西姆瓦什坦叮的生化纯化

摘要

在直接甲基化Lovastatin来合成Simvastatin中，通过使用能够水解2-甲基丁酰氧基侧链的细菌或真菌或这类微生物的突变体或从其中得到的无细胞提取液或从其中得到的水解酶来处理而将剩余的Lovastatin、Lovastatin酸或其盐进行选择性水解，得到7-[1′、2′、6′、7′、8′、8a′(R)-六氢-2′(S)，6′(R)-二甲基-8′(S)-羟基-1′(S)萘基]-3(R)，5(R)-二羟基庚酸，即三醇酸或三醇盐，其在内酯化成为内酯形式之前或之后很容易与Simvastatin分离。该方法产生了高收率和高纯度的Simvastatin。

说明书

本发明涉及将Lovastatin生物合成转化为7-[1′，2′，6′，7′，8′，8a′（R）-六氢-2′（S），6′（R）-二甲基-8′（S）-羟基-1′（S）-萘基]-3（R），5（R）-二羟基庚酸，即“三醇酸”，它是在由Lovastatin合成Simvastatin中通过微生物的水解得到的，这种方法便于将Simvastatin从未反应的Lovastatin原料中分离和离析出来。该方法使用能够水解Lovastatin的2-甲基丁酰氧基侧链的细菌或真菌，或使用由其中衍生而来的这类微生物的突变体或水解酶。

所说的三醇酸和它的内酯形式是本技术领域中已知的，并且是3-羟基-3-甲基谷氨酰基-辅酶A（HMG-CoA）还原酶（包含在胆固醇生物合成中的一种酶）的抑制剂。

Lovastatin盐成为三醇盐的选择性转化可用于在由Lovastatin生产Simvastatin的过程中分离未反应的Lovastatin和Simvastatin。Lovastatin酸在8′位上具有2-甲基丁酰氧基侧链，并且将其与在8′位上具有2，2-二甲基丁酰氧基侧链的新形成的Simvastatin酸分离是困难的。现申请人已发现，为了形成三醇盐，使用来自微生物的水解酶，采用本发明的方法而进行的由Lovastatin酸盐的2-甲基丁酰氧基侧链的选择性分裂结果形成了更容易分离的混合物和纯度更高的Simvastatin产物。上述的衍生物包括真菌，例如Clonostachys  compactiuscula（ATCC38009和ATCC74178），Monascus  ruber，Mortierella  isabellina，Emericella  unguis，Diheterospora  chlamydosporia，Humicola  fuscoatra，Dechotomomyces  cejpii，Neocosmospora  africana，Xylogone  sphaerospora，Torulomyces  ragena，Thielavia  fimeti，Aspergillus  unguis，卷枝毛微（Mucor  circinelloides），腐皮镰孢（Fusarium  solani），产黄青霉（Penicillium  chrysogenum），棒曲霉（Aspergillus  Clavatus），Scopulariopsis  communis，Gilmaniella  humicola，Mucor  bainieri，Tricharus  spiralis和chaetomium  cochliodes，或细菌，特别是放线菌类例如白浅灰链霉菌（Streptomyces  albogriscolus），寡生孢链霉菌（Streptomyces  paucisporogenes），吸水链霉菌（Streptomyces  hygroscopius），产绿色链霉菌（Streptomyces  viridochromogenes），排孢游动单孢菌（Planomonospora  parontospora）和Kibdelosporangium  aridum。

本发明涉及的是用作抗血胆甾醇过多制剂的HMG-CoA还原酶的抑制剂的领域，现在相当确定的是，血胆甾醇过多是在心血管疾病特别是粥样硬化的发展阶段的重要危险因素。能够抑制HMG-CoA还原酶的化合物干扰和限制胆固醇的生物合成，并且以上述的方法起抗血胆甾醇过多制剂的作用。

正如上面已叙述的那样，三醇酸和它的内酯形式是已知化合物。以内酯形式的三醇酸，例如描述在Endo，公开的日本专利申请86-13798（1986）中，其中它是通过Monascus  ruber的发酵来生产的，并且也陈述了其具有还原血胆固醇含量的能力的论证。

Lovastatin和Simvastatin作为HMG-CoA还原酶抑制剂也是本技术领域已知的化合物。这两种化合物的不同在于Lovastatin在8′位上具有2-甲基丁酰氧基侧链和Simvastatin具有2，2-二甲基丁酰氧基侧链。

虽然Simvastatin已由Lovastatin合成出来，但由Simvastatin和Lovastatin的混合物中将其分离并纯化一直是困难是。该两种化合物（这两种化合物的不同点只是一个甲基）之间在结构上的相似性使得高压液相色谱（HPLC）分离进行困难，这是因为这两种化合物具有如此相似的保留时间。为从Simvastatin和Lovastatin的混合物中分离出Simvastatin所使用的一种分离方法是使用碱性水解如用氢氧化钠（NaOH）或氢氧化钾（LiOH）将未反应的Lovastatin转化为三醇酸或二醇内酯。然而，这种碱性水解仅水解一定百分率的Lovastatin，未反应的Lovastatin作为最终Simvastatin产物的杂质而留下。碱性水解的另外的问题是Simvastatin的部分水解，于是便减少了所需的Simvastatin产物的收率。本发明提供了以较高的纯度和在没有伴随收率损失的情况下从Simvastatin和Lovastatin的混合物中分离Simvastatin的方法。

Komagata等人[J.Antibiotics，39，1574-77（1986）]描述了将Compactin（ML-236B）酶水解转化成8-羟基类似物（ML-236A），其中除去了正如在本发明中所述的相同侧链。在经试验的1600种真菌菌株中，发现有59种对催化该水解反应是有效的，并且，Emericella  unguis表现出最有效的活性。

Endo[公开的日本专利申请85-176595（1985）]描述了与上述的Komagata等人相同的转化，但是，另外还包括转化“monacolin  K”（其为Lovastatin）成为“monacolin  J）（其为本发明中所述的三醇酸）。认为特别有用的霉菌是Mortierella  isabellina，Emericella  unguis，Diheterospora  chlamydosporia，Humicola  fuscoatra，Dichotomomyces  cejpii，Neocosmospora  africana，Xylogone  Sphaerospora，Torulomyces  ragena和Thielavia  fimeti。

