三磷酸，为了用最小量的放射性有效地标记合成的DNA链[4,942,130，COL 5：5]，这一点很重要。

他们还指出：

能够得到强度近似相等的相邻带十分有用，因为这样可以更方便地读出任何测序反应的结果并且把握更大。此外，由于测序反应中带有特定链终止剂的DNA产物形成的带与附近带强度几乎相同，则带强度本身为这样形成的一系列带提供了一种特定的标记。某一给定链终止剂得到的分子量几乎相同的DNA产物数目依链终止剂的浓度而改变。因此在合成中4种链终止剂的浓度不同，掺入一种链终止剂的DNA产物同掺入其它链终止剂的分子量几乎相同的DNA产物因其数目或量不同而区分开来；因而只需简单地将DNA产物的带与附近带的强度对比就可鉴定出它的链终止剂。结果是每一系列含有一种不同的链终止剂的两种或多种系列的DNA产品可加到一条泳道上做凝胶扩散，将每条带与附近带的强度进行而鉴定出来。而且合成掺入不同链终止剂的DNA产物不需要在单独的容器中分别进行，可以在一个反应容器中同时进行，并且如果需要，同一种标记物如放射性同位素或荧光等标记物可用于所有的链终止剂而不是每个链终止剂用一种不同的标记物，从而简化了操作过程。[4,962,020，COL 3：1-35]

也可以见Tabor和Richardson，美国国家科学院院刊86，4076-4080(1989)，该文指出T7 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶催化过程中用锰离子代替镁离子能将这些聚合酶对ddNTP的区别对待降低4-100倍。也可以见Tabor和Richardson，生物化学杂志，265,8322-8328(1990)，该文描述用T7 DNA聚合酶、焦磷酸酶和锰离子得到强度一致的双脱氧终止片段。发明概述

申请人相信，某些DNA聚合酶较少用于双脱氧DNA测序，部分地是由于这些聚合酶掺入ddNMP(或其它核苷酸类似物)代替dNMP的能力较低。如上面提到的，若能够不区别对待，则比区别对待的酶可以用更低浓度的ddNTP，更重要的是，在测序胶上能提供沿其长度方向强度更统一的成带模式。这些结果使得用该酶自动测序更容易也更有利，因为可以更有把握地确定更长的DNA序列。  

本发明提供一种方法，将原本有区别对待性质的DNA聚合酶改变后，与相应的天然存在的酶相比对ddNTP的区别对待更小。该方法涉及遗传修饰该聚合酶，在关键位置得到能够增强该聚合酶掺入dNMP类似物的能力的氨基酸残基。申请人已确定DNA聚合酶特定区域的氨基酸变化对这些DNA聚合酶掺入双脱氧核苷酸的能力有极大影响；插入的特定氨基酸残基决定该聚合酶对ddNTP区别对待得更大还是更小。申请人已确定修饰DNA聚合酶使之更有效地掺入双脱氧核苷酸对其在DNA测序中的应用影响极大。有可能这种修饰的DNA聚合酶在其它常见的分子生物学方法如DNA扩增(例如通过聚合酶链式反应)、体外诱变和填补DNA片段末端中也很有用。该技术与改变DNA聚合酶(例如T7 DNA聚合酶，描述见Tabor和Richardson，引文见上)的3′-5′外切酶活性的现有技术，测序反应中锰和焦磷酸酶的应用相结合将会生产出比已知酶要优越得多的酶。修饰DNA聚合酶优选地替换一个或多个氨基酸，但也可以是插入一个或多个另外的氨基酸或缺失一个或多个氨基酸。

在一特定方面，即DNA测序方面，具有在DNA测序条件下于50℃，特别是60℃，70℃，甚至是80℃以上的温度下催化核苷酸聚合的能力的嗜热酶在本领域广为人知。这些酶通常存在于在这些温度下生长的生物中。而且申请人认为许多这样的酶存在不足之处，包括掺入双脱氧核苷酸的能力有限。通过用下述方法修饰这些酶，本领域的专业人员可以修饰任一所需的嗜热DNA聚合酶，使之更有效地掺入双脱氧核苷酸。在自动仪器和手工测序中，特别是在循环测序操作中，这样的酶要比当前用于DNA测序的酶要优越得多。在循环测序中，对同一模板进行多轮DNA合成，每轮用热变性除去合成链；这样在测序反应中可用更小量的DNA模板。

申请人通过实验确定在相对来说不区别对待的酶(T7 DNA聚合酶)中氨基酸残基526使酶具有这种性质。申请人已确定，通过修饰526号残基有可能使T7 DNA聚合酶区别对待的能力增加许多倍。基于T7DNA聚合酶和其它DNA聚合酶的氨基酸同源性，申请人已确定改变其它DNA聚合酶上同源位点的残基可类似地影响其区别对待双脱氧核苷酸的能力。这种同源位点的例子有大肠杆菌DNA聚合酶I的762号残基和Taq DNA聚合酶的667号残基。在所有这3个例子中，申请人表明重要的是该位点的残基不是苯丙氨酸(F)，例如可以在T7 DNA聚合酶中为酪氨酸(Y)。令人惊奇的是，修饰这一个氨基酸残基，甚至是仅仅加入一个羟基基团，就能使区别对待的水平变化很大(250-8,000倍)。本领域专业人员应当理解，本发明不限于这一个位点的变化，用常规实验可方便地找出其它位点上降低聚合酶区别对待能力的变化。例如，申请人发现在其它13个位点修饰T7 DNA聚合酶能增强其区别对待ddNTP的能力，但在这些位点上改变的效果要小得多，仅为5-20倍。用类似的方法可在其它DNA聚合酶中方便地鉴定出影响对ddNTP的区别对待的位点，使这些酶在DNA测序中用处更大。这些其它的位点包括大肠杆菌DNA聚合酶I和T7 DNA聚合酶之间高度同源区域的氨基酸残基，因为这些区域有可能部分地构成ddNTP的结合区；在大肠杆菌DNA聚合酶I中，这些区域包括与T7 DNA聚合酶类似区域中的氨基酸，如区域665-681和754-783中的保守或非保守的氨基酸，并也可能在709-734，794-866和913-927区域。提供所需功能的氨基酸变化可选作与非区别对待酶T7 DNA聚合酶中对应的氨基酸相同，或是其它可通过常规实验选出的功能对应的氨基酸。通过改变非保守氨基酸可以更深入地改变区别对待的能力。非保守氨基酸是在一种聚合酶与另一种聚合酶中互不相同的氨基酸(即存在于不足50％的聚合酶中)。术语“类似的”用其常用含义。因此Pol I聚合酶类似物是具有Braithwaite和Ito(引文见下)描述的氨基酸序列的酶，它优选地与Pol I聚合酶家族其它成员，本文称为Spo2 DNA聚合酶，有亲缘关系。可用Felsenstein的PHYLIP程序进行这种分析。同前。

因此本发明一方面涉及编码修饰的DNA聚合酶的被修饰的基因。该基因经修饰能够生产与相应天然存在的或未修饰的DNA聚合酶相比，结合双脱氧核苷酸与结合脱氧核苷酸相比的能力有增加的修饰DNA聚合酶。

“能力增加”指该DNA聚合酶能更好地掺入双脱氧核苷酸。即与相应天然存在的DNA聚合酶相比，该酶对双脱氧核苷酸比对脱氧核苷酸区别对待的程度更小。测量这种区别对待的特定方法由下文描述。术语“增加”指在掺入这种双脱氧核苷酸的能力上有能够测量的差别。在优选实施方案中是比天然存在的酶至少增加10％，尽管优选地对双脱氧核苷酸区别对待的程度降低至少10到100倍，优选的是100-500倍。一个这样的酶的例子是大肠杆菌DNA合成酶I，它(如本文所述)掺入双脱氧核苷酸比掺入脱氧核苷酸的区别对待约大140-1,100倍。用本发明的方法可得到一种酶(仅改变一或两个氨基酸)，它相对dNTP更优选ddNTP，即该聚合酶掺入双脱氧核苷酸的能力平均提高了1,000倍。

术语“相应的天然存在的DNA聚合酶”在本领域为人熟知，指的是在大自然中存在的聚合酶，并且优选地不受实验室中体外或体内操作的改变。类似地，相应的核酸指的是编码天然存在的DNA聚合酶的核酸。这只是简单地用做比较编码这种聚合酶的修饰的核酸的基线。因此，水生栖热菌(又称“Taq”)DNA聚合酶的基线是天然编码细菌水生栖热菌中Taq DNA聚合酶的核酸。申请人提供这种聚合酶中至少一个位点，改变这个位点可以改变聚合酶掺入双脱氧核苷酸的能力。这些位点只是示例性的，并不限制本发明，因为本领域专业人员知道DNA聚合酶的能力在该性质方面可以改变得更加有用，现在又知道在这些特异位点或在其它相当的位点来改变这些酶的方法。

在本文描述的本发明实施方案中，通过替换一个或多个氨基酸来修饰DNA聚合酶。但也可以通过插入一个或多个附加的氨基酸或缺失一个或多个氨基酸来修饰。

本发明的DNA聚合酶也可经修饰去掉或改变一个外切酶结构域，例如3′-5′外切酶活性，描述见Tabor和Richardson，引文见上，或Taq中的5′-3′外切酶活性，描述见Barnes(WO 92/06188)。改变本发明中DNA聚合酶区别对待ddNTP能力的突变优选地基本不影响外切酶活性；这是指突变位于酶的聚合酶结构域，靠近聚合活性位点，不只是通过降低聚合酶以其外切酶活性去除掺入的类似物的能力而降低区别对待。本发明特别适用的DNA聚合酶是Pol I型聚合酶，描述见Braithwaite和Ito，核酸研究，21，787，1993，在此引入作为参考，并称为A家族，和聚合酶α或聚合酶II型DNA聚合酶，描述见Braithwaite和Ito，称为B家族。Braithwaite和Ito描述的其它聚合酶家族也可用于本发明。特别是申请人发现在dNTP底物结合位点附近一个位置存在一个极性含羟基的氨基酸对于聚合酶有效地掺入双脱氧核苷酸很重要。不受理论的束缚，申请人认为该发现与所期望的结果，即对于在核糖部分3′位置无羟基基团的核苷酸(即ddNTP)区别对待必须在该关键位置的氨基酸残基同时缺少羟基，正好相反。换句话说，两个羟基均不存在所产生的间隙或空间导致对类似物的区别对待。知道这一结果就拥有一种在即使亲缘关系很远的DNA聚合酶中找到关键残基的方法；在dNTP结合区域非极性残基处添加一有极性基团的残基，是降低该聚合酶区别对待ddNTP能力的有用的候选氨基酸变化。例如大鼠DNA聚合酶b(一种与A或B家族聚合酶同源性很小的DNA聚合酶)的272位苯丙氨酸，用X射线衍射研究显示与引物-模板的三级复合物中ddCTP残基3′位置相接触(Pelletier等，科学，264，189，1994)。知道了本发明描述的结果则会顺理成章地将该残基修饰成酪氨酸来筛选能更有效地掺入双脱氧核苷酸的大鼠DNA聚合酶b突变体。本领域专业人员因而可能用这里提供的信息来改变任何DNA聚合酶的区别对待表型。

本发明某些聚合酶更有效地掺入双脱氧核苷酸的能力可能是特异性的(即对双脱氧核苷酸类似物的效果比对其它类似物的效果大得多)。但某些聚合酶也可用于帮助掺入其它碱基修饰类似物(例如，脱氧肌苷三磷酸(dITP)和2′-脱氧-7-deaza鸟苷5′-三磷酸(dC7GTP)来去除电泳中的带抑制，以及荧光标记的脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸用于自动过程)。另外这种聚合酶能更有效地掺入核糖核酸，因而可以不需要启动子就合成RNA。具体来说，单亚基DNA依赖型RNA聚合酶如T7 RNA聚合酶和A家族的DNA聚合酶(Pol I型DNA聚合酶)之间的保守超二级结构(motif)提示该区域的突变(大肠杆菌DNA聚合酶I的758至767号残基)可能改变其对rNTP的特异性。这样可以设计制造出能有效地从引物起始合成的RNA聚合酶，使RNA合成不再需要启动子。类似地，这里提供的数据提示修饰T7 RNA聚合酶的631至640号残基将改变其对dNTP的特异性。这样可以设计制造出一种新的DNA聚合酶，能从启动子序列起始DNA的从头合成，而不用引物。

在优选实施方案中，修饰的DNA聚合酶有足够的DNA聚合酶活性(例如至少是用于标准测序反应的聚合酶活性，优选的至少是本领域定义的100单位每毫克酶；优选地聚合酶中突变对先前水平的改变不超过5-10倍)用于DNA测序(与DNA聚合酶活性必需的任何宿主因子合用)；并且外切酶活性足够低(例如低于500单位/毫克，见Tabor和Richardson，引文见上)使聚合酶能用于DNA测序；该DNA聚合酶在T7型DNA聚合酶(例如选自T7，T3，_I，_II H，W31，gh-1，Y，A1122，和SP6)双脱氧核苷酸结合位点具有一个或多个这样的氨基酸。优选地修饰的DNA聚合酶是对热稳定性酶如水生栖热菌，嗜热栖热菌，黄栖热菌，甾类嗜热芽孢杆菌(Bacillus sterothermophilus)和Vent细菌编码的DNA聚合酶的修饰；并通过例如只改变一个氨基酸，该聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶相比，掺入双脱氧核苷酸的能力提高至少10倍，50倍或更优选地至少100倍。

另一方面，本发明涉及一种方法，用于生产一种修饰的DNA聚合酶，它与相应的天然存在的DNA聚合酶相比掺入双脱氧核苷酸的能力更强。该方法包括提供一种编码DNA聚合酶的核酸分子，诱变或用其它方式改变核酸分子的核苷酸序列，在核苷酸碱基序列的一个或多个位点掺入一个或多个碱基变化，从而显著(即至少10倍，50倍，或更优选地100-500倍)改变该核酸编码的聚合酶掺入双脱氧核苷酸的能力。

第三方面，本发明涉及一种确定DNA分子核苷酸碱基序列的方法。该方法包括提供一种DNA分子，与能与之杂交的引物分子退火；将退火的分子在容器中温育，容器中含有至少一种脱氧核苷三磷酸，一种由天然存在的DNA聚合酶修饰得来并且与天然存在的DNA聚合酶相比掺入双脱氧核苷酸的能力增强的DNA聚合酶。(该聚合酶有足够的DNA聚合酶活性且外切酶活性足够低，可用于DNA测序。)还提供至少一种在特定核苷酸残基处终止DNA合成的DNA合成终止剂。该方法进一步包括根据大小将温育反应的DNA产物分开并且DNA分子的至少一部分核苷酸残基序列可被确定。

在优选实施方案中，DNA聚合酶是热稳定性DNA聚合酶并且测序在高于50℃，60℃或70℃的温度下进行，该DNA聚合酶来源于(即在氨基酸残基上至少50％相同)水生栖热菌，嗜热栖热菌，黄栖热菌，甾类嗜热芽孢杆菌，海滨热球菌(Thermococcus litoralis)(Vent)，强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)或硫气孔硫化叶菌(SulfolobusSolfataricus)编码的DNA聚合酶。

在另一优选实施方案中，DNA聚合酶具有每毫克聚合酶小于1000，250，100，50，10甚至2单位的外切酶活性，并且能够利用仅含4、6或10个残基的引物；而且在温育步骤开始时所有4种脱氧核苷三磷酸的浓度足以使DNA合成进行到被试剂(例如ddNTP)终止为止。        

对于循环测序，本发明的聚合酶与其它酶相比可使用测序利用量低得多的双脱氧核苷酸。即该方法涉及提供在循环测序反应中对所有4种双脱氧核苷酸都过量的脱氧核苷酸，然后进行循环测序反应。对于其它酶，有必要在该反应中添加至少一种过量的ddNTP。例如Sears等，生物技术13，626，1992描述对Vent聚合酶用对dNTP约过量10倍的ddNTP，Carothers等，生物技术7，494，1989描述对Taq聚合酶用对dNTP过量至少2倍的ddNTP。本发明不需要这种过量。优选地，对相应的ddNTP提供过量2，5甚至10倍的dNTP。在一特定实施例中对本发明的修饰Taq用低于10M的ddNTP。

在一相关方面，本发明涉及一种DNA测序用的试剂盒或溶液，它包括上述的修饰DNA聚合酶和测序必需的选自dITP，deaza GTP，链终止剂如ddNTP的试剂以及含锰的溶液或粉末。

另一方面，本发明涉及一种方法，提供一种与相应的天然存在的DNA聚合酶相比掺入双脱氧核苷酸的能力加强的修饰DNA聚合酶，其步骤包括提供编码修饰DNA聚合酶的核酸序列，在宿主细胞中表达核酸和从宿主细胞中纯化DNA聚合酶。

