抗生素斯泰隆巴森

摘要

提供新型抗生素斯泰隆巴森H和I，其物理-化学特性如表1所示，它们是表现出对革兰氏阳性菌具显著效果的优异抗生素。

说明书

本发明涉及新的抗生素。具体地说，本发明涉及由假单胞菌属某菌种PBJ-5360-STR-1-21所产生的抗生素斯泰隆巴森(Stalobacin)H和I、产生该抗生素的微生物以及生产该抗生素的方法。

人们知道，一个具体抗生素的抗菌活性会因需对付的细菌的属性而有所不同，而抗生素的作用时常因抗性菌株的出现而有所降低。具多重抗药性的细菌的出现近年来已成为一个严重问题。因此，就需要开发新型且有效的抗生素来进行有效治疗。总而言之，许多革兰氏阳性菌(如葡萄球菌属、溶血性链球菌属等等)对抗生素具有抗性，而人们对开发一些对这些革兰氏阳性菌具高效力的新型抗生素一直需求颇高。

本发明提供了抗生素斯泰隆巴森，其选自由上述假单胞菌属某菌种PBJ-5360-STR-1-21所产生的抗生素斯泰隆巴森。这些抗生素为肽类抗生素，是由所述假单胞菌属某菌种PBJ-5360-STR-1-21产生的。斯泰隆巴森H和I(以下有时仅称作斯泰隆巴森)是通过培养上述假单胞菌属菌种以密切相关的类似物的混合物的形式而得到的。其抗菌活性比已知抗生素要强得多。斯泰隆巴森H和I具有如下列表1所示的物理-化学特性。

                        表1

斯泰隆巴森H和I的物理-化学特性：m.p.(℃)(作为钠盐)      斯泰隆巴森      斯泰隆巴森

                   235℃(dec.)      240℃(dec.)质子化的LSI-MS            1396             1325分子离子(m/z)IR(KBr)(cm^-1)         3374，1747，     3387，1747，

                1654，1597，1525 1651，1596，1527

UV(H₂O)            末端吸收         末端吸收

CD(H₂O)         〔θ〕₁₉₄-66980

                 〔θ〕₂₁₂＋9851  〔θ〕₂₀₆＋11530

                 〔θ〕₂₃₂－31520 〔θ〕₂₃₂－28660

                 〔θ〕₂₅₇＋4288  〔θ〕₂₅₇＋4749在HPLC^*中的滞留时         8.8              9.7

  间(分)

氨基酸分析

(摩尔比)

HyAsp¹⁾            HyAsp(1)          HyAsp(1)

  Asp                Asp(1)            Asp(1)

  Ser                Ser(1)            Ser(1)

HyIle²⁾            HyIle(1)          HyIle(1)

  Gly                Gly(1)            Gly(1)

  Ala                Ala(1)              …

^*柱：Develosil5C18，4.6i.d.x250mm

移动相：CH₃CN/2mMH₃PO₄(含50mM Na₂SO₄)＝43/57

流速：1ml/分

1)羟基天冬氨酸

2)羟基异亮氨酸

本发明的抗生素斯泰隆巴森除具有上述特性之外，还发现具有体内和体外的优异抗菌活性，特别是表现出对革兰氏阳性菌的有效作用。

因此，本发明的抗生素斯泰隆巴森表现出优异的活性，特别是对革兰氏阳性菌的较高活性，如表2所示。

给小鼠静脉内施用300mg/kg和500mg/kg的抗生素斯泰隆巴森，在急性毒性试验中未观察到死亡现象。

本发明的抗生素斯泰隆巴森H和I是通过培养假单胞菌属某菌种PBJ-5360-STR-1-21所产生的，后者是衍生自假单胞菌属某菌种PBJ-5360(BIKOKEN保藏号为10578，FERMBP-4342)的一个变种。上述培养过程产生了一种斯泰隆巴森混合物，是以一种常规方法在含有可同化的碳源、氮源和无机盐的液体培养基中以有氧方式进行的。根据下文实验2中所述的方法培养这种细菌，并参照“Bergey系统细菌学手册(Vol.1，1984)的描述来全面检验细菌的形态、培养物特性及理化特性，该细菌已被鉴定为上述的菌株。该菌株可经历自发性或人为性突变，只要这样的突变体保持着产生本发明的斯泰隆巴森的能力，它们就应该包括在本发明的范围之内，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，本发明也提供了能产生新型抗生素斯泰隆巴森H或I的假单胞菌属某菌种PBJ-5360-STR-1-21及其具有产生所述抗生素斯泰隆巴森之能力的突变体。假单胞菌属某菌种PBJ-5360-STR-1-21于1994年2月16日保藏于生物科学及人类技术国立研究所(Higashi1-1-3，Tsukubashi，Ibaraki Pref.Japan)，注册号为FERMP-14149，1994年4月28日该原始保藏物被转移到根据布达佩斯条约的国际保藏单位，注册号为FERM BP-4661。

