用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物及应用

摘要

本发明公开用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物及应用。本发明的组合物包含第一白介素复合物或者能够形成第一白介素复合物的前体，和第二白介素复合物或者能够形成第二白介素复合物的前体。其中，第一白介素复合物为IL‑15/IL‑15Rα复合物，第二白介素复合物为IL‑12复合物。本发明的组合物能够协同增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学以及医药领域，具体地涉及用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物及应用。

背景技术

在机体免疫应答过程中，抗原递呈细胞(APC)扮演重要的角色，研究表明，这类细胞能够辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并对抗原产生应答，根据APC细胞表面膜分子表达情况和功能的差异，分为专职和非专职APC 两类，其中树突状细胞(DC)是目前所知体内功能最强的专职APC，其最大的特点是能够刺激初始T细胞的增值，因此APC在免疫系统占有独特地位，是免疫应答启动者。

CN101360827A公开了一种IL-15Rαsushi结构域作为通过IL-15Rβ/γ的 IL-15作用的选择性和有效的增强剂以及超激动剂(IL15Rαsushi-IL15)融合蛋白，用于刺激IL-15Rβ/γ信号通路、从而诱导和/或刺激诸如NK和/或T细胞的IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的化合物，该融合蛋白包含直接或间接共价连接到至少一个含有IL-15Rα胞外区的sushi结构域的多肽上的至少一个IL-15Rβ/γ结合体。

CN110050062A公开了一种表达IL12的溶瘤弹状病毒，其基因组包含组合地编码白细胞介素-12(IL12)蛋白或其功能部分的一种或多种核酸序列。还公开了一种使用所述溶瘤重组Maraba病毒来治疗患者中的癌症的方法。

因此，以抗原递呈细胞相关疫苗在肿瘤的预防和治疗中方面展现了较好的应用前景。如Sipuleucel-T直接将前列腺癌酸性磷酸酶抗原转染DC激发机体产生特异性的抗肿瘤反应。IMPACT研究显示，尽管客观有效率评价显示治疗效果有限(<5％)，Sipuleucel-T组的中位生存时间(25.8个月)要高于对照组(21.7个月)4.1个月。2010年4月，美国FDA批准Sipuleucel-T用于治疗无症状或症状轻微的转移性去势治疗无效的难治性前列腺癌(castration- resistant prostate cancer，CRPC)。在胶质瘤中，负载自体肿瘤裂解物的DC疫苗DC-VAX尚在进行III期临床试验中。有电穿孔法将自体肾脏肿瘤的RNA 和CD40LmRNA电转到DC的肿瘤疫苗，与靶向药物舒尼替尼联用的报道，目前也在临床试验中。近期的研究发现，DC疫苗能显著延长患者生存期，不过单独的DC疫苗的使用通常不能导致所期待的免疫治疗效果的改善，不能得到令人满意的临床效果。目前的临床实验表明，DC治疗性疫苗的应答率很少超过15％，总体应答率偏低。

发明内容

本发明提供一种组合物，用于解决现有技术中的至少部分技术问题。本发明通过高通量筛选实验发现两种白介素复合物的组合可以发挥协同作用，增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力，诱导产生更多的有抗肿瘤活性的CD4 T淋巴细胞和CD8 T淋巴细胞。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物，该组合物包含第一白介素复合物或者能够形成第一白介素复合物的前体，和第二白介素复合物或者能够形成第二白介素复合物的前体；其中：

所述第一白介素复合物为IL-15/IL-15Rα复合物，和

所述第二白介素复合物为IL-12复合物。

在某些具体实施方案中，所述能够形成第一白介素复合物的前体为编码 IL-15的基因和编码IL-15Rα的基因。

在某些具体实施方案中，所述能够形成第一白介素复合物的前体为同时编码IL-15和IL-15Rα两者基因。

在某些具体实施方案中，所述能够形成第二白介素复合物的前体为编码 IL-12p40的基因和编码IL-12p35的基因。

在某些具体实施方案中，所述能够形成第二白介素复合物的前体为同时编码IL-12p40和IL-12p35两者的基因。

在某些具体实施方案中，所述能够形成第二白介素复合物的前体为编码 IL-12p40和IL-12p35的融合蛋白的基因。

本发明的第二方面，提供一种抗原递呈细胞，所述抗原递呈细胞包含抗原或能够产生所述抗原的前体，和第一方面所述的组合物。

在某些具体实施方案中，所述抗原递呈细胞通过使第一方面所述的组合物引入负载所述抗原的抗原递呈细胞而得到；或者其通过使第一方面所述的组合物和抗原引入所述抗原递呈细胞而得到。