在另一相关方面，本发明涉及一种基本上如上述的用一种或多种(优选的是2，3或4)脱氧核苷三磷酸，一种上述的DNA聚合酶和第一种链终止剂测序一段DNA的方法。DNA聚合酶使引物延伸形成一系列区别在于延伸引物的长度的第一DNA产物，每种第一DNA产物在其延伸端有链终止试剂，而且每种第一DNA产物的分子数对于长度差别小于20个碱基的几乎所有DNA产物基本相同。该方法还在杂交的混合物中以与第一种链终止剂浓度不同的浓度加入第二链终止剂，其中DNA聚合酶生产出第二系列的差别在于延伸引物的长度的第二DNA产物，每种第二DNA产物在其延伸端有第二链终止剂。每一种第二DNA产物的分子数对于长度差别在1到20残基之间的基本上所有的第二DNA产物几乎相同，而且与跟该第二DNA产物长度差别不大于20个碱基的所有第一DNA产物分子数显著不同。

在优选实施方案中，用3或4种这样的链终止剂得到不同的产物，描述见Tabor和Richardson，引文见上；并且测序反应中有镁离子，或者有锰离子或铁离子(例如浓度在0.05至100mM之间，优选的在1到10mM之间)；在不多于4条凝胶泳道上根据分子量将DNA产物分开。

在另一相关的方面，本发明涉及一种核酸测序方法，步骤是将寡聚核苷酸引物，待测序的核酸，二到四种脱氧核苷三磷酸，一种上述聚合酶，和至少两种不同量的链终止剂，在利于寡聚核苷酸引物延伸形成与待测序的核酸互补的核酸片段的条件下混合起来。该方法进一步包括根据大小将核酸片段分开以及确定核酸序列。这些试剂根据引物延伸产物中标记物强度而相互区分。

尽管常用凝胶电泳来分开DNA测序反应的DNA产物，本领域专业人员应明了也可用其它方法。因此有可能用以下方法如飞行时间质谱，电镜方法和单分子检测方法检测每种不同的片段。

本发明还涉及一种自动DNA测序仪，它具有含有试剂的反应器并且从单一的引物和一段DNA形成至少两套DNA产物。每套中的每个DNA产物分子量不同而且在一端含有一个链终止剂。试剂包括上述的聚合酶。该仪器包括一种分离装置，沿分离器(Separator)的一条轴将DNA产物分离形成一套带。它还包括一种读带的装置，在各带沿轴分开后确定其位置和强度，以及一种计算机装置，仅根据沿轴向带的位置与强度而不根据分离装置中可能存在的任何标记物的发射光波长来确定DNA带的DNA序列。

在其它方面，本发明涉及：(a)一种将克隆的DNA片段体外诱变的方法，包括提供克隆片段和一种上述DNA聚合酶，在用片段合成一段DNA的条件下将聚合酶与克隆的片段相接触。这种条件下，通过掺入一系列能与该片段碱基配对的单个相邻的碱基和一个不能与该片段碱基配对的核苷酸碱基形成一段DNA；(b)一种将模板DNA片段体外诱变的方法，包括提供引物和模板，引物具有能与模板上相邻的碱基残基配对的毗连碱基和至少一个不能与模板碱基配对的碱基。该方法涉及用一种上述DNA聚合酶将引物延伸；(c)一种从5′端有单链区的线性DNA分子制造平末端双链DNA的方法。该分子的3′端为双链，没有3′突出末端。该方法包括将该DNA分子与一种上述DNA聚合酶温育，该DNA聚合酶作用于单链区域产生平末端双链DNA分子；(d)一种标记DNA片段3′端的方法，包括将该DNA片段与一种上述DNA聚合酶，一种标记的脱氧核苷酸在DNA片段3′端被聚合酶延伸的条件下温育，从而将标记的脱氧核苷酸加到DNA片段上实现标记；(e)一种扩增DNA序列的方法，包括将第一和第二引物退火到双链DNA序列上相对的链上，将退火的混合物与一种上述DNA聚合酶温育。第一和第二引物退火到DNA序列的相对两条链上，退火后其3′端互对，待扩增的DNA序列位于两段退火的引物之间。

在另一些方面，本发明还涉及特定的DNA聚合酶，如第667位残基为酪氨酸的水生栖热菌DNA聚合酶，第762位残基为酪氨酸的大肠杆菌DNA聚合酶I，以及在与大肠杆菌DNA聚合酶762位残基同源的位置有酪氨酸残基的任一种Pol I型DNA聚合酶，例如在氨基酸序列KN₁ N₂ N₃ N₄ N₅ N₆ N₇ Y G的N₄位置，其中每个N可为任一种氨基酸。另外，本发明描述DNA聚合酶α家族的具有K N₁ N₂ N₃ N₄ N₅ N₆ N₇ G/Q序列的特定聚合酶，其中每个N可为任一种氨基酸，并且N₁到N₇残基中有一个经突变得到一个聚合酶，它对ddNTP的区别对待降低(优选地比非突变序列降低至少20倍)。本发明还描述编码任一种这样的DNA聚合酶的核酸。

在相关的方面，本发明涉及非逆转录酶的DNA聚合酶，它在仅有镁作为二价阳离子存在时平均持续合成能力(processivity)小于100并且掺入ddNMP比掺入dNMP的区别对待程度小于100倍，或是在二价阳离子仅有镁存在时平均持续合成能力小于50并且掺入ddNMP比掺入dNMP的区别对待程度小于50倍或5倍。本领域专业人员应当明了持续合成能力可用任何标准操作方法来测量，这些方法将会显示T7 DNA聚合酶的平均持续合成能力至少为500，Klenow片段的约为4-40，逆转录酶的约为150-200。可根据Tabor等，生物化学杂志262：16212，1987的描述进行这种测量，该描述在此引入作为参考。在这种条件下预计Taq DNA聚合酶的平均持续合成能力小于100。

在特别优选的方面，本发明描述嗜热DNA聚合酶，它当镁存在时对ddNMP的区别对待程度与dNMP相比小100倍，并且优选地平均持续合成能力小于100，每秒甚至每10秒钟从一轮引物-模板到另一轮引物-模板循环多于一次。可用标准操作方法测量这种循环。

本发明还描述一种用上述DNA聚合酶循环测序的方法，还描述细胞内(与病毒或线粒体的相对照)DNA聚合酶，它在某一位置没有天然存在的氨基酸而是有一个酪氨酸，从而使该聚合酶对ddNMP的区别对待程度比dNMP小50倍。    

另一些方面，在所述位点作氨基酸替换会造成相应天然聚合酶其它性质的改变。另外本发明的聚合酶在此处描述的各种方法中可以与其它聚合酶合起来用，从而在混合物中利用每种聚合酶的优秀性质。

从下述优选实施方案描述及权利要求中可明显看出本发明的其它特征与优点。优选实施方案描述

首先简述附图。附图

图1是噬菌体T7的基因5编码的DNA聚合酶氨基酸序列的图示，指出了手掌和手指结构域以及各种双脱氧抗性(DR)突变体的位置，标记为A-E的区域的位置以及涉及ddNTP区别对待的一个位点的位置；

图2是DNA聚合酶I结构的三维图示，显示了A-E区的位置；

图3是pol I型DNA聚合酶核酸选择性(riboselectivity)区域的图示，各氨基酸由通用的单字母代码标出。起始氨基酸标号在图左标出，与脱氧核苷酸相比对双脱氧核苷酸区别对待的程度数值在图右标出；

图4，5，6是分别显示大肠杆菌DNA聚合酶I，T7 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的核酸选择性区域修饰的图示。脱氧抗性突变体

下面是相关文献简述。各文献均非后面的权利要求的现有技术，而仅供帮助对本发明的理解。

Reha-Krantz等在1989年9月24-29日北卡罗来纳州Beaufort召开的题为“DNA合成的确限度：结构与机理观点”的大会上发表的供海报用的提要中《噬菌体T4 DNA聚合酶的诱变分析》一文描述了C末端突变体，能增加对ddNTP的使用。但Reha-Krantz等，病毒学杂志67，60-66(1993)指出虽然突变体L412M与野生型T4 DNA聚合酶相比对ddGTP的Ki低50倍，但在突变体和野生型T4 DNA聚合酶之间未发现其掺入ddGTP的效率有何区别。在63页，文中说：“尽管L412MDNA聚合酶对ddGTP敏感，未发现野生型和L412M DNA聚合酶掺入ddNTP时有何区别。”文中又说“看起来没有任何单一的区域是PPi或核苷酸的唯一结合位点。”另外Reha-Krantz和Nonay，生物化学杂志269，5635-5643(1994)提供了关于突变体L412M和其它突变体T4 DNA聚合酶的研究。    

Gibbs等，美国国家科学院院刊85，6672-6676(1988)和Larder等，EMBO杂志6，169-1975(1987)描述了疱疹DNA聚合酶中对一些核苷酸类似物：焦磷酸，膦酰乙酸，膦酰甲酸，无环鸟苷，vidarabine，9-(1，3-二羟-2-丙氧(甲基)鸟嘌呤(ganciclovir)和溴乙烯脱氧尿苷筛选抗性得到的一系列突变。该文显示许多对一种药物有抗性的突变体对其它药物也有抗性，虽然这些药物是底物不同区域的类似物。

Derse等，生物化学杂志257，10251-10260(1982)描述通过筛选在膦酰甲酸(一种焦磷酸抑制物)存在下的生长分离到单纯疱疹DNA聚合酶中5类突变体。对每类突变体，他们比较了其对ddGTP的抗性(10256页，表III)。所有突变体对ddGTP的Ki都增大了20到100倍。

Prasad等，美国国家科学院院刊88，11363-11367(1991)用直接筛选策略显示HIV逆转录酶中单个突变(Glu 89突变成甘氨酸)使聚合酶对ddGTP抗性更强(需要多10倍的ddGTP才能得到同样程度的抑制)。该突变对许多类似物，包括膦酰甲酸(一种焦磷酸类似物)有广泛抗性。虽然该突变体对ddTTP，ddCTP和ddGTP抗性相似，但对ddATP抗性小得多。

Song等，病毒学杂志66，7568-7571(1992)将人免疫缺陷病毒I型逆转录酶的glu-89诱变成9种不同的氨基酸残基，并测量每种突变体酶对ddGTP和膦酰甲酸，一种焦磷酸类似物的抗性。突变合成两类；用丙氨酸，缬氨酸或苏氨酸替换Glu-89得到对ddGTP和膦酰甲酸抗性与野生型酶相比高得多的酶，而突变成丝氨酸，谷酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸和赖氨酸得到的酶对ddGTP抗性小或没有抗性。没有突变使酶与野生型酶相比对ddGTP的抗性降低(表I，7569页)。作者根据他们的结果和逆转录酶的晶体结构推测逆转录酶的第89和90个残基构成dNTP结合口袋的一部分。

具有在导致ddNTP选择性的突变附近的突变的大肠杆菌DNA聚合酶I突变体蛋白性质的有关文献如下：

Carroll等，生化30，804-813(1991)研究两种突变体：Tyr 766 Ser和Tyr 766 Phe对正常脱氧核苷酸的错误掺入。Polesky等，生物化学杂志265，14579-14591(1990)对具有两种不同特性的突变确定了性质：(1)酪氨酸766，精氨酸841，和天冬酰胺845；作者提示这些残基接触进入的dNTP。(2)谷酰胺849，精氨酸668和天冬氨酸882，作者提示它们参与催化。Polesky等，生物化学杂志267：8417(1992)进一步对精氨酸668，谷酰胺849和天冬氨酸882的突变，以及天冬氨酸705和谷氨酸710的突变确定了性质。本研究中作者观察了α-硫取代的dNTP即磷酸部分的类似物的掺入。Pandey等，生物化学杂志269，13259-13265(1994)观察了大肠杆菌聚合酶I的两个突变体，它们分别把赖氨酸758变成丙氨酸和精氨酸。作者们指出Basu等，生化26，1704-1709(1987)提示用一个赖氨酸758参与dNTP结合。这是用化学方法给出的；用吡哆醛5′-磷酸一种核酸类似物，共价修饰DNA聚合酶I，据说赖氨酸758是被修饰的残基。

Beese等，生化321：14095-14101(1993)描述了DNA聚合酶I与dNTP或与焦磷酸的复合物的共晶结构。作者们宣称dNTP结合处靠近螺旋O。作者们作了下列陈述：(a)“在Mg-dCTP复合物中，胞苷与His 881相互作用，而糖与Phe 764相互作用(Sic.762)(图3和5)。”(b)“但是，我们的结论是至少二级复合物中dNTP的dNMP部分不大可能与其跟引物-模板DNA形成的催化相关复合物中位置相同。”(c)“由于dNTP的残基的整个结合位点是由其模板链Watson-Crick氢链和其在引物链3′残基上的堆积形成的，故而二级复合物中残基的结合位点不大可能完全随机，与我们的观察相一致，根据条件它可以结合上几个位置。”(d)“在二级复合体晶体中观察到的dNTP结合位点与在溶液中的研究观察到的相同。不过从该二级复合物外推出当引物和模板DNA存在时的与dNTP形成的复合物模型要谨慎从事。我们假定dNTP的糖和残基部分需要引物-模板DNA才能以正确的构象结合。”

Joyce和Steitz，生化年度综述(Ann.Rev.Bioc.)63，777，1994(不作为本发明的现有技术(prior art))讨论了多种DNA和RNA聚合酶的相互关系。它显示DNA聚合酶I的“手掌”亚结构域(而非“手指”)有3个功能：即催化中心，引物3′末端的结合位点和dNTP结合位点。在HIV-1逆转录酶中显示影响DNA聚合酶抑制物结合的突变在67-70号残基附近。文中还宣称“虽然从核苷糖基的位置不能得出有用的结论，但有可能晶体的二级复合物提供信息能确定Klenow片段与dNTP磷酸基团的接触。在前面一段里，该文宣称“虽然能形成聚合酶-dNTP二级复合物，但这样的复合物没有催化能力。”该文进一步指出数据“表明脱氧核糖靠近Phe 782”以及“位于按模型构造的模板链的附近手指结构域中的Tyr 766[位于Klenow片段螺旋O]的突变影响对脱氧和双脱氧核苷酸底物的区别…”不过该文又宣称：“在Klenow片段中，已发现影响dNTP在三级复合物中结合的突变(反映在Km(dNTP)位于靠近手指亚结构域或其中的聚合酶裂隙的一例。如此鉴定出的位置包括了螺旋O的N末端(Arg 841和Asn 845)，O螺旋的暴露面(Tyr 766，Phe 762和Arg 754)及靠近催化中心的邻近残基(Asp 705和Glu 710)…动力学方法的一个优点是能研究三级结构，但如上述，在没有其它结构证据时不可能将直接效应与模板相互作用介导的效应分开来。而且上面列出的侧链包涵的区域比dNTP分子大得多，因而不能全与之直接相互作用。因于据认为这些研究涉及的Klenow片段区域与模板链广泛接触，合理的解释是上述残基的一部分与dNTP直接接触，而其它与模板DNA结合。”

Pelletier等，科学264，1891和Sawaya等，科学264，1930，1994(不作为后面的权利要求的现有技术)与之相反，提出Polβ的M-N螺旋(与Klenow的J-K螺旋类似)中271-273号残基“执行普通的功能，核苷酸的区别对待”。

Sousa等，364自然593，1993(不作为后面的权利要求的现有技术)描述了T7 DNA聚合酶的三维结构及其与大肠杆菌DNA聚合酶I的同源性。它们宣称他们的观察结果提示：“KF[Klenow片段]的C末端元件(b链14[916至928号残基]和C末端)在聚合过程中接触dNTP的脱氧核糖部分以区分rNTP和dNTP底物。”

双脱氧核苷如双脱氧胸苷是T7噬菌体生长的强力抑制物。实验显示DNA合成的抑制是双脱氧核苷酸掺入T7 DNA的结果。双脱氧核苷对未受感染的大肠杆菌无抑制作用。我们尚不能解释为什么对大肠杆菌DNA合成不抑制，但有可能是细胞摄取，大肠杆菌DNA聚合酶III对其掺入的高水平排斥，三磷酸的磷酸化不是或有效的消除。无论哪种情况我们都发现能在含双脱氧核苷的琼脂平板上得到正常噬菌斑的T7突变体噬菌体的发生频率约为10^-3。图1给出许多这样的突变的位置。它们位于基因5的蛋白上。突变体基因5的蛋白比天然基因5蛋白的对ddNTP区别对待的程度更大(几倍)。这类突变体的某些成员可能描画出聚合酶中对识别dNTP的核糖部分重要的区域。    

必须注意用双脱氧核苷以该筛选方法得到的突变是基于基因5蛋白识别部分区域的改变。但不可能这些突变对其它核苷酸类似物也有显著效应。另外也可能用相同的操作方法，以噬菌体在其它类似物存在时的生长为基础，筛选对其它核苷酸类似物强烈地区别对待的其它T7突变体。