此外，本发明还提供了经培养这样的菌株生产抗生素斯泰隆巴森H和I的方法。

在进行生产抗生素的常规培养中可采用普通的培养基组成和普通的培养条件。大体上讲，该培养基含有碳源、氮源和无机盐等等。如果必需的话，还可以加入维生素、前体等等。碳源的实例为葡糖、淀粉、糊精、甘油、糖蜜、有机酸等等，这些碳源可单独使用或以混合物形式使用。氮源的实例有大豆粉、玉米浆、肉羹、酵母萃、棉籽粉、胨、小麦胚、硫酸铵、硝酸铵等等，这些氮源可单独使用或以混合物形式使用。无机盐的实例有碳酸钙、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化镁、硫酸锌、氯化钴、各种磷酸盐等等。这些无机盐可在需要时加入到培养基中。可在适当的培养基中通过培养本发明的假单胞菌属某菌种PBJ-5360-STR-1-21来生产足够数量的抗生素斯泰隆巴森H和I，温度为20-35℃，优选为25-29℃，时间约为1-7天。如果必需的话，随后以常规方法从培养物中分离并提纯产物。所有这些程序都是本领域的技术人员所熟知的。

据信，本发明的抗生素斯泰隆巴森可用于治疗多种感染，特别是治疗由多重抗药性革兰氏阳性菌引起的感染，因为它们表现出体内和体外的显著抗菌活性。

图1显示斯泰隆巴森H的IR光谱。

图2显示斯泰隆巴森I的IR光谱。

图3显示斯泰隆巴森H的NMR光谱。

图4显示斯泰隆巴森I的NMR光谱。

下面通过阐述实施例和实验将更详细地说明本发明。实施例1(a)发酵步骤：

在2L的锥形烧瓶中入800ml培养基〔含1.0％葡糖、0.5％酵母萃(Difco)和自来水，用2N NaOH调至pH7〕，将其用假单胞菌属某菌种PBJ-5360-STR-1-21的种子菌株(保存在-80℃下的2ml管形瓶中)进行接种，对所生成的混合物进行震荡培养，条件为180rpm，震荡宽度70mm，温度28℃，时间22小时。将培养物(800ml)接种到30L罐式发酵器中的培养基〔20L，含有1.0％葡糖、0.4％酵母萃(Difco)，1.0％麦芽膏(Difco)、0.1％多胨(Nippon Seiyaku)和自来水，用2N NaOH调至pH7〕上，对所生成的混合物以200rpm进行搅拌培养，通氧速度为14L/分，内压为0.35kg/cm²G，温度28℃，时间21小时。

然后，将8L的这种培养物接种到250L罐中的培养基〔125L，含2.0％可溶性淀粉、2.0％粉状酵母、1.5％β-环糊精、0.5％橄榄油、0.3％MgCl₂·6H₂O、0.1％磷酸二氢钾、0.0008％防沫剂ADECANOL(Asahi Denka Kogyo)LG109和自来水，用2N-NaOH调至pH7〕上，培养所生成的混合物，通气速度为65L/分，内压力0.35kg/cm²G，搅拌速度为350rpm，温度28℃，时间72小时。(b)分离步骤：

向得自上述步骤的138L培养物中加入1.4L氯仿进行灭菌处理。然后，加入15L的Amberlite XAD-7(Organo)，将所生成的混合物以搅拌方式进行混合，时间3小时，使活性物质批量吸附到树脂上。利用#140筛目的不锈钢筛来回收树脂。用水冲洗树脂，置于玻璃柱(内径：20cm)中，用40L水、40L 30％的甲醇及15L 50％甲醇的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)冲洗，并用40L 60％甲醇的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗脱活性物质。