欧洲专利公开EOP486153认为Clonostachys  compactiuscula  ATCC38009能够转化Lovastatin酸成为三醇酸。这种相同的菌株已用美国型培养收集（American  Type  Culture  Collection）作为ATCC74178而再存储。

通过天然的2（S）-甲基丁酰氧基侧链的C-甲基化可将Lovastatin转化成为更活泼的HMG-CoA还原酶抑制剂以便得到Simvastatin。通过适合于分子的官能度的任何已知方法可以完成C-甲基化。

一种用于将2（S）-甲基丁酰氧基侧链直接进行C-甲基化的方法描述于美国专利4，582，915中。这种方法详述于图解Ⅰ和随之进行的说明中。

图解Ⅰ

图解Ⅰ（续）

其中：

M为碱金属盐，优选钾盐;

X为卤素，如氯、溴或碘，优选溴或碘;

M+₁为来自锂、钠或钾的阳离子，优选锂;及

R¹和R²为下述基团：

1）独自地为C_1-3烷基，或

2）R¹和R²与它们连接的氮原子一起形成5元或6元杂环如吡咯烷或哌啶，优选为吡咯烷。

在通过将Lovastatin直接进行甲基化而形成Simvastatin的方法中，该Lovastatin内酯化合物首先被转化成二羟基羧酸的碱金属盐，优选为钾盐。虽然用于制备干盐的任何方法会足以满足需要，但合适的是，将基本上为化学计算量的氢氧化钾水溶液加入到在含有少量的C_1-3链烷醇（优选异丙醇、乙醇或甲醇）的烃类溶剂（如苯、甲苯或环己烷）的内酯原料的溶液中，或者，在含有或不含有加入链烷醇的四氢呋喃（THF）中，搅拌几分钟至约1小时，最后在真空中浓缩至干。该剩余物经严格干燥，例如通过与环己烷、甲苯或干燥的四氢呋喃[优选是非常干燥（少于0.08mg>2O/ml）的四氢呋喃]的共沸蒸馏而进行的干燥。

将干燥的碱金属盐溶于醚溶剂（如四氢呋喃、乙醚、1，2-二甲氧基乙烷）中，冷却到-80℃至-25℃，并用过量的强碱性如碱金属酰胺处理，其中，所说的碱金属为锂、钠或钾（优选锂），且所说的酰胺为处于干燥的惰性环境下的醚溶剂中的二乙基酰胺、吡咯烷、二甲基酰胺或二异丙基酰胺。在-80°到-25℃优选-35°至-30℃下，约2至8小时优选约2小时之后，将卤代甲烷如溴代甲烷、氯代甲烷或碘代甲烷，优选溴代甲烷或碘代甲烷加入到该混合物中，同时保持低温。如果仍然剩下明显多的原料量，那么可重复进行所述的用强碱和卤代甲烷处理的步骤。0.5至约3小时后，随之最后加入卤代甲烷，通过向其中加入过量的水将该反应混合物骤冷。

接着进行上述的直接甲基化，为了达到最终产物提纯的目的使用NaOH或LiOH试图将未反应的Lovastatin转化成为三醇酸或二醇内酯。然而，这种碱性水解仅使很少百分含量的Lovastatin进行水解。因此，未反应的Lovastatin仍作为最终Simvastatin产物的杂质而存在。此外，碱性水解也使Simvastatin进行了水解，于是减少了所需的Simvastatin产物的收率。当接着进行水解时，这时使Simvastatin或其盐形式的开环的酸形式通过加热或酸催化内酯化作用而转化成内酯，并通过结晶法进行分离和提纯。

本发明涉及使用真菌或细菌以高纯度和高收率地从Simvastatin和Lovastatin的混合物中纯化和分离Simvastatin的方法，上述的真菌和细菌能够选择性水解Lovastatin的2-甲基丁酰氧基侧链成为6（R）-[2-8（S）-羟基-2（S），6（R）-二甲基-1′，2′，6′，7′，8′，8a′（R）-六氢萘基）乙基]-4（R）-羟基-3，4，5，6-四氢-2H-吡喃-2-酮，即三醇酸或相应的二醇内酯。该三醇酸或二醇内酯通过常规方法如结晶法、高压液相色谱法或其他色谱方法很容易从Simvastatin（或Lovastatin酸）中分离出来。本发明特别是用于在由Lovastatin合成Simvastatin中从Simvastatin中除去未反应的Lovastatin。

本发明的方法可以以它们的内酯形式或其酸形式来分离Simvastatin和Lovastatin的混合物。因为Lovastatin和Simvastatin的酸形式比其内酯形式更能溶于含水系统中，因此使用酸形式是优选的。

一般来说，Lovastatin和Simvastatin将以盐形式使用。当应用于本发明的该原料、中间产物和最终产物时，除非另有说明，所说的术语“酸”、“开环酸”和“酸形式”同样也包括它的任何适合的盐形式。使之有可能具有良好溶解性并且不干扰在进行特定反应中所经受的其他条件的任何盐都是容许的。可使用例如，碱金属盐如锂、钠和钾盐;碱土金属盐如钙或镁盐;或其他金属的盐如铝、铁、锌、铜、镍或钴盐;由碱性氨基酸所形成的氨基酸盐如精氨酸、赖氨酸、α，β-二氨基丁酸和乌氨酸盐;胺盐如叔辛基胺、二苄胺、乙二胺、吗啉和三（羟甲基）氨基甲烷的盐;或铵盐。可使用且优选的是Lovastatin酸的碱金属盐（Li、Na和K盐）和铵盐形式。特别优选的是钾和铵盐的形式。