参照表I，对各种DR突变体指出的表中提到的氨基酸替换的性质进一步在表的右手端标出。图1给出T7 DNA聚合酶整个手掌和手指区域的这些突变体的位置。大拇指区域是与产物双螺旋DNA水沟相互作用的柔性区域；手掌区域是催化中心，引物3′端的结合位点，对dNTP结合有贡献；四指区域与单链模板靠近合成的位点处相互作用，对dNTP结合有贡献。这些突变体在聚合酶上分布分散，各自对双脱氧核苷酸掺入的影响相对较小，仅使掺入双脱氧核苷酸的能力降低5-20倍。另外有些突变体位于跟DNA聚合酶I相对来说之同源性的区域。因此它们不能提示其它Pol I酶参于ddNTP区别对待的位点的位置。

                        表1

T7 DNA聚合酶双脱氧抗性突变体一览

突变体    分离物数目    修饰

  DR1          1        Ala 425 Thr斥水极性

  DR2          1        Phe 434 Ser斥水极性

                        Gly 442 Ser斥水极性

  DR3          1        Val 443 Ile斥水 斥水

  DR4          2        Arg 444 His强碱性 弱碱性

  DR5          1        Arg 444 Cys强碱性 中性，极性

  DR6          8        Ser 477 Phe极性 斥水

  DR7          4        Asp 504 Asn碱性 中性

  DR8          2        Ala 513 Thr斥水 极性

  DR9          2        Thr 517 Ile极性 斥水

  DR10         1        Ala 532 Ser斥水 极性

  DR11         1        Arg 566 Cys强碱性 中性，极性

  DR12         1        Ala 619 Thr斥水 极性

  DR13         3        Ala 700 Thr斥水 极性总结

  7    斥水 极性

  3    强碱 性中性，极性或弱碱性

  2    极性 斥水

  1    斥水 斥水体外诱变

T7的克隆基因5的体外诱变用于构建基因5蛋白，其中大肠杆菌DNA聚合酶I中不同区域被T7基因5蛋白中类似区域或同源区域所取代。如讨论，我们特别感兴趣的是确定这些酶掺入核苷酸类似物的能力以及它们对这些类似物区别对待的程度。参照图2，T7 DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I杂交的区域标成区域A-E。

参照图3，申请人已确定C区域是提供了核糖选择性的区域，其效应比聚合酶中其它区域的效应大得多。某些其它区域在图3中特意标出。

参照图4-6(和表2)，已确定将该区域的氨基酸替换可实现大肠杆菌DNA pol I型聚合酶核糖选择性向T7 DNA聚合酶型核糖选择性或相反的转变。因此通过将pol I型聚合酶该区域定向诱变可显著改变聚合酶的核糖选择性。效应的水平至少是50-100倍，通常大于500倍。DNA聚合酶

用于本发明的DNA聚合酶包括属于：“pol I型DNA聚合酶”的一类同源聚合酶如T7型DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段和Taq聚合酶。

用于本发明的DNA聚合酶包括一类同源聚合酶如T7型DNA聚合酶(如T7，T3，_I，_II，H W31，gh-1，Y，A1122或SP6)。同源聚合酶指的是如Delarue等，蛋白工程3，461-467(1990)描述的具有Pol I家族DNA聚合酶排列的酶。它还具有(见后)

                      表2

大肠杆菌DNA聚合酶I，T7 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶O螺旋中结构域互换对ddNTP区别对待的效果。上端给出三种聚合酶的序列，指出了第一个残基的位置。在3种聚合酶的一致序列下给出在T7DNA聚合酶(T7)，大肠杆菌DNA聚合酶(Pol)和Taq DNA聚合酶(Taq)中鉴定到的突变体，突变的残基有下划线。如实施例2描述对每个突变体用SDS活性凝胶分析法检查其掺入ddNMP比掺入dNMP的相对速率，并标在右边。突变体T7C-T8，Pol IC-K6和TaqC-Q5同野生型蛋白一道纯化，用于进一步分析。   ddNTP

酶                        序列                    区别对待Pol I          754  R R S A K A I N F G L I Y G          高Taq            658  R R A A K T I N F G V L Y G          高T7             517  R D N A K T F I Y G F L Y G          低

  一致          R     A K         G     Y GT7WT                R D N A K T F I Y G F L Y G          低T7C-T2              R R S A K A I N F G L I Y G          高T7C-T3              R R S A K T F I Y G F L Y G          低T7C-T4              R D N A K A I N F G F L Y G          高T7C-T5              R D N A K A I I Y G F L Y G          低T7C-T6              R D N A K T F N F G F L Y G          高T7C-T7              R D N A K T F N Y G F L Y G          低T7C-T8              R D N A K T F I F G F L Y G          高Pol I WT            R R S A K A I N F G L I Y G          高Pol IC-K1           R D N A K T F I Y G F L Y G          低Pol IC-K2           R R S A K T F I Y G L I Y G          低Pol IC-K3           R R S A K T F N F G L I Y G          高Pol IC-K4           R R S A K A I I Y G L I Y G          低Pol IC-K5           R R S A K A I I F G L I Y G          高Pol IC-K6           R R S A K A I N Y G L I Y G    低Taq WT              R R A A K T I N F G V L Y G    高Taq C-Q1            R D N A K T I N F G V L Y G    高Taq C-Q2            R R A A K T F I Y G F L Y G    低Taq C-Q3            R R A A K T I I Y G V L Y G    低Taq C-Q4            R R A A K T I I F G V L Y G    高Taq C-Q5            R R A A K T I N Y G V L Y G    低特异性残基6个聚合酶家族：Pol I，Polα和Polβ家族的DNA聚合酶，DNA依赖性RNA聚合酶，反转录酶和RNA依赖性RNA聚合酶的保守序列超二级结构；其结果显示所有聚合酶之间有一些残基是保守的。根据其排列(图3，463页)，此处鉴定的选择性残基(大肠杆菌DNA聚合酶I的762号苯丙氨酸)位于“B超二级结构”。除了polI家族的DNA聚合酶，B超二级结构还见于polα家族的DNA聚合酶以及T7家族的DNA依赖性RNA聚合酶；因此该排列强烈提示了在其它聚合酶家族中，包括74 DNA聚合酶，疱疹DNA聚合酶，_29 DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶中应当诱变的残基。

另外Joyce，结构生物学当前观点1,123-129(1991)比较了许多聚合酶的DNA序列，提示少量重要的活性位点残基是保守的。特别地讨论了polI家族(T7，polI，Taq)和polα家族(T4，_29，疱疹)的聚合酶的相似性。在图1(124页)中Joyce指出发现于这两个家族中5个不变残残基的位置，这包括赖氨酸758，酪氨酸766和甘氨酸767；它们都十分接近这里鉴别的选择性残基，苯丙氨酸762。

这些聚合酶用于DNA测序反应，反应条件设计得使测序反应的DNA产物在胶上相邻带强度几乎一致(强度差别1.5至2.0倍)。相邻指分子量相差约6000，即20个残基的DNA产物的带。该强度的实际值会沿胶递减，描述见Tabor和Richardson，引文见上。带强度反映一条带中DNA产物的数目。用标记物如荧光生色团或放射性同位素产生可以方便地检测的带，其强度反应DNA产物的数目。因此在本发明中得自一个测序反应具有一种链终止剂的相邻带有大致相同数目的DNA产物数目，因而有均一的带强度。测序条件包括聚合酶温育时存在特定的二价或三价阳离子如锰(II和III)离子，铁离子和亚铁离子；效应检测不出来或者对DNA合成有害的单价或二价阳离子包括：K，Na，Ba，Be，Ca，Cc，Cr，Co，Cu，Ni，Si和Zn。阴离子不重要，例如氯离子，乙酸根和硫酸根均适用。本发明在这些条件下酶对链终止剂如双脱氧核苷酸的需求可以小几倍。溶液中已可以有螯合剂来帮助调节可用的二价金属离子的浓度。例如可用柠檬酸或异柠檬酸。这些螯合物能将例如游离锰离子的水平在相对广泛范围的锰离子浓度下维持在10到100μM之间。即螯合剂作缓冲物用。

本发明的DNA聚合酶在DNA模板的全长对双脱氧核苷酸类似物和脱氧核苷酸区别并不显著。即这些聚合酶对含3′羟基的核苷酸和不含3′羟基的核苷酸(即在核糖的3′位置含有两个氢)区别并不显著。但是即使有锰或铁存在这些聚合酶也可能对核苷酸其它位置的修饰区别对待程度很大。例如与脱氧核苷酸相比这些聚合酶可能对某些连上荧光基团的双脱氧核苷酸类似物区别对待。但是这些聚合酶不会因为双脱氧核苷酸是否存在修饰而对相邻或附近的核苷酸区别对待程度有所不同。因此，虽然这些聚合酶对这些类似物强烈地区别对待，与未修饰的双脱氧核苷酸相比在DNA测序反应中需要更高浓度的类似物，但其附近的带的强度仍然均一。

因此，本发明的聚合酶虽然对掺入链终止剂整体上区别对待，但掺入的效率仍然均一。另外本发明的其它聚合酶比相应的天然存在的酶能得到更均一的含荧光ddNTP的带，尽管不比未标记的或用放射性标记的ddNTP带均一。

本发明用的链终止剂包括具有2′，3′-双脱氧结构的双脱氧核苷酸。用于本发明的其它试剂是能在特定碱基特异性终止DNA测序反应，并且在上述条件下不被聚合酶区别对待的试剂。

为了确定是否任一特定的DNA聚合酶与任一特定的链终止剂或其它测序反应混合物组分组合起来可用于本发明，根据Tabor和Richardson，引述见上的描述进行了标准测序反应，并且对带形成的程度和测序胶中附近带的均一性作了考察。如果聚合酶反应不能将引物至少延伸20个碱基，则不适用于所用的条件。相邻带均一性在2倍以内范围可用于本发明，优选的均一性在1.0-1.5倍范围。相似地用该测序反应在不同条件下进行，确定最优阳离子浓度或其它可用于测序反应的阳离子。例如阳离子的检测范围是0.005-100mM。这种实验的一个例子如下：

测量任一种酶掺入一特定ddNMP相比于相应dNMP的能力时用能使DNA合成终止于一个固定范围的ddNTP与dNTP的比值，检测时即产生不超过某一固定分子量的带的ddNTP与dNTP比值。也就是说，反应产生的带在测序胶上终止于一个特定范围。因此，若相对于另一种酶，某酶对给定ddNTP的区别对待程度要大1000倍，就必须1000倍高的ddNTP与dNTP的比值才能得到终止于凝胶相同范围内对应位点的带。外切核酸酶活性

本发明的DNA聚合酶具有正常或天然相关外切核酸酶水平(每聚合酶分子的活性量)的优选不足50％，优选的不足1％，最优选的不足0.1％。正常或天然相关水平指例如未修饰的T7型聚合酶的外切核酸酶活性。用下述Chase等(249，生物化学杂志4545，1974)的操作方法的一种修饰法来测量，正常的相关活性为每毫克聚合酶约5,000单位的外切核酸酶活性。外切核酸酶通过切除与模板不正确配对的新合成碱基而增大了DNA合成的确限度。这种相关外切核酸酶活性对DNA测序反应的质量有损。它们升高了必须加到反应中的核苷酸前体的最低需要浓度，因为若核苷酸浓度降低，聚合酶活性降到与外切核酸酶活性相当，得不到DNA净合成，甚至合成的DNA降解。

更重要的是，相关的外切核酸酶活性可能使DNA聚合酶在模板上有二级结构障碍处停滞不前。当聚合酶达到该结构处试图越过时其合成速率降低。聚合酶停滞时相关的外切核酸酶会切除新合成的DNA，后果是发生许多轮的合成与切除。结果可能是聚合酶最终合成通过了发夹结构(对测序反应的质量无损)；或是聚合酶从合成链上解离(在所有4个测序反应的同一位置得到一伪迹条带)；或是链终止剂以高频率掺入，在凝胶上得到的不同带强度差别很大。发生这种情况是因为在任何位点若聚合酶掺入链终止核苷酸的机会变大，则链终止剂的掺入频率也变大。

理想的测序反应产生的片段应在胶上给出强度均一的带。这对于每个放射性片段都使X光底片最优曝光至关重要。如果放射性带强度不同，则弱的带会检测不到。为了使所有片段得到均一的放射性强度，DNA聚合酶应当在DNA每一个位置耗费相等的时间，在任何位点应即不倾向于添加，也不倾向于去除核苷酸。如果DNA聚合酶不含任何相关的外切酶就是这样，因为在模板上每一个位置它将只有一次机会掺入链终止核苷酸。短引物

本发明的DNA聚合酶优选地能够利用10个残基或更短的引物，以及长引物，最优选的引物为4-20个残基，例如6个残基(可以3个为一组形成18聚体的等效物)。能利用短引物会给DNA测序带来许多重要的优点。短引物比常用的17聚体引物便宜且更易于合成。它在DNA模板上互补位点退火更快，因而使测序反应更快。进一步，能利用小的(例如6或7个残基)寡聚核苷酸引物来DNA测序就可用原本不可能的策略来对长DNA片段测序。例如可生成含80-4000个随机六聚体的试剂盒，任何一个都不和克隆载体上任意位点互补。统计来说，沿待测序的DNA片段平均每50个残基就会出现80个六聚体序列中的一个。确定3,000残基的序列仅需5个测序循环。首先，用1个“普适”引物(例如新英格兰生物实验室#1211，序列5′GTAAAACGAACGGCCAGT3′)对插入序列一端的约600个残基测序。用该测序反应的结果，从试剂盒中挑出一个与已确定序列末端附近一个区域同源的新引物。第二轮用这个引物确定下600个残基的序列。重复该过程5次会确定整个3000个残基的完整序列，不需任何亚克隆，不需化学合成任何新的寡聚核苷酸引物。在测序反应中包括T7的基因25蛋白和基因4蛋白可以更好地应用这些短引物。体外诱变

用标准PCR方法进行聚合酶基因的诱变(见下)。对ddNTP区别对待

存在唯一的二价阳离子镁时，T7 DNA聚合酶对ddNTP区别对待约3-4倍，比任何其它已知聚合酶都小。与之相近的是逆转录酶，它对ddTNP区别对待约10-50倍(比T7 DNA聚合酶大3-10倍)。除此二者外，文献中已知性质的所有其它DNA聚合酶对ddNTP区别对待至少100倍，经常是10,000倍或更多。

锰存在时T7 DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I的区别对待降低；T7 DNA聚合酶从3.7降至1，大肠杆菌DNA聚合酶I从550降到3.9(对于ddATP)。申请人首先提供一种DNA聚合酶，当二价阳离子仅有镁离子存在时持续合成能力小于100(定义为从引物-模板上解离下来之前从给定引物延伸的平均长度)按此定义逆转录酶的持续合成能力为约150-200，T7 DNA聚合酶的持续合成能力比这大。并且对ddNMP掺入的区别对待小于100倍。与之对照，大多数已知的DNA聚合酶如Taq，持续合成能力小于100，对ddNMP掺入的区别对待大于100倍。

以前认为高持续合成能力的聚合酶如T7 DNA合成酶结合引物-模板高大几分钟，低持续合成能力的聚合酶如大肠杆菌DNA聚合酶I从一个引物-模板到另一个几秒钟一轮(或频率还要大100多倍)。见例如Tabor等，生物化学杂志262，16212-16223(1987)。虽然持续合成能力对DNA测序有利，因为这能降低由于不是因双脱氧掺入而终止所造成的背景，但循环时间长并非优点。例如，如果聚合酶真的在特定序列解离，则除非存在过量很多的聚合酶，测序胶上会出现强的伪迹带。另一方面若聚合酶循环快，聚合酶用得就会少得多，因为一个酶分子在测序反应过程中，就会延伸许多不同的引物，并且任一给定引物端都有机会被许多不同聚合酶分子延伸，从而减少发生强的特定终止的机会。

但更好的是循环快的聚合酶也能有效地掺入ddNMP，以得到均一强度的带并且少用ddNMP。更加优选的是这样的聚合酶外切核酸酶活性低或没有，并且加入焦磷酸酶通过焦磷酸水解阻止带的降解。

还优选地能以镁作唯一的二价阳离子(即无锰)进行DNA测序反应。首先，聚合酶与锰比聚合酶与镁活性低(见例如Tabor和Richardson美国国家科学院院刊86，4076-4080(1989))。第二，聚合酶在大范围的镁浓度菌倾向于有活性，而大多数情况下要得到最优活性，最优锰浓度范围窄且浓度低(同前)。并且在最优锰浓度处，降低对ddNTP区别对待程度的效果地高浓度锰处低得多而高浓度锰处聚合酶活性又低。第三，锰用作试剂盒中的金属离子不太方便；它容易形成沉淀，特别是当pH高时。第四，还不清楚锰是否对任何嗜热性聚合酶都作为一种有效降低对ddNTP区别对待程度的金属离子(例如在高温下)。