收集显示出对金黄色葡萄球菌JC-1具抗菌活性的级分(20L)，在真空中浓缩为3L。用3L乙酸乙酯冲洗浓缩物除去亲脂性物质。对含水层中的乙酸乙酯进行真空蒸发。活性物质被吸附在1L柱(内径6.5cm)中的Amberlite XAD-7(Organo)上，用2L水冲洗树脂。使用2L 30％的含水MeOH和3L 50％的含水MeOH进行洗脱。对所洗脱的级分进行HPLC分析，收集含有斯泰隆巴森的级分，用2N-HCl调至pH7.0，进行真空浓缩及冷冻干燥处理，得到了3890mg的粉末。(c)纯化步骤第一纯化步骤：

将从上述步骤中得到的1820mg粗粉末溶于60ml的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)中。对该溶液进行制备性高速液相色谱法处理，使用的是YMC ODS柱〔S-15/30μ，5.0×50cm，洗脱剂：乙腈/20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)。50mM硫酸钠＝40/60，流速：50ml/分，UV检测，210nm〕，得到含有作为主要成份的斯泰隆巴森H和I的级分(2.4L)。将该级分中的乙腈蒸馏掉，使残余物通过Diaion HP-20(Mitsubishi Kasei公司)柱。用水冲洗树脂，用60％的含水丙酮洗脱所吸附的组分。将洗脱液中的丙酮真空蒸馏掉，对残余物进行冷冻干燥处理，得到了126mg的粉末。第二纯化步骤：

对上述步骤中得到的粉末利用制备性高速液相色谱法进行提纯(条件如下)，得到斯泰隆巴森H和I。

将粉末(126mg)溶于7ml 50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。将每一步骤的15mg样品装入Asahipak ODP-90柱(内径21.5mm×300mm，洗脱液：20mM AcOH的乙腈溶液/20mMAcOH的水溶液＝40/60，流速：8ml/分，UV检测：220nm)，从144ml至184ml的级分中收集到斯泰隆巴森H，从216ml至288ml的级分中收集到斯泰隆巴森I。重复此分级分离，将所收集的级分用含水的IN-NaOH中和至pH7.0。将乙腈真空蒸馏掉，向残留物中加入NaCl以达到5％的NaCl浓度。用1N NaOH将所生成的混合物调至pH7.5，使之通过MCI GEL CHP 20P柱(75-150M，Mitsubishi Kasei)，该柱事先已用5％的NaCl水溶液平衡过。用水冲洗柱并用70％的含水MeOH洗脱。将洗脱液中的MeOH真空蒸馏掉，对残留物进行冷冻干燥处理，得到12mg的纯斯泰隆巴森H和38mg的纯斯泰隆巴森I。

由实施例1得到的斯泰隆巴森H和I的物理化学特性如表2所示。斯泰隆巴森H和I的IR光谱分别见图1和图2，斯泰隆巴森H和I的NMR光谱分别见图3和图4。实验1体内和体外的抗菌活性

1)体内抗菌活性

利用琼脂稀释法测定了由实施例1中得到的抗生素H和I的体内抗菌活性。结果见表2。

                                 表2

                                斯泰隆巴森(μg/ml)，

                                10⁶cfu/ml)

                                H             I革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌FDAJC-1               0.1           0.05粪链球菌SR1004金黄色葡萄球菌3626(MRSA)            0.2           0.2

                               0.1           0.1

2)体外抗菌活性：

对斯泰隆巴森I的体外抗菌活性进行了测定。给小鼠进行腹膜内感染菌注射。感染后1小时，在皮下施用试验化合物。在感染后第7天，根据存活比计算出ED₅₀值。根据琼脂稀释法来确定MIC。结果见表3。

表3

斯泰隆巴森I对全身性感染小鼠的保护作用

                     ED₅₀(mg/kg)      MIC(μg/ml)

                     斯泰隆巴森I       斯泰隆巴森I金黄色葡萄球菌SR3637(H-MRSA)                 0.12              0.012I型肺炎链球菌             0.046             0.006粪链球菌SR1004            1.50              0.2实验2 PBJ-5360和PBJ-5360-STR-1-21的细菌学特性

本发明的PBJ-5360-STR-1-21是作为上述PBJ-5360菌株的突变体得到的。PBJ-5360分离自日本Kyoto的土壤。本发明的PBJ-5360-STR-1-21的各种细菌学特性如下。培养原则上在28℃条件下进行。A.形态学：