为方便起见，对于Lovastatin酸、三醇酸、它的内酯形式和Simvastatin的结构式分别以式1、2、3和4列出如下：

1  Lovastatin酸                     2  三醇酸

3  二醇内酯                       4  Simvastatin

其中：

M³选自如下：

a）H，

b）碱金属盐如Li、Na或K盐，

c）碱土金属盐如Ca或Mg盐，

d）其他金属盐如Al、Fe、Zn、Cu、Ni或Co盐，

e）由碱性氨基酸所形成的氨基酸盐如精氨酸、赖氨酸、α，β-二氨基丁酸或乌氨酸盐，

f）胺盐如叔辛基胺、二苄胺、乙二胺、吗啉或三（羟甲基）氨基甲烷的盐，和

g）铵盐。

正如已叙述的那样，由于溶解性的原因，已发现最好使用以其开环或酸形式的Lovastatin和Simvastatin的混合物，并且为了达到这一目的，优选的是Lovastatin的铵、钾、钠和锂盐形式。

用于本发明方法中的真菌是在Simvastatin存在下可选择性分裂Lovastatin的2-甲基丁酰氧基侧链的那些真菌。能够水解Lovastatin侧链的真菌种属有Clonostachys，Emericella，Diheterospora，Humicola，Dichotomonyces，新赤壳属（Neocosmospora），帚霉属（Scopulariopsis），Xylogone，Torulomyces和Thievela。特别有用的真菌包括：Clonostachys  compactiuscula，Monascus  ruber，Mortierella  isabellina，Emericella  unguis，Diheterospora  chlamydosporia，Humicola  fuscoatra，Dechotomomyces  cejpii，Neocosmospora  africana，Xylogone  sphaerospora，Torulomyces  ragena，Thielavia  fimeti，Aspergillus  unguis，卷枝毛微（Mucor  circinelloides），腐皮镰孢（Fusarium  solani），产黄青霉（Penicillium  chrysogenum），棒曲霉（Aspergillus  clavatus），Scopulariopsis  communis，Gilmaniella  humicola，Mucor  bainieri，Tricharus  spiralis和chaetomium  cochliodes。特别优选的真菌为Clonostachys  Compactiuscula，Humicola  fuscoatra，Neocosmospora  africana，Scopulariopsis  communis和Xylogone  sphaerospora。最优选的菌株为Clonostachys  compactiuscula（ATCC74178或ATCC38009）。

用于本发明方法中的细菌是在Simvastatin存在下可选择性分裂Lovastatin的2-甲基丁酰氧基侧链的那些细菌。

能够水解Lovastatin侧链的放线菌类的种属有链霉菌属（Streptomyces），游动单孢菌属（Planomonospora）和Kibdelosporangium。特别有用的细胞包括：白浅灰链霉菌（Streptomyces  albogriscolus），寡生孢链霉菌（StreptomycesPaucisporogenes），吸水链霉菌（Streptomyces  hygroscopius），产绿色链霉菌（Streptomyces  Viridochromogenes），排孢游动单孢菌（Planomonospora  Parontospora）和Kibdelosporangium  aridum。

用微生物本身，或其突变体，或由其中得到的无细胞提取液，或由无细胞提取液（或是真菌或细菌在其中生长的废弃的无细胞液体培养基或培养基）提纯的水解酶可处理Lovastatin和Simvastatin或其酸的混合物。

术语“突变体”指的是一种有机体，在该有机体中，在其基因组内的某些基因（或它的DNA的调节部位）被修饰，剩下的该基因或多种基因具有担负着该有机体将Lovastatin酸水解成为三醇酸的功能性的和遗传性的能力。本发明范围内的突变体具有与亲代菌株的那些突变体基本相同的特征，并且能够水解Lovastatin2-甲基丁酰氧基侧链。

由微生物的培养基或其突变体产生的酶可以各种任何方法与Simvastatin和Lovastatin的混合物接触，其中所有这些对于本技术领域中的普通技术人员都是显而易见的。所有这些都是在如本发明定义的术语“处理”所定义的范围内。例如，可使用全部发酵的液体培养基，并且按照这种方法，可简单地将Simvastatin和Lovastatin的混合物加到所产生的微生物的发酵培养基中，并回收纯的Simvastatin产物。

变化上述全部液体培养基的方法是其中如上所述的产生微生物的发酵培养基的方法中的一种。但是为了诱导水解活性，加入小浓度（0.5至2.5g/L，优选1.0至2.0g/L）的Lovastatin酸。然后，通过离心或过滤来采集细胞体，并且以小片或菌丝块将其回收，它们可立即使用或被冷冻为以后使用。随后，可将所说的小片或菌丝块直接加入到通过甲基化由转化Lovastatin成为Simvastatin的过程中而产生的Simvastatin和Lovastatin的混合物中。另一种方法是，可部分纯化Lovastatin和Simvastatin的混合物，然后，使之与上述的微生物培养基的冷冻小片相接触。

全部真菌的细胞都是活着的是不必要的，同样可能的是使用死细胞，例如已被丙酮干燥的那些细胞。

可能的是，使用由那些全部细胞培养基得到的粗均浆作为全部细胞的替换物，从粗均浆分离水解酶本身和使用基本上纯化的水解酶也是可能的。

当微生物分泌水解酶而进入发酵/培养基中时，使用分离的酶是可能的。

使水解酶与Simvastatin和Lovastatin原料的混合物相接触的方法可分批进行，或者可以连续的方法进行。可以各种方法改变这些反应物本身相接触的方式，以保持工艺技术的进步性。因此，对于水解酶而言，可使用固相酶柱，使Simvastatin和Lovastatin的混合物通过该固相酶柱。这种工艺技术的另一实例是涉及膜式反应器。反应物相接触的优选方法是通过上述的固相酶柱的方法或使用纯化的酶制剂。

下面进一步陈述的操作实施例描述了通常所使用的方法，以便证明，在Simvastatin存在下，将污染的Lovastatin进行酶水解成为三醇酸，以达到高纯度的Simvastatin的程度。然而，对于工业生产来说，不必建议使用这些操作实施例中的一些方法。

本发明所使用的从Simvastatin和Lovastatin的混合物中分离和提纯Simvastatin的方法示于图解Ⅱ中。

将Simvastatin和Lovastatin内酯的混合物转化成相应的开环酸的混合物，其方法最好是用在含有少量的C_1-3链烷醇（优选异丙醇、乙醇或甲醇）的烃类溶剂（如苯、甲苯或环己烷）中的基本上为化学计算量的碱金属氢氧化物（如氢氧化钾或氢氧化钠）的水溶液处理，同时搅拌几分钟至约1小时。然后，萃取该底物进入含水介质中，该含水介质为：例如如下缓冲剂：TRIS（三（羟甲基）氨基甲烷）、甘氨酸、TES（N-三[羟甲基）甲基氨基]-2-羟基-丙磺酸）、磷酸钠、MOPSO（3-[N-吗啉代]-2-羟基丙磺酸）、BIS-TRIS>