在本发明之前，我们宣称(Tabor和Richardson美国国家科学院院刊，86，4076-4086(19889))区别对待与持续合成能力相关联：

“DNA聚合酶I持续合成能力低，掺入少于10个核苷酸后就解离。

无ddNTP时DNA合成过程中酶从一个位点解离的频率与该位点处

对ddNMP掺入的区别对待程度有很强的相关性(未发表的结果)。这

提示DNA聚合酶I在持续合成时以相似的速率掺入ddNMP和

dNMP；但当合成非持续时，相对于ddNMP更倾向于掺入dNMP。

该模型可解释为什么与T7 DNA聚合酶相比DNA聚合酶插入

ddNMP的可变性大，因为前者的持续合成能力比后者大两个数量

级。”[引用文献从略。]因此本发明对大肠杆菌DNA聚合酶I和Taq

DNA聚合酶的结果令人吃惊，因为我们未发现证据表明此处描述的

突变体使突变体酶的持续合成能力增加。嗜热性聚合酶

对ddNTP区别对待小于100倍的嗜热性聚合酶在本发明中尤其有用。另外当二价阳离子仅有镁存在时对ddNMP区别对待小于100倍且从一个引物-模板循环到另一引物-模板每秒钟不止一次的嗜热性聚合酶也很有用。嗜热性聚合酶定义为在15分钟的反应中在高于60℃的温度获得最优DNA聚合酶活性的聚合酶。均一的带强度

虽然锰将Klenow片段对ddATP的区别对待从550倍降到3.9倍，Tabor和Richardson(美国国家科学院院刊86，4076-4080(1989))显示各带之间强度相差仍很大(见图2，同上)。因此，除了T7 DNA聚合酶，本发明第一个提供了能与Klenow片段循环得一样快的聚合酶以及来源于嗜热性生物并且在二价离子仅有镁存在的适于大多数聚合酶活性的条件(见上)下能得到均一强度条带的聚合酶。用下述本领域已知方法可以确定循环快的酶。特定的聚合酶

从上述资料有可能方便地得到具有上述所需性质的聚合酶。如果外切核酸酶水平足够低且聚合酶活性足够(二者在本领域广为人知)则每种这样的聚合酶均可用于测序操作。各氨基酸位点参见Braithwaite和Ito，引文见上。1.PolI家族

大肠杆菌DNA聚合酶I，Phe 762改变(改变指用例如酪氨酸或相当的氨基酸替换得到不区别的特征)。

肺炎链球菌DNA聚合酶I，Phe 711改变。

水生栖热菌DNA聚合酶I，Phe 667改变。

黄栖热菌DNA聚合酶I，Phe 666改变。

噬菌体T5 DNA聚合酶，Phe 570改变。

噬菌体Spo1 DNA聚合酶，Leu 526改变。

噬菌体Spo2 DNA聚合酶，Phe 690改变。

线粒体DNA聚合酶，带有天然的Tyr 753或在此位点改变但不降低不区别对待的活性。这样的聚合酶以前没有用于DNA测序。申请人认为由于其预计的ddNTP区别对待水平低，它将可以用于这样的操作。需要的话可将其修饰以降低与聚合酶活性相关的外切核酸酶活性。2.聚合酶α家族(又称为聚合酶II家族)

Delarue等，蛋白工程3，461-467(1990)两个聚合酶家族(聚合酶I家族和聚合酶α家族)有三个公共的超二级结构(motifs)。称为“B超二级结构”的区域含有经我们鉴定对双脱氧核糖部分有特异性的残基。在聚合酶I家族中该区域特征是有序列KN₁ N₂ N₃ N₄ N₅ N₆ N₇ Y G，其中N₄是特异性残基：若N₄是苯丙氨酸，则区别对待程度高，若N₄是酪氨酸，则区别对待程度低。在聚合酶α家族中，该序列为KN₁ N₂ N₃ N₄ N₅ N₆ YG(在保守残基之间少一个残基)。我们根据聚合酶I型酶推测，该超二级结构中残的变化(在赖氨酸(K)和酪氨酸(Y)之间)将会降低这些聚合酶对ddNTP的区别对待程度。这些残基有：大肠杆菌DNA聚合酶II                    Ile494-Phe499PRD1 DNA聚合酶                         Leu341-Ser346_29 DNA聚合酶                         Leu384-Leu389M2 DNA聚合酶                           Leu381-Leu386T4 DNA聚合酶                           Ile558-Leu563海滨热球菌(Vent)DNA聚合酶              Leu492-Tyr497强烈火球菌DNA聚合酶                    Leu489-Phe494硫气孔硫化叶菌DNA聚合酶                Val604-Thr609人DNA聚合酶α                                                      Leu951-His956酿酒酵母DNA聚合酶I(α)                 Leu945-His950粟酒裂殖酵母DNA聚合酶I(α)             Leu931-His936黑腹果蝇DNA聚合酶α                                          Leu960-His965布鲁氏锥虫DNA聚合酶α                                      Leu845-His850人DNA聚合酶δ                                                     Val695-Val700牛DNA聚合酶δ                                                     Val694-Val699酿酒酵母DNA聚合酶II(δ)                Ile702-Val707粟酒裂殖酵母DNA聚合酶III(δ)           Val681-Val686Plasmodium falciparum DNA聚合物δ              Ile692-Val697酿酒酵母DNA聚合酶II(ε)              Val82-Phe830酿酒酵母DNA聚合酶Rev3                Leu1087-Thr1092疱疹单倍体病毒1型DNA聚合酶           Val812-Val817马疱疹病毒1型DNA聚合酶               Val813-Val818Varicella-Zoster病毒DNA聚合酶        Val776-Val781Epstein-Barr病毒DNA聚合酶            Cys682-Val687疱疹病毒Saimiri DNA聚合酶            Val671-Val676人细胞肥大病毒DNA聚合酶              Val811-Phe816鼠细胞胞大病毒DNA聚合酶              Val717-Phe722人疱疹病毒6型DNA聚合酶               Ile667-Val672Channel Catfish病毒DNA聚合酶         Ile750-His755小球藻病毒DNA聚合酶                  Ile586-Val591鸡天花病毒DNA聚合酶                  Ile648-Val653牛痘病毒DNA聚合酶                    Ile637-Val642biennis卷蛾DNA聚合酶                 Ile669-Leu674苜蓿银纹夜蛾核多面体病毒             Arg606-Ile611(AcMNPV)DNA聚合酶舞毒蛾核多面体病毒DNA聚合酶          Arg624-Ile629腺病毒-2 DNA聚合酶                   Leu696-Leu701腺病毒-7 DNA聚合酶                   Leu762-Leu767腺病毒-12 DNA聚合酶                  Leu694-Leu699S-1玉米DNA聚合酶                     Leu6l8-Leu623Kalilo中间型链孢霉DNA聚合酶          Leu776-Leu777pAI2弹囊菌immersus DNA聚合酶         Leu951-Leu956pCLK1紫瘢麦角菌DNA聚合酶             Leu831-Leu836Maranhar粗糙链孢霉DNA聚合酶          Leu752-Leu757pEM肥大蘑菇DNA聚合酶                 Leu573-Leu578pGKL1乳酸克鲁维霉菌DNA聚合酶         Ile785-Leu790PGKL2乳酸克鲁维霉菌DNA聚合酶         Ile770-Gly776pSKL克鲁维氏酵母DNA聚合酶            Ile775-Gly781实施例下列是确定各种聚合酶的持续合成能力和循环时间的方法的实施例，还提供了确定聚合酶区别对待水平的实施例及其它用于本发明的方法。实施例1 DNA聚合酶基因的诱变和突变体

DNA聚合酶的过量生产

用标准技术克隆和表达突变体DNA聚合酶基因。生成大肠杆菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶的突变体的起始材料-编码大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)和Taq DNA聚合酶的大片段(KlenTaq或Taq DNA聚合酶，见Barnes 112基因29，1992或Stoffel片段，见Lawyer等2PCR方法应用275，1993)的基因在T7 RNA聚合酶启动子控制下表达。生成T7 DNA聚合酶的突变体的起始材料-编码T7 DNA聚合酶的28氨基酸缺失的基因(见Tabor和Richardson，264生物化学杂志6447，1989)在一种生产T7 DNA聚合酶持续DNA合成的必需因子大肠杆菌硫氧还蛋白(Tabor和Richardson，引文见上)的菌株中在lac启动子控制下表达。Taq DNA聚合酶突变体F667 Y的基因从生产_Taq DNA聚合酶的基因转移到生产全长Taq DNA聚合酶的基因上，所用标准技术是PCR，限制性消化，然后再连接。

用与Sarkar和Sommer 8生物技术404，1990所描述的方法相似的PCR标准诱变技术诱变以构建突变体DNA聚合酶。为了构建至少互换了4个氨基酸残基的杂合体，先构建两个杂合体引物，先在供体DNA上进行PCR，将所得产物用于在受体DNA上进行PCR，从而得到杂合体分子。为了构建其中结果域交换小于等于4个氨基酸残基的杂合体，先合成含有整个待转移区域以及适当的受体两侧序列的单个PCR引物，采用该引物直接构建杂合体分子。

用标准技术进行突变体DNA聚合酶的过量生产(见例如《当代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等编，第16章，1994)。用包括离子交换层析在内的标准操作纯化突变体蛋白。大肠杆菌DNA聚合酶I突变体的纯化见例如Joyce和Grindley 80美国国家科学院院刊1830，1983。Taq DNA聚合酶的突变体的纯化见例如Engelke等，191，分析生化396，1990。T7 DNA聚合酶的突变体的纯化见例如Tabor和Richardson 264，生物化学杂志6447，1989。用这些参考文献中描述的标准操作确定各纯化突变体蛋白的聚合酶比活。实施例2 从DNA聚合酶中快速筛选出掺入双脱氧核苷酸的效率

比掺入脱氧核苷酸的效率提高的突变体

用SDS活性凝胶分析法对突变体DNA聚合酶筛选其掺入双脱氧核苷酸的能力。该操作是对Spanos和Hübscher 91酶学方法和Karawya等135分析生化318，1983中描述的方法的修饰。简言之，将10ml细胞诱导4到6小时然后沉淀。细胞沉淀重悬于0.3ml 25mM Tris Hcl，pH7.0，5mM EDTA.将20μl的重悬细胞与40μl的1％SDS(十二烷基磺酸钠)，2％巯基乙醇，30％甘油，0.04％溴酚蓝和100mM Tris HCl，pH6.8溶液混合。混合液于37℃温育5分钟，再将两个20μl小份分别加到两块SDS聚丙烯酰胺凝胶上。SDS聚丙烯酰胺的分离胶含8％聚丙烯酰胺，0.27％双丙烯酰胺，190mM Tris HCl，pH8.8，0.05％SDS和25μg/ml变性鲑精DNA，浓缩胶含5％聚丙烯酰胺0.17％双丙烯酰胺，150mMTris HCl，pH6.8和0.1％SDS。两块凝胶于恒温13℃在100V电泳13小时，电泳缓冲液含190mM Tris HCl，pH8.8和0.05％SDS。

电泳后于4℃用4次500ml的复性缓冲液(50mM Tris HCl，pH7.5，5mM乙酸镁，1mM二硫苏糖醇，40mM KCl，400μg/ml牛血清清蛋白。16％甘油和0.95mM EDTA)洗8小时。

将两块胶各自在6ml复性缓冲液，1.5μM 4dNTP，4μl[α-^32P]dATP 1800μCi/mmol，10Ci/ml和80μg纯化的硫氧还蛋白中温育。对复性的蛋白检测其聚合酶活性。其中一种混合液中还含有30μM ddTTP(对dTTP过量20倍)。混合液在37℃温育4小时(对于嗜热性DNA聚合酶是于70℃温育2小时)。

温育后用5％三氯乙酸和1％焦磷酸钠换液4次，洗胶8小时。然后将凝胶干燥并做发射自显影。

为了确定一种突变体DNA聚合酶对ddTTP区别对待程度的大小，将两块有与没有ddTTP存在时温育的凝胶上放射性带的强度相比较，并且将未修饰的DNA聚合酶的两条带上信号比与每种突变体的两条带上信号比相比较。如果一种突变导致DNA聚合酶对ddTTP区别对待程度降低，则与未修饰的DNA聚合酶相比，突变体DNA聚合酶的当ddTTP存在时的带上放射性会减少很多。例如，在这种条件下对含有受诱导的大肠杆菌DNA聚合酶I或T7 DNA聚合酶突变体Y526F观察到在ddTTP存在或不存在时进行的反应中放射性带的强度几乎相同(在2倍之内)。与之对照，对于含有受诱导的大肠杆菌DNA聚合酶I突变体F762Y或T7DNA聚合酶，反应在ddTTP存在时进行的胶上条带，其强度比相应的当ddTTP不存在时进行的胶上条带的强度的5％还要小。

该检测是对大量DNA聚合酶突变体筛选其对双脱氧核苷酸区别对待能力的快速方法。它可以检测到区别对待相对率至少5倍的变化。不过该检测还可接下去做可能感兴趣的突变体DNA的纯化以及对纯化的蛋白用与上述相似的方法做更严格的检测以精确确定各突变体对于双脱氧核苷酸区别对待程度的效果。

下列实施例是确定各种聚合酶的持续合成能力和循环时间，确定聚合酶对ddNTP区别对待水平，确定DNA测序胶上由双脱氧终止片段产生的带的均一性以及本发明的DNA聚合酶做DNA序列分析的方法。实施例3 单链M13 DNA-5′³²P-标记的40聚体

引物复合物的制备与纯化

模板是长9950个核苷酸的M13 mGP1-2单链DNA，描述见美国专利4,795,699(图9)。噬菌体M13 mGP1-2在ATCC的保藏号是40303。根据Tabor等262生物化学杂志，16212，1987的描述来纯化M13 mGP1-2单链DNA。简而言之，通过两次CsCl梯度离心纯化噬菌体，透析除去CsCl，用酚∶氯仿和0.1％十二烷基磺酸钠将DNA(人噬菌体中抽取出来，将抽提到的DNA对20mM Tris HCl，pH7.5，2mMEDTA充分透析，贮于4℃。用光度计确定M13 mGP 1-2单链DNA的浓度，消光系数8.1，A260单位等于1mg/ml或每微升0.3pmol M13 mGP1-2模板分子。

引物是用标准方法合成的40聚体，序列为5′d(TTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA)3′。它与M13 mGP1-29031至8992号核苷酸互补(序列见′699专利，引述见上)。该引物用离子交换层析或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后做末端标记。

基本按Tabor等所述(引述见上)将引物标记并退火到模板上。引物5′末端标记用的反应混合液(15μl)含有40mM Tris·HCl，pH7.5，10mMMgCl₂ 5mM二硫苏糖醇，100mM NaCl，50μg/ml BSA，50μCi[g³²P]ATP，6000Ci/mmol，5pmol引物和从磷酸酶活性缺陷的PseT1突变体制备的10单位的T4多聚核苷酸激酶。混合液于37℃温育15分钟，再于70℃温育15分钟使激酶失活。加入60μl单链M13 mGP1-2DNA(0.25mg/ml)6μl 1M NaCl和3μl 0.2M MgCl₂，混合液缓慢地从70℃降至室温(约20-25℃)共30分钟。然后用1∶1的苯酚氯仿混合液抽提混合液一次，用离心管离心30秒后，将水相(70μl)加样到用20mMTris HCl，pH7.5，2mM EDTA和100mM NaCl平衡的1ml Sepharose CL-6B柱上。用平衡用的缓冲液将标记的引物-模板复合物从柱上洗脱；标记的复合物从外小体积中洗脱出来。洗脱后复合物浓度约为50μg/ml(每μl 0.015pmol分子)，比活约为200,000cpm/μl。实施例4 用稀释实验确定DNA聚合酶的持续合成能力

基本上按Tabor等(引述见上)和Tabor和Richardson，84，美国国家科学院院刊4767，1987所述用酶稀释法确定持续合成能力，反应条件与DNA测序中的延伸/终止(Tabor和Richardson引述见上)条件相同，只是没有ddNTP并且聚合酶浓度降低以使某些反应中引物-模板分子比聚合酶分子过量。如实施例3所述，引物-模板包括退火到单链M13 DNA分子上的单个5′末端标记的引物。

基本上按Tabor等(引述见上)所述配制延伸反应混合液。每种反应混合液(18μl)含1.0μl实施例3所述的退火³²P标记引物-M13 DNA(～0.015pmol，～200,000cpm)、40mM Tris·HCl，pH8.0，5mM MgCl₂，5mM二硫苏糖醇和300μm 4dNTP。加入2μl用20mM Tris·HCl，pH7.5，10mM2-巯基乙醇和0.05％牛血清清蛋白稀释的待分析DNA聚合酶稀释液小份起始反应。反应混合液进一步于37℃(对嗜热性DNA聚合酶是70℃)温育30秒或3分钟。在指定的时间取出8μl水份，在其中加入8μl的90％甲醛，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，或加入2μl的100mM EDTA，2％十二烷基磺酸钠用于碱性琼脂糖凝胶电泳。