其为革兰氏阴性杆菌。大小为0.3-0.5(μm)×0.8-1.3(μm)。其借助于一个或多个极生鞭毛而剧烈运动。B.培养物特性

1)在肉浸培养基中的培养：

几乎观察不到有细菌的生长。在试管底部略有米白色半透明沉淀物生成。

2)肉浸琼脂穿刺培养：

观察到沿穿刺线的线状或小乳头状生长。均未观察到气体的逸出和色素的形成。在表面似有微红色稀疏的菌斑，但该菌斑随着时间的推移而变为半透明及淡褐色，并在几处观察到疣状突起。其为需氧细菌。

3)肉浸琼脂斜面培养：

细菌生长并不迅速，两天后在28℃条件下开始生长(肉眼观察到)。细菌以线形生长，其菌斑为半透明及淡黄色，扁平突起具有斑点。其周边为整个外周界。而后，菌斑多以线状或具光泽的疣状而生长。这样，得到一湿润、略红、半透明的褐色菌斑。其周边为波浪状或长波浪状。未观察到有任何气体或色素的生成。

4)肉浸明胶穿刺培养：

培养在室温(22-25℃)下进行。明胶略有液化。

5)在肉浸琼脂平板培养基上的培养

细菌的生长并不迅速。两天后，在28℃的条件下可见有菌落。菌落起初很小、斑点状、半透明及褐色、具整个外周界。菌落小得观察不到其突起。而后，菌落以斑状或环状生长，并具整个外周界，其突起为扁平或凸环状。菌落为半透明及褐色、具光泽。没有气体或可溶性色素生成。

6)石蕊牛乳培养的特性：

没有酸形成，有胨化作用发生，但反应始于14天后，因而，反应极为缓慢。无气体生成。C.生理及生化特性

1)过氧化氢酶试验：阳性

2)氧化酶试验：阳性

3)OF试验：阴性(示碱性)

4)溶血试验：阳性(弱)

5)5℃条件下的生存力：阴性

6)H₂S的生成：阴性

7)硝酸盐的生成：阳性

8)反硝化作用：阴性(虽然无氮气生成，但其似乎还原了NO₂^-)

9)柠檬酸利用：阴性(Christensen培养基和Simons培养基)

10)在NAC琼脂培养基上的生长：阴性(不能生存)

11)吲哚的生成：阴性

12)优-普二氏反应(v.p.试验)：阴性

13)甲基红试验：阴性

14)精氨酸二水解酶试验：弱阳性

15)赖氨酸脱羧酶试验：阳性

16)鸟氨酸脱羧酶试验：阳性

17)七叶苷水解作用：阴性

18)DNase试验：阴性

19)淀粉水解作用：阴性

20)ONPG试验(在37℃下培养)：阴性

21)酰胺酶试验：阳性

22)磷酸酶试验：阳性

23)几丁质水解作用：阴性

24)蔗糖中果聚糖的生成：阳性

25)糖中酸和气体的生产能力：从下列13种糖中没有酸和气体的生成：葡糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、鼠李糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖和甘露醇

26)细胞中聚-β-羟丁酸的积累：阴性

27)碳源的利用：可使用含矿物质、葡糖和2-酮基-葡糖酸钙作为生成细胞的唯一碳源。在这种情况下，似乎并不需要生长所需的特定维生素。另一方面，并未利用D-(+)-海藻糖、DL-精氨酸、牻牛儿醇、β-丙氨酸、L-缬氨酸和肌醇。

28)G＋C摩尔％(HPLC法)：60.4％(A＋T摩尔％＝39.6％)

从以上的试验结果看，PBJ-5360-STR-1-21是一种需氧的革兰氏阴性杆菌，其可以利用一个或多个极生鞭毛在液体培养基中活跃地运动。其过氧化氢酶呈阳性并含有氧化酶。OF试验为阴性(显示出碱性)。鉴于这些观察。显然该细菌隶属于Pseudomonadaceae科的假单胞菌属。

当发明人将以上特性与在其细胞中不能积累聚-β-羟丁酸(pHB)的细菌复合体的特性〔这些复合体参见Bergey系统细菌学手册Vol.1(1984)有关“假单胞菌属”的论述〕相比较时，本发明人未发现任何具有与上述特性一致或类似特性的细菌。看来该细菌是假单胞菌属中一个极不寻常的菌株，因为其可以水解精氨酸、脱羧赖氨酸和鸟氨酸。60.4％的G＋C摩尔％值表明该菌株隶属于假单胞菌属中具有较低G＋C值的类群。因此，鉴于上述各种特性，本细菌已被鉴定为假单胞菌属某菌种PBJ-5360-STR-1-21。这些特性与亲本菌株PBJ-5350的特性是一致的。