采用酸催化或加热催化方法进行内酯化反应，例如，采用在室温下在含有7mM甲磺酸的乙酸异丙酯（IPAC）中搅拌2小时的方法进行内酯化反应。生成的Simvastatin内酯和二醇内酯可用高压液相色谱（HPLC）或结晶法分离，得到基本纯的Simvastatin。

使用含有0.01-1.0%磷酸或三氟乙酸或其它合适酸的含水组分和包括乙腈、甲醇和乙醇的合适的有机组分的有机-含水混合物作为流动相进行反相HPLC。

Simvastatin也可从三醇酸/二醇内酯中分离出来，并通过从乙酸乙酯、乙酸异丙酯和甲醇中结晶而提纯。

图解Ⅱ

图解Ⅱ（续）

也可将Lovastatin酸进行酶催化水解成三醇酸的反应用于通过直接甲基化Lovastatin来制备Simvastatin的方法中。这个全过程示于图解Ⅲ中。

在通过直接甲基化Lovastatin以生成Simvastatin的方法中，先将Lovastatin内酯化合物转化成碱金属盐，优选二羟基羧酸的钾盐。虽然制备干盐的任何可能的方法都可以使用，但是方便的方法是，将基本化学计算量的氢氧化钠水溶液加入到内酯原料的烃溶剂如苯、甲苯或环己烷的溶液中，该溶液含有少量的C_1-3链烷醇，优选异丙醇、乙醇或甲醇，或另一种方法是使用含有或不含有加入的链烷醇的四氢呋喃（THF），并搅拌几分钟至约1小时，最后真空浓缩至干。例如通过与环己烷、甲苯或干燥的四氢呋喃，优选是极干的（少于0.08mg>2O/mL）四氢呋喃共沸蒸馏使剩余物严格除水。

将干碱金属盐溶于醚溶剂如四氢呋喃、乙醚、1，2-二甲氧基乙烷等中，冷却至约-80℃至-25℃，优选-35℃至-30℃，然后在干燥隋性环境中在醚溶剂中用过量的强碱如碱金属酰胺处理，其中碱金属是锂、钠或钾，优选锂，酰胺是二乙基酰胺、吡咯烷、二甲基酰胺或二异丙基酰胺。在-80℃至-25℃，优选-35℃至-30℃下约2至8小时，优选约2小时后，将卤代甲烷，例如溴代甲烷、氯代甲烷或碘代甲烷，优选溴代甲烷或碘代甲烷加入到混合物中，同时保持低温。如果剩下相当大量的原料，可重复进行所述的用强碱和卤代甲烷处理的步骤。0.5至约3小时后接着最后加入卤代甲烷，通过加入过量水使反应混合物骤冷。

图解Ⅲ

图解Ⅲ（续）

然后，优选的是，用在乙酸乙酯中的氢氧化铵-甲醇将Lovastatin酸盐和Simvastatin酸盐的混合物转化成相应的铵盐，接着分离铵盐（优选用结晶法）并再悬浮于含水介质中，用选择的微生物，或其突变体或由其衍生的水解酶处理。

另一种方法是，将水解酶直接加入到Lovastatin盐和Simvastatin盐的混合物中，然后用蒸馏法除去残留的有机物。

通过合适的方法，例如加热催化或酸催化内酯化可以将得到的Simvastatin酸和三醇酸的混合物转化成相应的内酯的混合物。用HPLC或结晶法可将Simvastatin从得到的Simvastatin和二醇内酯的混合物中分离出来。另外，可通过HPLC或结晶法将Simvastatin酸从三醇酸中分离出来，接着将纯的Simvastatin酸转化成Simvastatin内酯。如果用结晶法将Simvastatin酸分离和提纯，优选的是在内酯化之前将Simvastatin酸转化成铵盐。

本发明也涉及能够将Lovastatin酸转化成三醇酸的微生物培养基的特殊菌株的突变体：Clonostachys  Compactiuscula（ATCC38009和ATCC74178），Monascus  ruber（FERM-P.No.4822），Mortierella  isabellina（IFO7844，ATCC42613，ATCC36670，ATCC38063，或ATCC44853），Emericella  unguis（IFO8087，ATCC10073，ATCC12063，ATCC13431，或ATCC16812），Diheterospora  chlamydosporia（IFO9249，ATCC16449，ATCC18956，ATCC20537），Humicola  fuscoatra（IFO9530，ATCC12774，ATCC52073，ATCC62175），Dechotomomyces  cejpii（IFO9929，ATCC22149，ATCC42284），Neocosmospora  africana（IFO7590，ATCC24342），Xylogone  sphaerospora（IFO9516，ATCC42027），Torulomyces  ragena（IFO30008），Thielavia  fimeti（IFO30419），Aspergillus  unguis（MF1416），卷枝毛霉（Mucor  circinelloides）（ATCC1207a），腐皮镰孢（Fusarium  solani）（ATCC12826），产黄青霉（Penicillium  chrysogenum）（ATCC10002），棒曲霉（Aspergillus  Clavatus）（ATCC1007），Scopulariopsis  communis（MF3769），Gilmaniella  humicola（ATCC16013），Mucor  bainieri（ATCC42642），Tricharus  spiralis（MF5295），Chaetomium  cochliodes（ATCC10195），白浅灰链霉菌（Streptomyces  albogriscolus）（NRRL5748），寡生孢链霉菌（Streptomyces  Paucisporogenes）（ATCC25482），吸水链霉菌（Streptomyces  hygroscopius）（ATCC21722），产绿色链霉菌（Streptomyces  Viridochromogenes）（ATCC21724），排孢游动单孢菌（Planomonospora  Parontospora）（ATCC23864），和Kibdelosporangium  aridum（NRRL12647）。在发酵技术中有一些公知的方法可提高用微生物的各种菌株产生的所需产物的产率。例如，将得到的产生的菌株进行照射或曝露于已知的其他刺激源之下以大大地增加微生物的原生物的正在进行的突变。然后通过使用一种敏感筛，可能的是，从仅这样产生的许多突变体中选择可增加所需产物产量的那些突变体。用这种方法，通常可能的是，通过其各种选择的派生物不断地改善产生的菌株的产量。突变体的生物纯的培养物是基本上包括突变体的一种菌株的培养物。对于本发明，通过选择真菌或放线菌类的突变体可以实现对于Lovastatin酸水解酶的产量的类似改善。对此目的来说，令人满意的筛是使用高效液相色谱（HPLC），其可测定在非常低浓度下的酶催化分裂产物，这样清楚地确定了Lovastatin通过上述任何特殊突变体已转化成三醇酸。