用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或碱性琼脂糖凝胶电泳分析样品。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳最适于分析平均持续合成能力小于500个核苷酸的聚合酶，而碱性琼脂糖凝胶电泳对平均持续合成能力大于500个核苷酸的DNA聚合酶能给出更敏感的估计，不过任一种方法均可成功地用于确定任一种DNA聚合酶的平均持续合成能力。

为了用变性聚丙烯脱胺凝胶电泳确定持续合成能力，将溶于甲醛的小份于90℃加热2分钟，迅速将每个样品6μl加样到含8％聚丙烯酰胺，0.4％N，N¹-甲叉双丙烯酰胺，7μM豚，100mM Tris·硼酸，pH8.3，1mM EDTA的凝胶上。电泳2000伏90分钟(直到溴酚蓝刚好走到胶底部为止)适当的5′³²P末端标记的分子量标记物也加样到凝胶上次确定长100至500核苷酸的片段的大小。一种这样的适当标记物是用标准方法(Sambrook)等，1989《分子克隆实验指南》冷泉港实验室，纽约，6.20-6.21页次及Ausubel等1989《当代分子生物学方法》Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，纽约)用碱性磷酸酶去磷酸化后用[g-³²P]ATP和T4多聚核苷酸激酶5′³²P末端标记的T7 HpaI片段，电泳后凝胶真空干燥并放射自显影。放射自显影后用Phosphorimager分析(Molecular Dynamics)确定放射性标记片段的分布。

用碱性琼脂糖凝胶电泳分析产物的描述见(1)Villani等，256生物化学杂志8202，1981，(2)Sabatino等27生化2998，1988和(3)Sambrook等，引述见上。制备琼脂糖凝胶时，250ml含2mM EDTA，pH8.0的1.5％琼脂糖溶液在微波炉中加热，使琼脂糖溶解，然后冷却至60℃，加入8.75ml的1N NaOH(终浓度为35mM NaOH)，将熔胶倒入琼脂糖凝胶电泳模中。胶凝定型2小时后再用。电泳缓冲液是35mM NaOH和2mMEDTA。制备样品时取10μl上述小份(含20mM EDTA，0.4％十二烷基磺酸钠)，加入1μl 1N NaOH，于60℃加热10分钟使之变性。每个样品中加7μl 75％甘油和0.2％溴甲酚绿，然后样品加样到碱性琼脂糖凝胶上。于4℃恒流150mA电泳15小时(直到溴甲酚绿迁移了约14cm)。电泳槽尺寸是20cm(长)×20cm(宽)×2cm(高)。电泳后凝胶在10％三氯乙酸中浸泡2小时，真空干燥并放射自显影。然后用phosphorimager分析(Molecular Dynamics)确定放射性标记片段的分布。

为了检测给定DNA聚合酶的持续合成能力，将反应混合液中聚合酶浓度二倍递减地稀释直到仅有一部分(例如25％)引物被延伸，而大多数(例如75％)不变，引物长40个核苷酸，在这些条件下，DNA聚合酶浓度增减两倍应相应使被延伸的引物分数增减两倍。用目测放射自显影图或用phosphoimager定量来确定标记的片段的平均长度。例如用该检测法，外切酶缺失的T7 DNA聚合酶与其持续合成因子硫氧还蛋白的复合体(例如SEQUENASE^_2.0版，美国生物化学品公司)的平均持续合成能力大于500个核苷酸。而大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段的持续合成能力小于50个核苷酸。实施例5 确定DNA聚合酶的循环速率

基本上按Tabor等(引文见上)的描述确定循环速率。反应条件与DNA测序中的延伸/终止反应条件(Tabor和Richardson引文见上)相同，只是ddNTP没有并且聚合酶浓度降低以使引物-模板分子对聚合酶分子过量。如实施例3所述引物-模板含有退火到单链M13 DNA分子上的5′[³²P]末端标记的引物。

首先做试验确定引物-模板分子对聚合酶分子的功能比，例如用大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)。如实施例4所述进行稀释实验以确定在10秒内将标记的引物-模板分子延伸20％所必需的聚合酶分子浓度。该聚合酶与引物-模板的比值定义为小于等于1∶5，并用于确定聚合酶最大循环速率，描述如下。

如实施例4所述用上段定义的小于等于1∶5的DNA聚合酶对引物-模板的比进行延伸反应。反应在所检查聚合酶的最优条件下(即缓冲液，pH，盐，温度)进行。如实施例4所述在10秒，20秒，40秒和80秒取出小份，终止反应并分析产物。对持续合成能力低的DNA聚合酶(小于100个核苷酸)，如大肠杆菌DNA聚合酶大片段，优选地用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品。对于持续合成能力高(大于100个核苷酸的DNA聚合酶，例如T7 DNA聚合酶，优选地用碱性琼脂糖凝胶电泳分析样品。电泳后凝胶真空干燥，用放射性自显影或磷成像仪分析。

若反应进行时聚合酶循环得很慢，例如T7 DNA聚合酶，则在10秒和80秒之间未被延伸的引物数减少不显著(即小于2倍)。因此若未被延伸的被标记引物数在10秒和80秒两个时刻减少不超过2倍，则DNA聚合酶循环得比70秒一次要慢。对于循环快的聚合酶，在10秒和80秒两个时刻之间未被延伸的引物数会减少很多(即大于2倍)。用下列方程确定这些聚合酶的循环速率：

R＝N₁×L(t₂)/{L(t₁)×(t₂-t₁)}其中：

R＝循环最低速率，单位为循环每秒

N₁＝引物-模板分子对有功能的DNA聚合酶分子的比例(上例中N₁＝5)

L(t₁)＝待检测DNA聚合酶的最大持续合成能力，单位为核苷酸，定义为在限制性DNA聚合酶条件下(10秒时刻仅有20％引物被延伸)从标记的引物延伸的最大核苷酸数，描述见实施例3。

L(t₂)＝在t₂时刻标记引物的最大延伸长度(以核苷酸为单位)，本例中为80秒。

t₁：取出小份的最短时间，本例为10秒。

t₂：取出小份前反应进行的最长时间，本例为80秒。

对大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段做试验得到值为大于0.2轮每秒。    

实施例6和7给出用退火到单链M13 DNA模板上的5′³²P标记40聚体引物确定未知DNA聚合酶掺入双脱氧核苷酸效率的试验以及基于凝胶电泳的分析。实施例6最适于有效地掺入双脱氧核苷酸的DNA聚合酶(例如野生型T7 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶F667Y)，而实施例7最适用于对双脱氧核苷酸掺入强烈地区别对待的DNA聚合酶(例如T7DNA聚合酶Y526F和野生型Taq DNA聚合酶)。实施例6 基于凝胶电泳用1∶1比例的dNTP与ddNTP

确定双脱氧核苷酸相对于脱氧核苷酸掺入的速率

本试验的主要应用是对于能有效掺入双脱氧核苷酸的DNA聚合酶如T7 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I突变体F762Y或Taq DNA聚合酶突变体F667Y确定其ddNMP对dNMP的掺入绝对比值。本试验也可显示任一DNA聚合酶对ddNTP区别对待的水平；不过对于那些对ddNTP强烈地区别对待的DNA聚合酶，如T7 DNA聚合酶突变体Y526F，大肠杆菌DNA聚合酶I或Taq DNA聚合酶，必需用高比值的ddNTP对dNTP以精确确定其区别对待的水平，详细描述见实施例7。

用根据实施例3描述制备的³²P末端标记40聚体-M13 mGP1-2DNA模板复合物进行DNA合成反应。反应条件是对所试验的DNA聚合酶的缓冲液，pH，盐和温度的最优条件。选用的DNA聚合酶浓度使大多数引物在10分钟反应内被延伸并被双脱氧核苷酸的掺入所终止。反应混合液含100μM 4dNTP和100μM的一种ddNTP。

我们用本试验比较6种DNA聚合酶掺入每种ddNMP的能力。所检测的DNA聚合酶是(1)T7 DNA聚合酶，在外切酶结构域有26个氨基酸的缺失并次1∶1的比例与硫氧还蛋白形成复合物(Tabor和Richardson264生物化学杂志6447，1989)(此处称为“T7 DNA聚合酶”)，(2)大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段，通常称为Klenow片段(此处称为“大肠杆菌DNA聚合酶I”，(3)水生栖热菌的未修饰的DNA聚合酶(本文称为“Taq DNA聚合酶”)，(4)上述T7 DNA聚合酶其中526号残基酪氨酸换成苯丙氨酸(本文称为“T7 DNA聚合酶Y526F”)，(5)上述大肠杆菌DNA聚合酶I，其中762号残基苯丙氨酸换成酪氨酸(本文称为“大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y”)和(6)上述Taq DNA聚合酶，其中667号残基苯丙氨酸换成酪氨酸(本文称为“Taq DNA聚合酶F667Y”)。

对每种上述DNA聚合酶为了检测每种ddNTP与相应dNTP相比较的相对利用率，反应混合液中含有如实施例3描述的1.0μl退火的³²P标记引物-M13 DNA(～0.015pmol，～200,000cpm)，40mM Tirs·HCl，pH8.0，5mM MgCl₂，5mM二硫苏糖醇，50mM NaCl，100μM4dNTP，和100μM ddCTP。反应混合液中还含有10ng酵母无机焦磷酸酶以抑制焦磷酸水解，否则会增加DNA聚合酶的表现区别对待(Tabor和Richardson 265生物化学杂志8322，1990)。将各种DNA聚合酶用20mM Tris·HCl，pH7.5，10mM 2-巯基乙醇和0.05％牛血清清蛋白稀释至浓度约0.025单位/l，然后各取20μl加入反应体系以起始反应。各DNA聚合酶浓度是以当ddNTP不存在时在15分钟的反应中将大多数标记的引物延伸多于500个核苷酸。反应混合液于37℃(T7 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶Y526F，大肠杆菌DNA聚合酶I和大肠杆菌聚合酶I F762Y)或70℃(Taq DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶F767Y)温育15分钟。加入10μl 90％甲醛，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝终止反应。每个样品于90℃(加热2分钟后迅速用6μl加样到含有8％聚丙烯酰胺，0.4％N，N′-甲叉双丙烯酰胺，7M豚，100mM Tris·硼酸，pH8.3，1mM EDTA的凝胶上。电泳2000伏90分钟(直到溴酚蓝刚走出凝胶底部)。电泳后凝胶真空干燥并放射自显影。用磷成像仪分析(MolecularDynamics)确定放射性标记片段的分布。备选地可用如SciScan 5000成像密度仪(美国生物化学品公司)等仪器扫描放射自显影图确定双脱氧终止带的相对强度。

如上述用6种DNA聚合酶每一种均做过4个一组的实验(每个实验含有与dNTP摩尔浓度相等的一种ddNTP)后，其中3种DNA聚合酶(T7DNA聚合酶Y526F，大肠杆菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶)的反应得到被延伸的引物中大多数(＞50％)放射性迁移到凝胶的顶部，对应于长度大于300个碱基的片段。根据信号随片段大小增加指数衰减，该结果对应于这三种DNA聚合酶对所有4种ddNTP区别对待均大于100倍。用下面实施例7的检测可更精确地测量这三种DNA聚合酶对ddNTP区别对待的程度。

对另3种DNA聚合酶(T7 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶IF762Y和Taq DNA聚合酶F667Y)放射自显影图显示所有反应均有一系列双脱氧终止的片段。通常对Taq DNA聚合酶F667Y标记的合成片段的平均长度最短，即使曝光几天也只能看到6条放射性标记的双脱氧终止的片段。大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y的标记片段的平均长度比TaqDNA聚合酶F667Y的稍长，T7 DNA聚合酶的标记片段的平均长度最长。用大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y合成的片段比T7 DNA聚合酶的强度更均一。

片段放射性的分布用磷成像仪分析(Molecular Dynamics)定量。用3个不含DNA聚合酶的对照反应走胶确定每条泳道上标记的引物的总量。并且确定凝胶上在未延伸的引物位置上每条相应放射性带的放射性。对某些放射性标记引物的制备物，无论所用DNA聚合酶浓度多大，总有一定百分比的引物不会被任何DNA聚合酶延伸。通过测量含有ddNTP的一套4个反应中在未被延伸的引物位置留下的放射性百分比，从中减去以前确定的总计数量中这四个值的平均值可以确定该背景水平。该值定义为引物中能被DNA聚合酶延伸的总计数量。

在4个ddNTP反应的每一个中对T7 DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y确定头3个双脱氧终止片段的总计数量(即放射性)。在下表中以前3个双脱氧终止片段的计数可能被DNA聚合酶延伸的引物的总计数量的百分比给出这些数值。

                      聚合酶反应

                   ddGTP      ddATP     ddTTP     ddCTPT7 DNA聚合酶            67％       66％      76％      61％大肠杆菌DNA聚合酶       95％       92％      96％      92％

I F762YTaq DNA聚合酶F667Y      97％       95％      95％      99％

为进一步确定各DNA聚合酶掺入双脱氧核苷酸的效率，对每个反应确定每条信号强的片段的计数量，用Macintosh程序Kaleidograph3.0版(Synergy Software)将所得数据作成片段数目的函数。用Kaleidograph中指数衰减函数的库子程序将所得曲线拟合成指数衰减曲线。衰减曲线由下列方程给出： $>>Y>=>>e>>M>*>X>\; >$

其中

Y＝1-(片段1至X中被标记的引物还可延伸引物总数的比值)

X＝片段数(第一个双脱氧终止片段是1)

M＝用Kaleidograph库子程序对数据计算得的指数衰减函数

在下表中，对利用T7 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y的4种ddNTP反应中每一个给出下列数据：

N，用于拟合每一条指数曲线的片段数。

M，如上述计算得的指数衰减函数。

D，区别对待因子，即某种dNTp与其相应ddNTP浓度相同时，利用前看的量与利用后者的量的比值。用M的计算值确定当X＝1时Y值，将D，即dNTP对ddNTP的优先比，定义为Y/(1-Y)，则可由上述方程计算得D。

用Kaleidograph库子程序计算得数据的相关系数R²。它量度条带强度的差异或DNA聚合酶掺入特定双脱氧核苷酸的序列特异性差异。

  聚合酶       ddNTP      N       M       D       R²

T7 DNA聚合酶   ddGTP      8    -0.375    2.2     0.813

               ddATP      6    -0.356    2.3     0.996

               ddTTP      5    -0.450    1.8     0.997

               ddCTP      8    -0.317    2.7     0.889大肠杆菌DNA聚合酶  ddGTP      5    -1.03     0.56    0.999

I F762Y

               ddATP      5     -0.860   0.72    0.998

               ddTTP      5     -1.06    0.54    1.000

               ddCTP      6     -0.842   0.75    1.000Taq DNA聚合酶F667Y ddGTP      5     -1.18    0.45    0.995

               ddATP      6     -0.997   0.59    0.997

               ddTTP      6     -1.01    0.56    0.996

               ddCTP      4     -1.44    0.32    0.996平均值T7 DNA聚合酶4 ddNTP                    2.3     0.924大肠杆菌DNA聚合酶  4 ddNTP                  0.64    0.999

F762YTaq DAN聚合酶F667Y 4 ddNTP                  0.48    0.996

总之，T7 DNA聚合酶对ddNTP区别对待2.3倍，而大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y实际上对ddNTP利用程度分别为对dNTP利用度的1.6倍(1/0.64)和2.1倍(1/0.48)。比较R²可发现大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y与T7 DNA聚合酶相比，相邻片段的强度更加均一。为了更准确地测量均一程度，降低每个反应中ddNTP水平(例如降低5倍)。减少每个位置上的强度衰减(见实施例13)则可在分析中包括更多的片段。

为确定一种新的DNA聚合酶对ddNTP区别对待的倍数，可进行与上述相似的反应并且同时进行用T7 DNA聚合酶(SEQUENASE 2.0版，美国生物化学品公司)的平行反应，所有反应都在同一块胶上分析。将新DNA聚合酶得到的双脱氧终止带的分布与T7 DNA聚合酶得到的带分布相比可显示新DNA聚合酶对ddNTP区别对待程度比T7 DNA聚合酶大还是小。例如对大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y目测清楚地显示对含每种ddNTP的反应，用大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y的反应其凝胶上可见片段数目比用T7 DNA聚合酶的反应的少(且平均长度小)。可以与上述类似地做更加定量的分析，对上述新DNA聚合酶计算其指数衰减因子(M)，ddNTP相对于dNTP的平均相对利用率(D)和强度差异(R²)。

本试验DNA聚合酶有相关的外切酶活性，如与Taq DNA聚合酶相关的5′至3′外切酶活性和与大肠杆菌DNA聚合酶I及天然T7 DNA聚合酶(而非上述实验中用的_28 T7 DNA聚合酶缺失突变体)相关的3′至5′外切酶活性则会出现问题。5′至3′外切酶活性有害是因为它能除去引物5′端的标记，减少可检测到的放射性信号。减少反应混合液中DNA聚合酶量可部分地避免这个问题。在上例中，用0.025单位的Taq DNA聚合酶几乎使所有的引物都得到延伸，直到掺入双脱氧核苷酸为止，而不因5′至3′外切酶活性使放射性明显降低，而当Taq DNA聚合酶活性增加40倍，即每反应1单位时，几乎所有引物5′端的32P都失去。测量具有5′至3′外切酶活性的DNA聚合酶区别对待程度的另一种方法是利用如实施例8-10所述的不同的试验。

3′至5′外切酶活性使上述试验出现的问题是DNA聚合酶看上去的对ddNTP区别对待程度比实际的大(例如见Tabor和Richardson，86美国国家科学院进展，4076，1987)，这是因为一旦掺入一个双脱氧核苷酸，外切酶活性会倾向于除去该双脱氧核苷酸使DNA合成继续，造成片段长度变大。优选地，上述试验中检测的酶不含这种3′至5′外切酶活性；例如修饰的T7 DNA聚合酶(Sequenase^_美国生物化学品公司)，Taq DNA聚合酶，外切酶缺陷的Vent(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(NewEngland Biolabs目录号257)，外切酶缺陷的Deep Vent(Pyrococcus GB-1)DNA聚合酶(New England Biolabs目录号259)，外切酶缺陷的pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Stratagene目录号600103)和外切酶缺陷的Klenow片段(大肠杆菌DNA聚合酶，美国生物化学品公司，目录号70057)。某些情况下，例如大肠杆菌DNA聚合酶I(Klenow片段)，3′至5′外切酶活性弱，对本试验干扰不大(见例如Tabor和Richardson 264生物化学杂志6447，1989)。确定一种待检测的新DNA聚合酶是否有干扰对ddNTP区别对待能力的精确测量的3′至5′外切酶活性的一种方法是进行上述实验，在不同时刻取出小份，最长时间为60分钟。如果双脱氧终止片段的大小分布随时间而增加，则有可能这种3′至5′外切酶活性干扰检测。而如果片段分布不随时间变化则这种活性效果不大。如果平均片段长度随时间增加，则温育时间应缩短和/或将DNA聚合酶浓度降低到片段大小不随随时间变化。

焦磷酸水解，即聚合酶反应的逆过程，会有跟3′至5′外切酶活性相似的效果，使DNA聚合酶除去链终止双脱氧核苷酸进而增大片段长度(见Tabor和Richardson，265生物化学杂志8322，1990)。在反应混合液中加入焦磷酸酶，除去DNA合成过程中积累的焦磷酸水解必需底物焦磷酸可以方便地避开该活性。实施例7 基于凝胶电泳用不同比例的dNTP

与ddNTP确定双脱氧核苷酸相对于

脱氧核苷酸的掺入速率

本实施例与实施例6相似。虽然本实施例是对掺入双脱氧核苷酸强烈区别对待的DNA聚合酶(例如T7 DNA聚合酶Y526F，大肠杆菌DNA.聚合酶I和Taq DNA聚合酶)的优选试验，它对能有效掺入ddNMP的DNA聚合酶(例如T7 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I突变体F762Y和Taq DNA聚合酶突变体F667Y)等给出好的结果。本试验中两个不同的DNA聚合酶制备物的ddNTP与dNTP比值不同，而所有其它反应条件相同，然后比较双脱氧终止，放射性标记的片段的分布来确定两种待检测DNA聚合酶要得到可比的平均长度的片段所需的比值。

用两种方法中任一种确定一系列片段的平均长度。第一种方法最适于有效掺入ddNTP的DNA聚合酶，我们检查放射自显影图，确定用一种DNA聚合酶和含2倍递增的ddNTP∶dNTP比的一系列反应中曝光一定时间后最大可见带的位置，将该位置与用第二种DNA聚合酶的相似的一系列反应的带位置相比较，以确定对于两种DNA聚合酶要得到可比大小的片段所需的比值。标志着有可见放射性带出现的前端位置通常相对较清晰，可方便地目测。不过也可以用磷成像仪从胶顶部扫到胶底部，将每条泳道上达到某一每单位面积放射性阈值的各位置定位来精确地确定这些位置。

某些DNA聚合酶对双脱氧核苷酸掺入的区别对待非常强烈，这时很难向反应中加入足够量的ddNTP以清楚地检测到变性聚丙烯酰胺凝胶上最大的双脱氧终止片段的位置。对这种DNA聚合酶，可以用碱性琼脂糖凝胶电泳比较不同系列中双脱氧终止片段的长度。若用变性聚丙烯酰胺凝胶，则对两种待检测的DNA聚合酶确定其产生可比平均长度的双脱氧终止片段所需的ddNTP∶dNTP比值的另一方法是将注意力集中于一条或几条带上，用磷或像仪确定在这些带上得到特定放射性水平所需的ddNTP∶dNTP比值。

用实施例6描述的6种DNA聚合酶进行这些实验，反应条件除了ddNTP和dNTP的浓度与实施例6的条件相同。所有反应混合液均含10μM 4dNTP对下列3种DNA聚合酶：T7 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y在0.02M至1M范围内将4种ddNTP的浓度2倍递增，下列3种DNA聚合酶：T7 DNA聚合酶Y526F，大肠杆菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶F667Y在100至2，000M范围内将4种ddNTP的浓度2倍递增。如实施例6所述进行反应并用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品，干燥凝胶，放射自显影和磷成像仪分析。下表总结了实验结果；对T7 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y给出的数值是实施例6中对用1∶1dNTP与ddNTP比得到的双脱氧终止片段的强度用统计方法分析其指数衰减速率得出的绝对比值。对T7 DNA聚合酶Y526F，大肠杆菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶得出的数值是通过确定要得到一系列双脱氧终止的片段，其平均长度与分别利用T7 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶IF762Y和Taq DNA聚合酶F667Y得到的双脱氧终止片段平均长度相当时所需的ddNTP与dNTP比值得到的。也就是说，对每对野生型和突变体DNA聚合酶确定要得到双脱氧终止片段的可比分布所需的ddNTP∶dNTP比值。用强烈区别对待的酶(即在关键位置含苯丙氨酸的酶的反应中所用ddNTP∶dNTP比值除以在相对非区别对待的酶(即在关键位置含酪氨酸的酶)的反应要得到可比的双脱氧终止片段分布所用的ddNTP∶dNTP比值除以片段分布所用的ddNTP∶dNTP比值得到一个因数，它对应于两种DNA聚合酶利于ddNTP相对于利用相应dNTP的效率之差。该因数乘以在实施例6中对T7 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶IF762Y和Taq DNA聚合酶F667Y得到的绝对比值，则得到下列对T7 DNA聚合酶Y526F，大肠杆菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶分别给出的数值。

        聚合酶                   掺入速率比

                 dG/ddG    dA/ddA   dT/ddT   dC/ddC

T7 DNA聚合酶       3.2      3.3      2.8      3.7

T7 DNA聚合酶       6,400    7,300    8,400    11,000

    Y526F大肠杆菌DNA聚合酶I     140      720      1,100    250大肠杆菌DNA聚合酶I     0.56     0.72     0.54     0.75

    F762Y

Taq DNA聚合酶     1,400     4,700    4,500    2,600Taq DNA聚合酶F667Y    0.45      0.59     0.56     0.32

下表总结了T7 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶在关键选择性残基处有酪氨酸而非苯丙氨酸对ddNTP相对dNTP利用的影响。

  残基         平均速率    对dN/ddN的改善   对ddNTP的利用T7 DNA聚合酶    酪氨酸(野生型)      3.0              3,000X

               苯丙氨酸        8,000大肠杆菌DNA      苯丙氨酸(野生型)  600

聚合酶I      酪氨酸            0.6           1000XTaq DNA聚合酶苯丙氨酸(野生型)     3,000

             酪氨酸            0.5           6,000X

为了用本试验确定一种新DNA聚合酶区别对待程度，如上述进行反应，首先用大范围的ddNTP对dNTP比值，然后将变性聚丙烯酰胺凝胶上双脱氧终止片段的分布与标准(例如T7 DNA聚合酶的片段分布相对照。将含有可比平均长度的DNA片段的泳道相匹配，新DNA聚合酶的ddNTP∶dNTP比值除以T7 DNA聚合酶所用比值得到新DNA聚合酶相对于T7 DNA聚合酶的区别对待水平。

为了用本试验确定一种DNA聚合酶的修饰是否降低其对ddNTP的区别对待能力(即更有效地掺入双脱氧核苷酸)如上述将单位数相同的修饰与未修饰的DNA聚合酶用于一系列含不同ddNTP对dNTP比值的反应中。对于两种酶比较其ddNTP比dNTP比值相同时双脱氧终止片段的平均长度。如果该修饰造成DNA聚合酶更有效地掺入ddNTP，则在同样的ddNTP∶dNTP比值时，用修饰DNA聚合酶的反应比用未修饰DNA的反应得到的双脱氧终止片段平均长度要短，而若修饰使DNA聚合酶对ddNTP的区别对待程度更大则用修饰DNA聚合酶的反应得到的平均长度要长。    

本试验也可用来确定DNA聚合酶的修饰是否导致它对ddNTP类似物，例如荧光加尾的ddNTP的区别对待能力降低。即使不知道待检测的类似物浓度也可以这样做。举例来说，比较Taq DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶F667Y利用Applied Biosystems(部分号401150)生产的四种DyeDeoxy终止物的能力。这些DyeDeoxy终止物各自共价连接不同的荧光部分(详情见实施例12)。对于每种DyeDeoxy终止物，dNTP与DyeDeoxy终止物比值在16,000供范围内按2倍递变，比较放射自显影图上双脱氧终止片段的模式确定两种酶各自要得到相同平均长度的双脱氧终止片段所需的比值。下表总结了这些结果。对于每种终止物，“比值”栏表示Taq DNA聚合酶对Taq DNA聚合酶F667Y要得到相同平均长度的片段需要的ddNTP对dNTP比值。对正常的ddNTP，Taq DNA聚合酶F667Y对未修饰的Taq DNA聚合酶更有效地掺入荧光ddNTP衍生物，至少400倍。DyeDeoxy终止物                比值G终止物                       ＞400A终止物                       ＞2,000T终止物                       ＞2,000C终止物                       ＞2,000

如前面讨论，用本试验若待检测DNA聚合酶有相关的外切酶活性则可能出现问题，5′至3′和3′至5′外切酶能造成的问题和减小其影响的方法已在实施例6中讨论过。当做试验确定一种DNA聚合酶的修饰是否降低其掺入双脱氧核苷酸的能力时，一类有该效果的突变体是使正常情况下有的3′至5′外切酶活性失活的突变体(例如见Tabor和Richardson美国科学院进展84，4767，1987)。这类突变体不包涵于本发明的权利要求。如果一种修饰的DNA聚合酶其掺入双脱氧核苷酸能力明显升高，要想确定突变在聚合酶结构域还是在外切酶结构域，则有必要对该酶的修饰与未修饰形式做外切酶试验；主要影响酶的外切酶活性的突变体对酶的外切酶活性的作用比对其聚合酶活性的作用要大。优选地可以对3′端用³²P-ddAMP标记的DNA底物测量其外切酶活性(见实施例21)如实施例6，在这些反应中必须抑制焦磷酸水解以避免该作用增加一种DNA聚合酶对ddNTP的表现区别对待能力。在反应中加入焦磷酸酶可方便地实现此目的。实施例8 通过抑制单链M13 DNA-未标记40聚体

引物复合物的DNA合成确定双脱氧核苷酸

的掺入效率

本实施例中通过测量不同浓度ddNTP抑制标准DNA合成反应的能力来确定DNA聚合酶对ddNTP的敏感性。DNA合成试验是Tabor和Richardson264生物化学杂志6447，1989中描述的方法的修饰。40聚体引物和M13 mGP1-2模板的有关描述见实施例3。反应混合液(1X＝25μ1)中DNA模板含2μg M13 mGP1-2 DNA，6pmol引物(对模板过量10倍)，40mM Tris·HCl，pH8.0，10mM MgCl₂和100mMNaCl。混合物于65℃温育2分钟后在30分钟内冷却至温室，标准反应混合物(45μl)含22mM Tris·HCl，pH8.0，5.5mM MgCl₂，55mMNaCl，300μM dGTP，dATP，dCTP和[³H]TTP(30cpm/pmol)和不同浓度的各种ddNTP或全部4种ddNTP。反应混合液中还含有10ng酵母无机焦磷酸酶来抑制焦磷酸水解，否则会增加DNA聚合酶的表现区别对待能力(Tabor和Richardson 265生物化学杂志8322，1990)。反应混合液于37℃温育1分钟(对嗜热性DNA聚合酶是70℃)，加入5μl用20mMTris·HCl，pH7.5，10mM 2-巯基乙醇和0.05％牛血清清蛋白稀释的稀释液小份(0.01至1单位)起始反应。反应混合液进一步于37℃温育10分钟(对嗜热性DNA聚合酶是70℃)。加入5μl 100mM EDTA终止反应，将45μl印到(spotted)Whatman DE81滤器盘上。用150ml 0.3M甲酸铵pH8.0换4次液，再用150ml 90％乙醇换2次液洗滤器盘，每次5到10分钟。滤器盘然后在加热灯下干燥，用闪烁计数器在加热灯下干燥，用闪烁计数器在5ml fluor               (Opti-Fluor O，Packard)存在时计数。从每盘上放射性量计算总的DNA合成量。

特定的待检测DNA聚合酶的最优缓冲液，pH，盐或温度条件可能与上述不同。每种DNA聚合酶应当在使该酶有最优聚合酶比活的条件下检测。

为确定一种给定DNA聚合酶的修饰是否导致其对双脱氧核苷酸区别对待能力的降低，首先在ddNTP不存在时进行一系列实验，改变DNA聚合酶浓度以确定对酶的修饰和未修饰形式活性均随酶浓度几乎线性变化的浓度范围。从两种酶形式的线性范围选取一个酶浓度；例如在10分钟内约30％的模板被复制的酶浓度就很可能位于该线性范围。

一旦选定一个适当的酶浓度，进行一系列实验，改变一种ddNTP的量，或优选地改变混合液中所有4种ddNTP的量来确定50％的DNA合成被抑制时的浓度。例如在上述条件(300μM 4dNTP)，对于下列6种DNA聚合酶需要下列浓度的4种ddNTP的混合液以抑制50％的DNA合成。

聚合酶                    50％抑制时的[4ddNTP]T7 DNA聚合酶                         0.1μMT7 DNA聚合酶Y526F                    300μM大肠杆菌DNA聚合酶I                   20μM大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y             0.04μMTaq DNA聚合酶                        150μMTaq DNA聚合酶F667Y                   0.4μM

本试验可用于确定一种新DNA聚合酶的修饰是否降低其区别对待ddNTP的能力，如果该突变确实具有该效应，则上述试验需要更高浓度的4ddNTP来抑制50％的DNA合成。实施例9 通过测量[a-³²P]dAMP掺入合成的引物-模板

复合体确定双脱氧核苷酸掺入的效率

本实施例中检测合成的引物-模板中单个位点上dNTP与ddNTP的竞争。该试验与其它试验不同之处在于它将两种底物利用程度的比较限于单个位点，避免了序列特异性差异对区别对待能力的干扰。尽管这个相对简单的试验适于对DNA聚合酶初步筛选其区别对待ddNTP的能力，但它不应该与实施例6-8介绍的试验脱离开来应用，因为对ddNTP的区别对待能力受邻近序列影响很大，这是DNA测序分析中一个重要问题(见例如Tabor和Richardson 265生物化学杂志8322，1990)。

本实施例用下面给出的两个引物-模板。前一个用于确定对dNTP及ddATP的区别对待能力。后一个用于确定对dCTP及ddCTP，dTTP及ddTTP，和dGTP及ddGTP的区别对待能力。