培养基

微生物的发酵是在水介质例如用于制备其他发酵产物的那些水介质中进行，这种水介质含有可被微生物吸收的碳、氮的来源和无机盐。

通常，碳水化合物例如糖如乳糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、木糖、甘露糖醇等，和淀粉如酒糟象燕麦、黑麦、玉米淀粉、小米或玉米面等可以单独或混合用作培养基中可吸收的碳的来源。培养基中所用的碳水化合物的来源或多种来源的准确量部分取决于培养基中的其他组分，但是，通常，碳水化合物的量一般在培养基重量的约1%和6%之间变化。这些碳来源可以单独地使用，或几种这样的碳来源在培养基中混合使用。通常许多蛋白质物质可用作发酵过程中的氮来源。合适的氮来源包括，例如酵母水解产物、原生酵母、大豆粉、棉子粉、酪蛋白的水解产物、玉米浆、酒糟或番茄糊等。氮来源可以单独或以混合形式使用，其量范围为水介质重量的约0.2%至6%。

能产生钠、钾、铵、钙、磷酸根、硫酸根、氯、碳酸根等离子的普通盐是在可被加入到培养基中的营养物的无机盐之中，也包括痕量金属如钴、锰、铁和镁盐。另外，如果需要，可加入消泡剂如聚乙二醇或聚硅氧烷，尤其是如果培养基过多地起泡时。

应注意的是，实施例中所述的培养基仅是举例说明可使用的各种各样的培养基，而不是对于培养基的限定。具体地说，用于培养基中的碳来源包括葡萄糖、糊精、燕麦粉、燕麦面、糖浆、柠檬酸盐、大豆油、甘油、麦芽膏、鳕鱼肝油、淀粉、乙醇、天花果、抗坏血酸钠和猪油。氮来源包括胨化牛奶、自溶酵母、酵母RNA、番茄糊、酪蛋白、原生酵母、花生面、酒糟、玉米浆、大豆粉、玉米粉、NZ胺、豆提取液、天冬酰胺、棉子粉和硫酸铵。主要的离子组分是CaCO₃、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和NaCl，也存在少量的CoCl₂·6H₂O和痕量的Fe、Mn、Mo、B、Co和Cu。

内酯化作用

根据本发明的方法，用可水解Lovastatin的2-甲基丁酰氧基侧链的微生物培养基、或其突变体、或由其得到的无细胞提取液、或由其得到的水解酶处理Simvastatin酸和Lovastatin酸的混合物，得到容易分离的Simvastatin酸和三醇酸的混合物。如果需要Simvastatin的内酯形式，则可将产物混合物内酯化并分离，然后二醇内酯与Simvastatin内酯分离。另一种方法是，Simvastatin酸可与三醇酸分离，接着将Simvastatin酸内酯化成Simvastatin。三醇酸的内酯反应是用标准方法，即加热或酸催化内酯化方法来进行。用于Lovastatin酸的有关化合物的酸催化内酯化的方法是已知的，并叙述于美国专利4，916，239中。对于Simvastatin酸和三醇酸，内酯化反应通过在室温下在含7mM甲磺酸的乙酸异丙酯中搅拌2小时来进行。

实施例1

通过Clonostachys  Compactiuscula的全细胞将Lovastatin酸生物转化成三醇酸

在具有1.8L操作体积的2L空气升液发酵罐中，在29℃和1.25vvm的充气速率下使Clonostachys  Compactiuscula  ATCC38009在培养基EN（葡萄糖1%;胨0.2%;牛油提取液0.1%;酵母提取液0.1%和玉米浆0.3%）中生长48-72小时。加入Lovastatin铵盐（0.5g/L最终浓度），以降低水解活性。加入Lovastatin铵盐后24-72小时，通过筛子过滤得到发酵物，并用缓冲剂（20mM  Tris，PH8.5）洗涤该小片，冷冻细胞小片直到容易使用为止。

为了生物转化，在由Aspergillus  terreus发酵得到的碳酸盐缓冲剂中由空气升液发酵得到的Clonostachys  Compactiuscula小片（17g湿重）与20mL粗Lovastatin酸（Cd  20g/L）接触，在250mL  Erlenmeyer烧瓶中在27℃和160rpm下进行生物转化，17小时后，约60%的Lovastatin酸转化成三醇酸。

在另一试验中，由空气升液发酵得到的Clonostachys  Compactiuscula小片（5g湿重）与通过甲醇从Aspergillus  terreus发酵提取的10mL粗Lovastatin酸（3.5g/L）接触。在生物转化混合物中甲醇的最终浓度为25%。生物反应在250mL  Erlenmeyer烧瓶中在27℃和160rpm下进行，2小时后，通过薄层色谱测定，使用Clonostachys  Compactiuscula的生物转化反应使近100%的Lovastatin酸转化成三醇酸。

实施例2

用Clonostachys  Compactiuscula的粗均浆使Lovastatin酸生物转化成三醇酸

在含有12mL培养基EN的250mL摇烧瓶中在29℃下使Clonostachys  Compactiuscula  ATCC38009生长3天，加入Lovastatin铵盐以得到浓度为2.5g/L，并使发酵另外继续进行2天。为了制备粗均浆，通过在3000rpm下离心分离10分钟得到培养基，然后用50mM  PH值为7.7的N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸（TES）缓冲剂洗涤。将培养基再次离心分离，并在冰上冷冻细胞块，然后用装有玻璃碎片和粉末干冰的研钵和研杵来研磨，将相当于1摇烧瓶量的研磨的均浆再悬浮于2.0mL50mM  TES缓冲剂中，并在6000rpm下离心分离10分钟以除去细胞碎片和玻璃碎片。上层清液用作含有蛋白质浓度为约0.5mg/mL的粗均浆。

为了进行生物转化，1体积的粗均浆与等体积的Lovastatin酸铵盐（5g/L）混合，将混合物在29℃下保温培养。使用该方法，在2小时内观察到80-90%的Lovastatin酸转化成三醇酸。

实施例3

从Clonostachys  Compactiuscula细胞提纯Lovastatin水解酶

使用下述方法将使Lovastatin酸生物转化成三醇酸的水解酶提纯，该提纯方法是使用MONO Q阴离子交换柱的快速蛋白质液相色谱（FPLC），使Clonostachys Compactiuscula均浆接近均一性。

如上述实施例2所述，但其中用50mM三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）缓冲剂（pH7.8）代替50mM TES缓冲剂，通过6000rpm离心分离得到的上层清液在15，000rpm下离心分离20分钟，得到的上层清液通过0.45mm过滤器过滤。然后将含有0.3-0.5mg/mL蛋白质的滤液分批地（10mL）以1.0-2.0mL/分的速率加入到与Pharmacia快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统连接的Pharmacia MONO Q（HR5/5）阴离子交换柱中。

使阴离子蛋白质结合到柱间质上后，用在20mM  TRIS中的PH值为7.8的氯化钠（0-500mM）的线性梯度逐一地洗脱水解酶。以1mL部分的量收集洗脱的蛋白质，并用Lovastatin铵盐[在这种情况下水解百分数用TLC（薄层色谱）和光密度分析法或HPLC测定]或比色底物（邻硝基苯基丁酸盐，O-NPB）来测定，达到酶已显示出具有水解活性。当使用比色底物时，水解反应是用在410nm下用分光光度分析法测定，该方法主要叙述于Lawrence，R.C.等人的J.Gen.Microbiol.（1967）48，401-418中。这两种测定方法都显示出当NaCl浓度接近300mM时水解酶被洗脱。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS）凝胶电泳现象显示出含Lovastatin酸水解酶的部分的峰含有分子量约45000Da的显著光带。

使用提纯酶的制备方法，生物转化反应是按照实施例1、2、4和6中所述的方法进行，并且测定是用Lovastatin铵盐作为底物由水解酶的Km和比活性构成。得到的Km值为4.14mM，在饱和底物条件下，发现所说的酶具有比活性为0.04mmol水解的Lovastatin铵盐/mg蛋白质/分。

实施例4

通过由Clonostachys  Compactiuscula得到的纯化的水解酶将Lovastatin酸生物转化成三醇酸

使用下述方法，通过使用MONO Q阴离子交换柱的快速蛋白质液相色谱法（FPLC）将使Lovastatin酸转化成三醇酸的水解酶提纯，使之Clonostachys Compactiuscula均浆接近均一性。

如上实施例2所述，但其中用20mM三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）缓冲剂代替50mM  TES缓冲剂，将来自6000rpm离心分离得到上层清液，在15000rpm下离心分离，得到的上层清液通过0.45mm过滤器过滤。然后将含有0.3-0.5mg/mL蛋白质的滤液分批地（10mL）加入到与Pharmacia快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统连接的Pharmacia MONO Q阴离子交换柱中。

使阴离子蛋白质结合到柱间质上后，使用线性梯度的氯化钠（0-500mM）逐一地洗脱水解酶。以1mL部分的量收集洗脱的蛋白质，并用Lovastatin铵盐（在这种情况下水解百分数用TLC和光密度分析法或HPLC测定）或比色底物（邻硝基苯基丁酸盐，O-NPB）来测定，达到酶已显示出具有水解活性。当使用比色底物时，水解反应是在410nm下用分光光度分析法测定，该方法主要叙述于Lawrence，R.C.等人的J.Gen.Microbiol.（1967）48，401-418中。这两种测定方法都显示出当NaCl浓度接近300mM时水解酶被洗脱。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS）凝胶电泳现象显示出含Lovastatin酸水解酶的部分峰含有分子量约45000Da的显著光带。

使用纯化酶的制备方法，生物转化是按照上述实施例1和2所述的方法进行，并且测定是用Lovastatin铵盐作为底物由水解酶的Km和比活性构成。得到的Km值为4.14mM，在饱和底物条件下，发现所说的酶具有比活性为110μmol  Lovastatin铵盐/mg蛋白质/小时。

实施例5

在过量Simvastatin铵盐的存在下Lovastatin铵盐的生物转化

将45g在实施例2中所述的培养基EN中生长的（冷冻前用50mM  PH为7.8的Tris缓冲剂洗涤）冷冻的ClonostachysCompactiuscula（ATCC38009）细胞用含玻璃碎片和干冰的研钵和研杵均化。将得到的均化的冷冻的粉末移到合适的管中，并用最少量的50mM  Tris（PH7.8）洗涤研钵中剩余的物质而将其加入到相同的管中。然后将混合物熔化、并在6000rpm下离心分离10分钟以除去大的细胞碎片和玻璃碎片。

将在6000rpm下得到的上层清液用作水解酶的粗来源，并将0.8mL的该上层清液与0.2mL甲醇和1.0mL溶液[在50mM  Tris中的18.6mM  Simvastatin和Lovastatin（1.4mM）铵盐，PH7.8]混合。反应混合物在29℃下保温培养，在1小时、2小时和17小时后通过取出0.1mL而取样，并用0.9mL甲醇稀释，然后通过使用Whatman  C-8柱作为稳定相和60∶40的乙腈∶0.5%磷酸的混合物作为流动相的HPLC分析样品;在这些条件下，Simvastatin、Lovastatin和三醇铵盐的相应的保留时间分别为4.4分、3.8分和2.5分。17小时后，Lovastatin峰的面积百分数由23.2%降至0.7%，这表明转化率大于99%，在此相同接触期间内，大于96%的初始Simvastatin铵盐保持不变。