引物-模板A：

5′GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA             3′

3′GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCCCC          5′    

引物-模板B：

5′GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA             3′

3′GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTCAGTTTT        5′

每种反应混合液含25pmol的每种模板和引物。引物和模板混合在含40mM Tris·HCl，pH8.0，10mM MgCl₂，和100mM NaCl的反应混合液(1X＝10μl)中退火。混合液于65℃温育2分钟，然后在30分钟内冷却至室温。用引物-模板A进行反应的标准反应混合液(45μl)含22mMTris·HCl，pH8.0，5.5mM MgCl₂，55mM NaCl，25pmol引物-模板复合物，5μM[a-³²P]dGTP(4,000cpm/pmol)和不同浓度的dATP和ddATP。反应混合液还含有long的酵母无机焦磷酸酶以抑制焦磷酸水解，否则DNA聚合酶的表现区别对待能力会变大(Tabor和Richardson 265生物化学杂志8322，1990)。混合液于37℃温育1分钟(对嗜热型DNA聚合酶是70℃)，然后加入用20mM Tris·HCl，pH7.5，10mM 2-巯基乙醇和0.05％牛血清清蛋白稀释的待检测DNA聚合酶5μl小份(0.01至1单位)起始反应。反应混合液进一步于37℃温育10分钟(对嗜热型DNA聚合酶是70℃)。加入5μl 100mM EDTA终止反应。将45μl印到Whatman DE81滤器盘上。用150ml 0.3M甲酸铵pH8.0换4次液，再用150ml 90％乙醇换2次液洗滤器盘，每次5到10分钟。滤器盘然后在加热灯下干燥，用闪烁计数器在5ml Fluor (Opti-Fluor O，Packard)中计数。从每盘上放射性的量确定掺入的[³²P]dGMP量。假定前提是一旦单个dAMP残基掺入以去除对dGMP残基掺入的阻碍，则4[³²P]dGMP将会掺入到每个引物中，因而掺入的dAMP数是掺入的dGMP数的四分之一。

用恒定量的待分析DNA聚合酶进行所有反应；DNA聚合酶的量应足以在10M dATP存在而ddATP不存在时10分钟温育过程中在模板的单链区域复制总dCMP残基的50％。特令的待检测DNA聚合酶的最优缓冲液，pH，盐或温度条件可能与上述不同。每种DNA聚合酶应当在使该酶有最优聚合酶比活的条件下检测。还应当进行dATP或ddATP均不存在的对照反应。这样可以确定DNA合成背景，将该背景从每个样品中减去。通常该背景小于dATP存在时的DNA合成的10％。

然后用10μM dATP和不同浓度ddATP进行反应，以确定DNA合成50％被抑制所需的ddATP量。下表给出10μM dATP存在时DNA合成50％受抑制所需的ddATP浓度的例子。聚合酶由实施例6定义。

        聚合酶                 50％抑制时的[ddATP]

     T7 DNA聚合酶                    30μM

  T7 DNA聚合酶Y526F                ＞500μM

 大肠杆菌DNA聚合酶I                ＞500μM  大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y                6μM

    Taq DNA聚合酶                  ＞500μM

 Taq DNA聚合酶F667Y                   5μM

为了做相似的试验测量对ddGTP，ddTTP或ddCTP的区别对待程度，进行与上述相同的试验，不过用引物-模板B而非引物-模板A，并且反应含有10M dGTP，dTTP和dCTP，5M[a- ³²P]dATP(4,000cpm/pmol)以及不同浓度的ddGTP，ddTTP或ddCTP。

如同其它实施例一样，DNA聚合酶具有3′至5′外切酶活性会干扰本试验，使酶对ddNTP区别对待的程度大于因类似物掺入而区别对待的水平。另外，酶的外切酶活性高，会用尽反应液中的dNTP(尤其是当这些反应中dNTP水平相对低时)，造成没有净DNA合成(例如天然T7 DNA聚合酶，见Tabor和Richardson 264生物化学杂志，6447，1989)。这种情况下应调整DNA聚合酶的浓度和反应的温育时间，使得当ddNTP不存在时得到最高水平的DNA合成。实施例10确定[a-³²P]ddNMP掺入合成的引物-模板复合物中的效率

本实施例中检测dNMP和ddNMP掺入合成的引物-模板中单个位点的竟争。该试验与实施例9的区别在于标记物是[α-³²P]ddATP，因此测量的是ddAMP的掺入。该试验可检测一种ddNTP是否作为链终止物抑制DNA聚合酶，或掺入引物3′端，或是简单地结合上DNA聚合酶不掺入引物就阻止DNA进一步合成。    

下面的实验例中用[a-³²P]ddATP和引物-模板A(实施例9)测量ddAMP的掺入：

引物-模板A：

5′GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA              3′

3′GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCCCC           5′

可见在适当的模板上(例如实施例9的引物-模板B)类似地检测[a-³²P]ddGMP，[a-³²P]ddCMP和[a-³²P]ddTMP的掺入。

每种反应混合液含25pmol的每种引物和模板(引物-模板 A，见上)。引物与模板混合，在含有40mM Tris·HCl，pH8.0，10mM Mgch₂和100mM NaCl的反应混合液(1X＝101)中退火。混合液于65℃温育2分钟，在30分钟内冷却至室温。标准反应混合液(45μl)含22mMTris·HCl，pH8.0，5.5mM MgCl₂，55mM NaCl，25pmol引物-模板A复合物，2.5M[a- ³²P]ddATP(Amersham PB 10235，＞5000Ci/mmol，同冷的ddATP稀释至比活为4,000 cpm/pmole)和不同浓度的dATP。反应混合液还含有10ng酵母无机焦磷酸酶以抑制焦磷酸水解，否则会增加DNA聚合酶的表现区别对待能力(Tabor和Richardson，265，生物化学杂志，8322，1990)。混合液于37℃温育1分钟(对嗜热性DNA聚合酶是70℃)，然后加入51用20mM Tris·HCl，pH7.5，10mM 2-巯基乙醇和0.05％牛血清蛋白稀释的待检测DNA聚合酶小份(0.01至1单位)起始反应。加入51100mM EDTA终止反应，取451印到Whatman DE81滤器盘上。用150ml 0.3M甲酸铵，pH8.0换液4次，150ml 90％乙醇换液2次洗滤器盘，每次10-15分钟。然后将盘在加热灯下干燥，在5ml荧石中(Opti-Ftuor O，Packard)用闪烁计数仪计数。从每盘上放射性的量确定掺入的[³²P]ddAMP量。

所有反应均用恒量的待检测DNA聚合酶进行；DNA聚合酶量应使当dATP不存在时10分钟温育过程中[³²P]ddAMP掺入水平最高。特定的待检测DNA聚合酶的最优缓冲液，pH，盐或温度条件可能与上述不同。每种DNA聚合酶应当在使该酶具有最优聚合酶比活的条件下检测。

为了用本试验确定对ddNTP的区别对待水平，反应用恒量DNA聚合酶和[³²P]ddATP，当2.5M dATP(与^[32P]ddATP等摩尔浓度)存在或不存在时进行并确定dATP的存在对于[³²P]ddAMP掺入的影响。如果DNA聚合酶对ddAMP和dAMP的掺入不加区分且没有3至5外切酶活性，则加入dATP令抑制[³²P]ddAMP掺入的50％。

本试验最适用于有效掺入ddNMP的DNA聚合酶例如Taq DNA聚合酶F667Y。对于强烈区别对待ddNMP的DNA聚合酶，优选前一种试验，其中标记物在不与某ddNTP竟争的另一种dNTP中，这样采用的ddNTP的浓度可更高。不过对于强烈区别对待ddNMP的DNA聚合酶，如果我们有只趣检测一种给定的突变是否降低对ddNMP区别对待的水平，则本试验可用来当dATP不存在时检测该底物上的未修饰DNA聚合酶(测量[³²P]ddAMP插入作为DNA聚合酶浓度的函数)，然后将其掺入速率与突变体酶的相比较。如果突变降低对ddATP的区别对待程度，则突变体酶掺入[³²P]ddAMP的比活要高。

如同其它实施例一样，DNA聚合酶具有3′至5′外切酶活性会干扰本试验，使酶对ddNTP的区别对待程度大于因类似物掺入而区别对待的水平。如实施例9中所说，酶的外切酶活性高，会耗尽所有dNTP，造成没有[³²P]ddAMP净掺入。这种情况下应调整DNA聚合酶的浓度和反应的温育时间，使待检测DNA聚合酶掺入[³²P]ddAMP的水平最高。

所有上述方法均基于放射性，检测延伸的引物的长度或引物上DNA合成的量。也可用非放射性的装置测量DNA聚合酶掺入双脱氧核苷酸的效率。下面给出两个利用荧光引物或荧光dye-dideoxy终止物的实例例，检测用Applied Biosystems 373A型DNA测序系统。实施例11用退火到单链DNA上的荧光引物和凝胶电泳确定双脱氧核苷酸掺入效率

本实施例中荧光标记的引物退火到单链DNA上，用不同比例的dNTP和ddNTP进行DNA合成反应。样品然后加样到Applied Biosystems373A型DNA测序系统中，凝胶电泳直接检测荧光确定各荧光片段的长度。反应如Tabor和Richardson 265生物化学杂志8322，1990的指述进行。荧光引物是“Fam”引物(Applied Biosystems)。所用DNA是实施例3所述的单链M13 mGPI-2 DNA。引物在含有2g MI3 mGP 1-2DNA，5ng引物，40mM Tris·HCl，pH8.0，10mM MgCl₂和100mMNaCl的反应混合液中(1X＝101)退火到M13 mGP1-2单链DNA模板上。混合液于65℃温育2分钟，然后在30分钟内冷却至室温。标准反应混合液(18 l)含22mM Tris·HCl，pH8.0，5.5mM MgCl₂，55mMNaCl和不同浓度的4dNTP以及一种ddNTP。反应混合液还含有10ng酵母无机焦磷酸酶以抑制焦磷酸水解，否则会增加DNA聚合酶的表现区别对待能力(Tabor和Richardson，265生物化学杂志8322，1990)。混合液于37℃温育1分钟(对嗜热性DNA聚合酶是70℃)，然后加入21用20mM Tris·HCl，pH7.5，10mM 2-巯基乙醇和0.05％牛白清清蛋白稀释的待检测DNA聚合酶小份(0.01至1单位)起始反应。反应混合液进一步于37℃温育10分钟(对嗜热性DNA聚合酶是70℃)。加入81的20mM EDTA，1M乙酸钾，pH5.0，和601的乙醇终止反应。离心后DNA重悬于61的80％甲醛，10mM Tris·HCl，pH8.0和1mM EDTA，于80℃加热2分钟，立即根据制造商的操作指南加样到AppliedBiosystems 373A型DNA测序系统中。特定的待检测DNA聚合酶的最优缓冲液，pH，盐或温度条件可能与上述不同。每种DNA聚合酶应当在聚合酶比活最优的条件下检测。DNA聚合酶的浓度应是以在10分钟的反应中将大部分引物延伸至少几百个核苷酸或直至双脱氧核苷酸掺入为止。

调整dNTP对ddNTP的比值以得到约300个碱基的最优峰强度。例如Taq DNA聚合酶约10M 4dNTP和200-600M ddNTP最优，而TaqDNA聚合酶F667Y约300M 4dNTP和0.5-5M ddNTP最优。

为确定一种给定DNA聚合酶的修饰是否使其区别对待双脱氧核苷酸的能力降低，反应应对未修饰的和修饰的DNA聚合酶以不同的dNTP对ddNTP比值进行，比较不同长度的双脱氧终止片段的强度以确定修饰的DNA聚合酶是否比未修饰的酶更有效地利用ddNTP。实施例12 凝胶电泳确定荧光双脱氧核苷酸的掺入效率

本实施例中非荧光引物退火到单链DNA上，用不同的dNTP对单个荧光标记的ddNTP比值进行DNA合成反应。然后样品加样到AppliedBiosystems 373A型DNA测序系统中，在凝胶电泳时直接检测荧光确定每个荧光片段的长度。本实施例用的引物是实施例3中指述的40聚体，模板是实施例3指述的单链M13 mGP5-2。引物在含有2g M13 MGP1-2 DNA，6pmol引物(对模板过量10倍)，40mM Tris·HCl，pH8.0，10mM MgCl₂和100mM NaCl的反应混合液(1X＝101)中退火到M13 MGP1-2单链DNA模板上。混合液于65℃温育2分钟，然后在30分钟内冷却至室温。标准DNA混合液(181)令22mM Tris·HCl，pH8.0，5.5mM MgCl₂，55mM NaCl，和不同浓度的4dNTP以及一种荧光标记的ddNTP。4种荧光标记的ddNTP购自Applied Biosystems(TaqDyeDeoxy终止物循环测序试剂盒，部分号401150)，并称为G，A，T或C“DyeDeoxy终止物”(Taq DyeDeoxy终止物循环测序试剂盒的手册，部分号901497，Rev.E)。反应混合液还含有10ng酵母无机焦磷酸酶以抑制焦磷酸水解，否则会增加DNA聚合酶的表现区别对待能力(Tabor和Richardson 265生物化学杂志8322，1990)。反应混合液于37℃温育1分钟(对嗜热性DNA聚合酶是70℃)，加入21用20mMTris·HCl，pH7.5，10mM2-巯基乙醇和0.05％牛血清清蛋白稀释的待分析DNA聚合酶小份(0.01至1单位)起始反应。反应混合液进一步于37℃温育10分钟(对嗜热性DNA聚合酶是70℃)。加入81的20mMEDTA，1M乙酸钾，pH5.0和601的乙醇终止反应。离心后，DNA悬浮于61的80％甲醛，10mM Tris·HCl，pH8.0和1mM DTPA中，于80℃加热2分钟，迅速按制造商的操作指南加样到Applied Biosystems373A型DNA测序系统中。

特定的DNA聚合酶的最优缓冲液，pH，盐或温度条件可能与上述不同。每种DNA聚合酶均在其聚合酶比活最优的条件下测量。用于本反应的DNA聚合酶浓度应是以在10分钟的反应中将大部分引物延伸至少几百个核苷酸或直到双脱氧核苷酸掺入为止。对于具有5′至3′外切酶活性的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶，DNA聚合酶浓度应保持足够低以避免该活性降解掉相当大百分比的片段5′端。

为确定一种DNA聚合酶对荧光ddNTP区别对待的强弱，用20M4dNTP和0.011各种DyeDeoxy终止物(购自Applied Biosystems部分号401150)进行反应。若在这种条件下用Taq DNA聚合酶，则大部分荧光在凝胶前端的未掺入的染料ddNTP上或是在长度大于几百碱基的片段中。而这种条件下用Taq DNA聚合酶突变体F667Y，则大部分荧光在长度小于几百碱基的片段中，在凝胶前端未掺入的染料-ddNTP中的荧光占总荧光的百分比小得多。

为确定一种给定的DNA聚合酶的修饰是否导致该酶区别对待双脱氧核苷酸能力的降低，对未修饰的和修饰的DNA聚合酶用不同的dNTP对DyeDeoxy终止物比值进行反应，比较所得到的荧光片段的平均长度来确定修饰的DNA聚合酶是否地未修饰的酶更有效地利用DyeDeoxy终止物。

下列实施例提供一些试验，确定不同DNA聚合酶合成的双脱氧终止片段的带强度的均一程度。实施例13 用单链M13 DNA 5′³²P标记的40聚体复合物和凝胶电泳确

     定双脱氧核苷酸掺入的均一程度。

本实施例中在于单链M13 DNA模板上延伸的5′32P末端标记的引物上测量双脱氧核苷磷掺入的均一程度。三种活性可造成双脱氧终止片段的带强度差异。其一是特别针对某些序列的外切酶活性，用化学或遗传的方法选择性地除去该活性可避免它(见例如Tabor和Richardson，264生物化学杂志6447，1989)。其二是焦磷酸水解，在及应混合液中加入焦磷酸酶可方便地避免它，该酶可降解DNA合成时积累的焦磷酸，而焦磷酸是焦磷酸水解的必需底物。其三是双脱氧核苷酸掺入的序列特异性差异。带强度差异对DNA序列分析有害，降低所确定的DNA序列的准确度。设计本试验以确定不同DNA聚合酶，包括可能更有效地掺入双脱氧核苷酸的突变体DNA聚合酶，分成的带的强度差异。

本实施例的引物，模板和反应条件与实施例6和7所述相同。模板是实施例3所述的M13 mGP1-2单链DNA，引物是实施例3所述的40聚体。所用的反应条件如反应的缓冲液，pH，盐和温度对所检测的DNA聚合酶最优。优选地镁是反应混合液中唯一的金属离子(即反应进行时无附加的锰离子)。选择DNA聚合酶浓度，使引物在10分钟反应中被延伸并掺入双脱氧核苷酸而终止。对特定待检测DNA聚合酶调整dNTP对ddNTP的比值，使平均片段大小约为100-300核苷酸。ddCTP是用于检测均一程度的优选ddNTP，因为由该双脱氧核苷酸终止的片段倾向于强度差异最多(见例如Tabor和Richardson 86美国科学院进展4076，1989)。凝胶电泳，放射自显影，以用通过扫描凝胶或磷成像仪分析法分析带强度的描述见实施例6。电泳进行到凝胶底部的片段大约55核苷酸长为止(溴酚蓝已走出凝胶底部，染料二甲苯蓝(cyanol)距凝胶底部约8cm)。