实施例6

按照直接甲基化由Lovastatin酸合成Simvastatin酸的方法将剩余的Lovastatin酸生物转化成三醇酸

步骤1：制备Lovastatin钾盐

在氮气中制备在325mL四氢呋喃（THF）中的Lovastatin溶液（99%纯度;25g;60.57mmol），然后冷却至5℃。在15分钟内加入10.01M氢氧化钾的水溶液（6.1mL），然后升温至25℃并搅拌老化，直到完全（＞99%）转化成钾盐（用HPLC分析）。

步骤2：制备Simvastatin钾盐

将步骤1制备的Lovastatin钾盐溶液加热至回流，通过10英寸Vigreaux柱蒸馏总的500-700mL  THF，同时将THF进行筛干燥以保持最小罐体积为215mL。于是Lovastatin钾盐溶液中的水量减少至＜0.1mg/mL。然后用150mL经筛干燥的THF（水含量＜0.1mg水/mL）稀释该溶液，得到的总体积为365mL。将经筛干燥的吡咯烷（5.81g;81.7mmol;水含量＜0.2mg/mL）作为一批加入，反应物在干冰/丙酮浴中冷却至-78℃。然后，在1小时内在液面以下加入在己烷中的117mL的1.6M正丁基锂，同时保持快速搅拌和内温低于-70℃。

将当时含有吡咯烷锂中间体的Lovastatin钾盐溶液用干冰-乙腈浴升温至-35℃并老化2小时，冷却至-45℃后，将13.32g经筛干燥的碘代甲烷（93.0mmol;密度2.89g/mL）一批加入，混合物在-30℃（加入碘代甲烷后的内温）下老化30分钟。用200ml水骤冷混合物，并在分液漏斗中进行相分离，通过再加入水将低层的水层稀释至体积1250mL，然后冷却至低于10℃。用6M盐酸将PH调节至6，然后加入250mL乙酸乙酯，将PH进一步调节到2.0（再用HCl）。再进行相分离，然后用175mL冷（5-10℃）乙酸乙酯再萃取水层。将两部分有机（乙酸乙酯）层合并，并用150mL水洗涤，然后用硫酸钠干燥最终的有机层（至＜10mg/mL水）并过滤。然后，在25℃下将112.3mL甲醇加入到（425mL）干燥的过滤的混合物中，然后在5分钟内加入1.3mL甲醇∶氢氧化铵水溶液（3∶1）。用Simvastatin铵盐（SAS）接种混合物并老化10分钟，然后在1小时内再滴加35.9mL甲醇∶氢氧化铵水溶液（3∶1），然后在2.5小时内将混合物冷却至-10℃，再老化1小时。过滤产物并用25mL冷（0℃）甲醇洗涤，真空干燥得到的白色晶体，得到白色针状的Simvastatin铵盐（含有作为铵盐的10%剩余的Lovastatin的87%纯度的SAS）。

步骤3：将剩余的Lovastatin酸（作为铵盐）生物转化成三醇酸

使用实施例1和3中所述的方法，将Clonostachys Compactiuscula酯酶提纯除去已在培养基EN中生长的57g菌丝体细胞。使用Pharmacia HR10/10 MONO Q柱，可使每次提纯试验应用85mL粗无细胞提取液。得到总量为0.89mg提纯的酯酶（在10mL体积中），然后通过使用10000分子量断流CENTRIPREP装置（AMICON）的超滤方法浓缩至0.175mg蛋白质/mL。

然后用通过直接甲基化Lovastatin制得的Simvastatin铵盐保温培养酯酶样品。蛋白质的最终浓度为0.4、4.0和40mg/mL，所用的Simvastatin浓度为10、35和50mM。被改变的其他条件是PH值（确定为7.8和9.5）和甲醇浓度（0、10和20%[V/V，最终浓度]）。通过夹杂物100mM  TRIS（在PH7.8下进行反应的情况下）或100mM甘氨酸（PH9.0）将反应缓冲。在下列条件下在16小时内得到大于90%的剩余的Lovastatin酸水解成三醇酸：

酶浓度  Simvastatin浓度  PH  甲醇浓度

(mg/ml)  (mM)  (%v/v)

4.0  10  7.8  0

4.0  10  7.8  10

4.0  10  9.5  0

4.0  10  9.5  10

4.0  10  9.5  20

4.0  35  9.5  10

40.0  35  7.8  0

40.0  35  7.8  10

40.0  35  9.5  0

40.0  35  9.5  10

40.0  35  9.5  20

实施例7

通过直接甲基化按照从Lovastatin酸合成Simvastatin酸的方法将剩余的Lovastatin酸生物转化成三醇酸

步骤1：制备Simvastatin铵盐

按照实施例6中步骤1的方法开始制备在THF中的5g  Lovastatin的钾盐溶液。在干冰/乙腈浴中将经筛干燥的吡咯烷（2.48mL;2.4当量;29.67mmol;＜0.2mg水/ml），的12.3mL经筛干燥的THF溶液冷却至-20℃，然后以保持温度低于-10℃的这样的速率加入1.6M丁基锂的己烷（18.2mL;2.35当量）溶液，加完该溶液后，吡咯烷锂/THF溶液在-20℃下老化15分钟。在干冰/乙腈冷浴中，将在THF中的Lovastatin钾盐的干燥溶液冷却至-35℃，将在-20℃下的吡咯烷锂/THF溶液以这样的速率加入到快速搅拌的混合物中，以保持在整个加入过程中的内温低于-30℃。然后混合物在-35℃下老化2小时，接着冷却至-40℃，将1.16mL（18.67mmol;1.5当量）碘代甲烷按一批加入到该溶液中，这样引起混合物的内温升高（至约-20℃）。将内温降低回至-30℃并老化1小时，然后升温至-10℃并老化30分钟。

用40mL水将混合物骤冷并在分液漏斗中进行相分离，通过再加入水将低部的水层稀释至250mL体积，然后冷却至低于10℃。用6M盐酸水溶液调节PH值至6，然后加入50mL乙酸乙酯，并将PH值进一步调节至2.0（再用HCl）。再进行相分离，然后用35mL冷（5-10℃）乙酸乙酯再萃取水层，合并两部分有机（乙酸乙酯）层，然后用30mL水洗涤，之后，用硫酸钠干燥最终有机层并过滤。接着，将22.5mL甲醇加入到25℃下的干燥的过滤的混合物中，然后在5分钟内加入0.26mL甲醇∶氢氧化铵水溶液（3∶1）。用Simvastatin铵盐接种混合物并老化10分钟，然后在1小时内再逐滴加入7.2mL甲醇/氢氧化铵，在2.5小时内将混合物冷却至-10℃，并再老化1小时。过滤产物并用5mL冷（0℃）甲醇洗涤，真空干燥得到的白色晶体，以便得到Simvastatin铵盐。

步骤2：将剩余的Lovastatin酸（作为铵盐）生物转化成三醇酸

按照实施例6中步骤3的方法进行生物转化。

实施例8

Simvastatin铵盐的内酯化以及纯Simvastatin内酯的结晶和分离

步骤1：Simvastatin铵盐的内酯化

在氮气氛下将蒸馏水（20mL）、冰醋酸（40mL）和丁基化羟基苯甲醚（BHA，50mg）加入到250mL3颈园底烧瓶中，该批物料温度调节至20-25℃，加入Simvastatin铵盐（12.5g，27.56mmol），并在20-25℃下搅拌15分钟，或直到溶解为止。加入甲磺酸（70%，4.35g，30.8mmol，1.118当量），混合物在20-25℃下老化2小时，直到内酯化反应完成多于75%为止。

按照制备例A中的条件用HPLC测定转化率。该转化度计算如下：

(面积%（Simvastatin铵盐）)/(面积%（Simvastatin铵盐+Simvastatin）) ×100%

步骤2：纯Simvastatin的结晶和分离

用粗Simvastatin晶种（60mg）将该批物料接种，并在20-25℃下老化0.5小时。在3小时内加入蒸馏水（22.5mL）（0.13mL/分），然后加入第二批蒸馏水[在1小时内加入35mL（0.58mL/分）]。将该批物料在20-25℃下老化1小时，然后用28W/W%氢氧化铵（4.0mL）逐滴加入来处理。

该批物料在20-25℃下老化1小时，并过滤收集Simvastatin粗晶体，用2∶1的蒸馏水和乙酸乙酯（50mL）、蒸馏水（50mL）和1∶1的甲醇和蒸馏水（50mL）洗涤Simvastatin粗湿滤瓶。在25-30℃下用氮气吹扫并真空干燥该产物一整夜，得到Simvastatin的粗白色针状物（10.38g，HPLC测定，98W/W%）。

实施例9

纯Simvastatin的结晶和分离

在氮气氛下，将粗Simvastatin（10g，23.89mmol）和丁基化羟基苯甲醚（50mg）加入到含有126.4mL脱气甲醇的烧瓶中，将该批物料温度调节至20-25℃，并搅拌15分钟直到固体溶解。该溶液通过活性炭的ECOSORB C床层过滤，该床层的组成为：水、活性炭、纤维素纤维、苯乙烯二乙烯苯和阴离子交换树脂[91.5g甲醇（50mL）洗涤的ECOSORB C]。并且该炭饼用40mL脱气甲醇洗涤。将合并的甲醇溶液移到250mL 3颈园底烧瓶中并在氮气氛下加热至38-40℃。在30分钟内在液面以下加入脱气蒸馏水（83.3mL）（2.78mL/分），并在38-40℃下老化30分钟。经1小时将该批物料冷却至25℃，在1小时内于25℃在液面以下加入脱气蒸馏水（83.3mL）（1.38mL/分），并经1小时将其冷却至10-15℃。

将该浆液过滤，在10℃下用50mL50%甲醇/蒸馏水（V/V）洗涤湿滤饼。在35-40℃下用氮气吹扫并真空干燥该产物一整夜，得到纯Simvastatin白色针状物（9.49g，HPLC测定＝99W/W%）。

实施例10

筛选用于Lovastatin酯酶活性的真菌微生物

列于下表Ⅰ中的菌株在10mL培养基EN中生长48至72小时，然后将Lovastatin（对于该筛选叙述在第2栏中）或Simvastatin（对于该筛选叙述在第3栏中）以它们的铵盐形式加入到烧瓶中至最终浓度为2.5g/L。在用薄层色谱分析用于Lovastatin或Simvastatin转化成三醇酸的流体培养基之前，将该培养基再保温培养96小时。通过TLC板的密度扫描将水解程度定量，并与使用标准浓度的Lovastatin铵盐、Simvastatin铵盐和三醇酸铵盐的纯样品的平行试验对比。

实施例11

筛选用于Lovastatin酯酶活性的放线菌类

将列于下表Ⅱ的菌株在10mL  YN流体培养基（1%肉膏、0.5%酵母提取物、0.5%葡萄糖、0.6%胨，PH7.2）或10mL  ISP-1培养基中生长72小时，然后将lovastatin（对于该筛选叙述在第2栏中）或simvastatin（对于该筛选叙述在第3栏中）以它们的铵盐形式加入到烧瓶中至最终浓度为2.5g/L。在用薄层色谱法分析用于lovastatin或simvastatin转化成三醇酸的流体培养基之前，将该培养基再保温培养96小时。通过TLC板的密度扫描将水解程度定量。

制备例A

对于干燥的粗Simvastatin进行HPLC重量百分数测定

将30mg标准物或样品精确地称重并放100mL量瓶中，并用60∶40的乙腈∶0.01MKH₂PO₄（PH＝4.0）稀释至标记线。

柱：PERKIN-ELMERC18，3cm长，3微米粒径，反相柱

温度：25℃

流量：3.0mL/分

测定：UV238nm

注射：5微升

流动相：50∶50乙腈∶0.1%H₃PO₄（含水）

保留时间：

时间（分）  同一性

1.80  1.Simvastatin铵盐

2.20  2.lovastatin和差向异构体

3.44  3.粗Simvastatin

重量%计算如下：

(（样品的平均响应因子）（100）)/(（标准物的平均响应因子）) ＝重量%