对一给定的ddNMP终止片段系列，例如一系列ddCMP终止片段，确定距凝胶底部的前20个片段，优选用磷成像仪分析。备选地用成像密度仪扫描放射自显影图，确定前20个片段的相对强度。然后如实施例6对这些强度作数值分析确定其差异。例如可用Macintosh程序Kaleidograph 3.0版(Synergy Software)用数值作图。得到的图用Kaleidograph中指数衰减线库子程序拟合成指数衰减曲线。数据的相关系数R²用Kaleidograph库子程序计算。这样测量带强度的差异。将用新DNA聚合酶得到的R²与用已知DNA聚合酶得到的R²相比，已知DNA聚合酶例如有镁或锰存在的-28 T7 DNA聚合酶(Sequenase 2.0版，美国生物化学品公司)(见Tahor和Richardson 265生物化学杂志8322，1990)，大肠杆菌DNA聚合酶I(Klenow片段或有F762Y突变的Klenow片段)或Taq DNA聚合酶(野生型或突变体F667Y)。用这些已知DNA聚合酶得到的R²值作标准，来比较新DNA聚合酶的均一程度。实施例14 用单链M13 DNA-未标记引物复合物和凝胶电泳确定[a-³²P]ddNMP掺入的均一程度

本实施例中用退火到单链M13 DNA模板上的未标记引物和在[a-³²p]ddATP存在下进行DNA合成来测量双脱氧核苷酸掺入的均一程度。测量双脱氧核苷酸终止的片段时实施例13描述的试验比本试验要好，因为前者更适于用高浓度的ddNTP，而高浓度ddNTP为强烈区别对待ddNTP的酶，如大肠杆菌DNA聚合酶I，Taq DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶Y526F所必需。本试验最适用于有效掺入双脱氧核苷酸的酶，如T7 DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I F762Y和Taq DNA聚合酶F667Y。本实施例的引物，模板和一般反应条件与实施例8所述相同，但有下列不同。模板是实施例3括述的M13 mGP1-2单链DNA，引物是实施例3描述的40聚体。所用的反应条件如反应的缓冲液，pH，盐和浓度对所检测的DNA聚合酶最优。优选地镁是反应混合液中唯一的金属离子(即反应进行时无外加的锰离子)。反应用50M dGTP，dCTP和dTTP以及不同浓度的dATP和[a-³²P]ddATP进行。选择dATP和[a-³²P]ddATP的浓度，使约100核苷酸长的片段放射性最强。其它方面如凝胶电泳和放射性片段的分析均与实施例13的描述相同。实施例15 用单链M13 DNA-荧光标记的引物复合物和凝胶电泳确定双脱氧核苷酸掺入的均一程度

本实施例中反应如实施例11所述进行。模板是实施例3描述的M13mGP1-2单链DNA，引物是实施例3描述的40聚体。所用反应条件如反应缓冲液，pH，盐和温度对所检测的DNA聚合酶最优。优选地镁是反应混合液中唯一的金属离子(即反应进行时无附加的锰离子)。选择DNA浓度使在10分钟反应中大多数引物被延伸并且掺入双脱氧核苷酸终止。对特定的DNA聚合酶调节dNTP对ddNTP的比值使平均片段长度约为100-200核苷酸。ddCTP是优选的ddNTP，因为该双脱氧核苷酸终止的片段倾向于强度差别最多(见例如Tabor和Richardson 86美国科学院进展4076，1989)。确定引物的前50个双脱氧终止片段的强度(约200核苷酸长)，如实施例13所述做数值分析。对所检测的DNA聚合酶确定其相关系数R²，与由实施例13所述的已知DNA聚合酶得到的R²相比较。备选地，确定前50条带的高度，计算相邻带的高度比用作差异的量度；将用所检测的DNA聚合酶进行的反应得到的这些比值的最大值与平均值同用实施例13指述的已知DNA聚合酶进行的反应得到的相应值做比较。实施例16 凝胶电泳确定荧光双脱氧核苷酸的掺入的均一程度

本实施例中如实施例12所述进行反应。为确定某一特定DNA聚合酶DyeDeoxy终止物的掺入均一程度，选择dNTP浓度和特定的DyeDeoxy终止物，得到平均长100-200核苷酸的荧光标记的片段。对引物的10至40片段确定荧光强度(靠近荧光标记的引物的前10个片段忽略)。然后如实施例13所述对片段做数值分析，数据拟分成指数衰减曲线的相关系数R²定义3平均差异。所得R²值与用实施例13所述的已知DNA聚合酶得到的R2值相比较。为确定DNA聚合酶中特定突变是否导致该DNA聚合酶产生的带差异变小，将该突变体DNA聚合酶得到的R2值与未修饰DNA聚合酶得到的R²值相比较。实施例17 用有效掺入双脱氧核苷酸DNA聚合酶作DNA序列分析

以标准操作步骤用本发明的DNA聚合酶作DNA序列分析，调整dNTP对ddNTP的比值使得到的双脱氧终止片段的平均长度适于电泳分离。对于大肠杆菌DNA聚合酶I大片段的突变体，“Klenow片段F762Y”，反应基本按修饰T7 DNA聚合酶的反应进行，描述见Tabor和Richardson美国专利4,795,699号，Tabor和Richardson，84美国科学院进展4767，1987和SEQUENASE手册，“SEQUENASE DNA测序详细操作规程”第三版，美国生物化学品公司。由于Klenow片段F762Y掺入双脱氧核苷酸的效率比修饰的T7 DNA聚合酶约高5倍，因而与对修饰T7 DNA聚合酶推荐的标准混合液(Sequenase手册，引述见上)相比，其延伸一终止混合液中ddNTP的浓度石降5倍。

用热稳定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶F667Y作DNA序列分析的描述见Innis等85，美国科学院进展，9436，1988，作下列修饰。虽然lnnis等推荐dNTP/ddNTP比值为1∶6 dGTP∶ddGTP，1∶32dATP∶ddATP，1∶48 dTTP∶ddTTP和1∶16 dCTP∶ddCTP，孝虑到Taq DNA聚合酶F667Y比野生型Taq DNA聚合酶更有效地利用4种ddNTP约3,000～8,000倍，这些比值应作调整。因此Taq DNA聚合酶F667Y的延伸一终止反应应含有100M 4dNTP和0.1-5M每种ddNTP，应根据DNA序列测定最优时所需的平均片段长度调整每种ddNTP的精确量。DNA测序及应和变性凝胶电泳的其它方面描述见lnnis等(引述见上)。实施例18 用有效掺入双脱氧核苷酸的热稳定性DNA聚合酶做循环

     DNA序列分析

用热稳定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶667Y进行循环DNA测序的描述见Carothers等，7生物技术494，1989，只是(1)4种脱氧/双脱氧NTP混合物含250M的所有4种dNTP和0.1-10M的ddGTP，ddATP，ddTTP，或ddCTP，根据最优确定DNA序列所需平均片段长度实施确定每种ddNTP的精确值。(2)用Taq DNA聚合酶F667Y而非TaqDNA聚合酶，DNA聚合酶的单位数与Carothers等(引述见上)推荐的相同。(3)反应混合液含10ng无机焦磷酸酶以抑制焦磷水解，否则DNA聚合酶在特定序列处的表现区别对待能力增加，降低带强度的均一程度(Tabor和Richardson，265生物化学杂志8322，1990)。优选地该焦磷酸酶纯化自嗜热生物，如Thermus thermophilus(Hohne等，47，生物医学和生化学报(Biomed.Biochim.Acta)941，1988)。实施例19 用修饰的Taq DNA聚合酶和荧光引物自动循环DNA测序

用热稳定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶F667Y和AppliedBiosystems Dye引物循环DNA测序是Applied Biosystems手册(部分号901482，Rev.B)描述方法的修饰。本方法与手册中的描述相同，但有下列修饰：(1)孝虑到Taq DNA聚合酶F667Y比Taq DNA聚合酶更有效地利用ddNTP，必须修饰dNTP/ddNTP混合物。用于Applied Biosystems列出的混合物处的新混合物如下：

dG/ddG混合物＝100M C⁷dGTP，dATP，dTTP和dCTP，以及0.05M ddGTP

dA/ddA混合物＝100M C⁷dGTP，dATP，dTTP和dCTP，以及0.3MddATP

dT/ddT混合物＝100M C⁷dGTP，dATP，dTTP和dCTP，以及0.25M ddTTP    

dC/ddC混合物＝100M C⁷dGTP，dATP，dTTP和dCTP，以及0.15M ddCTP

应根据应用改变ddNTP的浓度使特定大小范围的片段荧光强度最优。例如增大ddNTP的浓度会增大短片段的荧光。(2)用Taq DNA聚合酶F667Y而非Taq DNA聚合酶。在标准DNA聚合酶检测条件下两种酶的单位数相同。备选地可用相同数目的DNA聚合酶分子。(3)反应混合液含10ng无机焦磷酸酶以抑制焦磷水解，否则DNA聚合酶在特定序列的表现区别对待能力会增加，降低带强度的均一程度(Tabor和Richardson265生物化学杂志8322，1990)。优选地该焦磷酸酶纯化自嗜热生物如Thermus thermophilus(Hohne等，47生物医学和生化学报941，1988)。操作的其它方面与Applied Biosystems手册所述相同(引述见上)实施例20 用修饰的Taq DNA聚合酶和荧光染料终止物自动循环DNA

     测序

用热稳定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶F667Y和AppliedBiosystems DyeDeoxy终止物循环DNA测序是Applied Biosystems手册(部分号901497，Rev.E)中方法的修饰。本方法与手册中的描述相同，但有下列修饰：(1)手册中要求每个测序反应(201反应)中不稀释用11每种DyeDeoxy终止物。本实施例中终止物先稀释再加入测序反应混合液中，因为Taq DNA聚合酶F667Y将其掺入的效率比Taq DNA聚合酶高几百倍。在每个测序反应中加入11的各个下列溶液，而非11不稀释的终止物溶液：

DyeDeoxy G终止物     水中1至500倍稀释

DyeDeoxy A终止物     水中1至1,500倍稀释

DyeDeoxy T终止物     水中1至1,500倍稀释

DyeDeoxy C终止物     水中1至1,000倍稀释

这些稀释只是近似；每种DyeDeoxy终止物的精确稀释应依照引物待确定的DNA序列碱基数实验确定。(2)用Taq DNA聚合酶F667Y而非Taq DNA聚合酶。在标准DNA聚合酶检测条件下两种酶的单位数相同。备选地可用相同数目的DNA聚合酶分子。(3)反应混合液含10ng无机焦磷酸酶以抑制焦磷水解，否则DNA聚合酶在特定序列的表现区别对待能力会增加，降低带强度的均一程度(Tabor和Richardson 265生物化学杂志8322，1990)。优选地该焦磷酸酶纯化自嗜热生物如Thermusthermophilus(Hohne等，47生物医学和生化学报941，1988)。

由于本方法比以前的操作方法用的DyeDeoxy终止物少500倍，反应完全后DyeDeoxy终止物未掺入的问题不大。因此不必象AppliedBiosystems手册(引述见上)推荐得那样将样品过离心柱除去未掺入的DyeDeoxy终止物。而是样品乙醇沉淀，用5l去离子的甲醛和1l50mMEDTA，pH8.0悬浮起(taken up)，于90℃加热2分钟，根据373A的用户手册指导加样到Applied Biosystems 373A DNA测序系统中。有可能对于有效掺入DeyDeoxy终止物的DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶F667Y)，用乙醇沉淀来浓缩DNA测序反应不必要；优选地用高浓度引物和dNTP(见下)进行的DNA循环测序反应通过加入等体积去离子甲醛终止反应，于90℃加热2分钟，立即加样到Applied Biosystems 373A测序系统中。这样研究人员制备样品作DNA序列测定时就可省下大量时间。

上述操作方法起始时用相对低浓度的dNTP(7.5M dATP，dTTP，dCTP和37.5M dTTP)。循环DNA测序反应中dNTP用掉则dNTP浓度降低。这时dNTP浓度(小于7.5M)对大多数DNA聚合酶不能使DNA聚合酶活性最高。这样低浓度对以前的方法很必要，因为它们用的DNA聚合酶强烈地区别对待ddNTP，因而需要ddNTP对dNTP地值高。本发明用的DNA聚合酶对DyeDeoxy终止物区别对待要弱得多，因而可用高浓度的dNTP。例如在上述方法中用的dNTP和DyeDeoxy终止物的浓度可高10倍；即75M dATP，dTTP和dCTP，375M dITP，并如下稀释每种Dye Deoxy终止物：DeyDeoxy G终止物，水中1至50倍；DeyDeoxy A终止物，水中1至150倍；DeyDeoxy T终止物，水中1至150倍；DeyDeoxy C终止物，水中1至100倍。因而本实施例中DeyDeoxy终止物浓度仍比以前方法的低至少50倍。实施例21  用[³²P]ddAMP终止的DNA底物作外切酶检测

用HindIII消化天然(native)小牛胸腺DNA制备3′[³²P]ddAMP终止的DNA底物，反应混合液(50 l)含10g双链小牛胸腺DNA，40mMTris·HCl，pH7.5，10mM MgCl₂，5mM二硫苏糖醇，50mM NaCl，50g/ml牛血清清蛋白和10单位HindIII。于37℃温育60分钟后加入5l[a-³²P]ddATP(Amersham PB10235，＞5000Ci/mmol)和5单位Sequenase 2.0版(美国生物化学品公司，索引号(catalog number)70775)，混合液于20℃温育15分钟。反应混合液然后用等体积的苯酚∶氯仿∶异或醇(24∶24∶1)抽提一次，在1ml含20mM Tris·HCl pH7.5，2mM EDTA，100mMNaCl的Sephadex G loo柱(pharmaci)中分级分离，由外水体积洗脱的3′³²P标记的DNA比活约为500cpm/ng总DNA。

外切酶检测的反应混合液(901)含40mM Tris·HCl，pH7.5，10mM MgCl₂，10mM二硫苏糖醇，50mM KCl和1nmol 3′³²P标记的DNA。反应混合液还含有10ng酵母无机焦磷酸酶以去除痕量的焦磷酸因而阻止焦磷酸水解(pyrophosphorolysis)(Tabor和Richardson 265生物化学杂志8322，1990)。该混合液于20℃预温育1分钟，然后加入101适当的酶稀释液。于37℃温育指定时间后，加入301中白清清蛋白(10mg/ml)和30l三氯乙酸(100％w/v)终止反应。沉淀的DNA于0℃温育15分钟，然后离心12,000g 30分钟沉淀。测量100 l上清中的酸溶性放射性。一单位的3′[³²P]ddAMP-DNA外切酶活性在15分钟内催化1pmol[³²P]ddAMP酸溶解。

其它实施方案由下列权利要求包涵。

                            序列表(1)一般资料：

(i)申请人

     (A)姓名President&Fellows of Harvard College

     (B)街道17 Quincy Street

     (C)城市Cambridge

     (D)州  Massachusetts

     (E)国家United States of America

     (F)邮编02138

(ii)相关地址：

     (A)收信人Richard J.Warburg Lyon&Lyon

     (B)街道  633 West Fifh Street Suite 4700

     (C)城市  Los Angeles，CA 90071

     (D)国家  USA

     (E)邮编  90071

     (A)电话：(213)955-0440

     (B)电传：(213)489-1600    

     (C)电报：67-3510    

(iii)序列数：24        

(iv)发明名称：用于测序的具有修饰的核苷酸结合位点的DNA聚合

              酶

(v)计算机可读形式：

     (A)介质类型：3.5″盘，1.44Mb存贮量

     (B)计算机：  IBM PS/2 Model 50Z or 55SX

     (C)操作系统：IBM P.C.DOS(Version 3.30)

     (D)软件：    WordPerfect(Version 5.0)

(vi)当前申请数据：

(A)申请号：未给出

(B)提交日：(vii)在先申请数据：

      在先申请全部包括下述申请：TWO

      (A)申请号：              08/324,437

    (B)提交日：    17-OCT-1994

    (A)申请号：美国未给出

    (B)提交日：    10-NOV-1994(2)SEQ ID NO： 1的资料：

(i)序列特征：

     (A)长度：14

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线型

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     (B)类型：氨基酸

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(i)序列特征：

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(B)类型：氨基酸

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            5                   10(2)SEQ ID NO：18的资料：

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            5                   10(2)SEQ ID NO：19的资料：

(i)序列特征：

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             5                   10(2)SEQ ID NO：21的资料：

(i)序列特征：

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     (A)长度：14

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线型

(ii)序列描述：SEQ ID NO：23：Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Ile Phe Gly Val Leu Tyr Gly

            5                   10(2)SEQ ID NO：24的资料：

(i)序列特征：

     (A)长度：14

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线型

(ii)序列描述：SEQ ID NO：24：Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Tyr Gly Val Leu Tyr Gly

            5                   10