本发明的第三方面，提供一种用于致敏T细胞的方法，包括使第二方面所述的抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤。

本发明的第四方面，提供一种用于促进辅助T细胞产生细胞因子的方法，所述方法包括使第二方面所述的抗原递呈细胞与辅助T细胞接触的步骤。

本发明的第五方面，提供一种用于促进杀伤T细胞产生细胞因子的方法，所述方法包括使第二方面所述的抗原递呈细胞与杀伤T细胞接触的步骤。

本发明通过利用IL15、IL15Rα的复合物和IL12 p70调节T细胞活化和增殖的能力，两者协同作用促使DC细胞诱导产生的特异的细胞毒性T细胞持续扩增，产生更多的有抗肿瘤活性的淋巴细胞，提高治疗肿瘤，例如DC 疫苗在治疗肿瘤的效果。

附图说明

图1为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及AKR1B10抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。图1的各组柱中，从左到右分别为CD8 IFN-γ+、CD8 IFN-γ+和TNF- α+、CD8 TNF-α+细胞占总CD8 T细胞的比例。

图2为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及AKR1B10抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。图2的各组柱中，从左到右分别为CD4 IFN-γ+、CD4 IFN-γ+和TNF- α+、CD4 TNF-α+细胞占总CD4 T细胞的比例。

图3为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原 mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。图3的各组柱中，从左到右分别为CD8 IFN-γ+、CD8 IFN-γ+和TNF- α+、CD8 TNF-α+细胞占总CD8 T细胞的比例。

图4为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原 mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。图4的各组柱中，从左到右分别为CD4 IFN-γ+、CD4 IFN-γ+和TNF- α+、CD4 TNF-α+细胞占总CD4 T细胞的比例。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明的“复合物”指的是白细胞介素与其他蛋白之间或者白细胞介素的不同功能性片段之间通过非共价键或共价键结合形成的聚集体。此处，非共价键结合的作用力的实例包括范德华力、疏水作用、氢键结合力和电荷吸引力等。非共价健结合的实例包括但不限于配体受体之间的结合。这种情况形成的复合物一般是可以再次分开，从而形成单独的白介素与单独的其他蛋白，或两个或更多个单独的白介素功能性片段。共价健结合的实例包括二硫键或肽键。在通过肽键使两个蛋白或两个不同多肽片段结合的情况下，可以理解为复合物为一种融合蛋白。融合蛋白的两个蛋白或不同多肽片段之间通常通过柔性连接子连接，从而有利于两个蛋白或不同多肽片段之间的结合形成复合物。

本发明的“前体”是指能够形成复合物的任何物质。本发明的前体包括能够形成复合物的以单独、分离形式存在的各组成成分。例如，单独、分离形式存在的白介素或与其结合的另外的蛋白。本发明的前体还包括能够形成白介素或与其结合的另外的蛋白的物质，例如，能够编码产生白介素的核酸或能够编码产生白介素第一个功能性片段的核酸(为方便说明在本文中其可称作第一核酸)，和能够编码产生与白介素结合的另外的蛋白的核酸或能够编码产生白介素第二个功能性片段的核酸(为方便说明其可称作第二核酸)。此处，第一核酸和第二核酸分别包括DNA和mRNA。在某些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接形成一个核酸分子，从而使第一核酸和第二核酸分别成为该核酸分子的一部分。在某些实施方案中，连接形成的核酸分子可以同时产生两种不同的蛋白或两种不同的多肽片段。在某些实施方案中，连接形成的核酸分子可以产生融合蛋白。在某些实施方案中，第一核酸与第二核酸分别为单独的分子。

[组合物]

本发明的第一方面，提供一种用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物，本文有时也简称为“本发明的组合物”。本发明的组合物包含第一白介素复合物或者能够形成第一白介素复合物的前体，和第二白介素复合物或者能够形成第二白介素复合物的前体；其中：所述第一白介素复合物为IL- 15/IL-15Rα复合物，和所述第二白介素复合物为IL-12复合物。

本发明中，能够形成第一白介素复合物的IL-15(interleukin-15,IL-15)是指天然存在或野生型白细胞介素-15，包括不同的剪接变体和天然生成的变体。IL-15可以是任何物种的IL-15。例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴子，优选人类。

本发明的IL-15是一种与IL-2结构类似的细胞因子，具有共同的受体亚基和信号转导通路，两种细胞因子均可刺激T细胞增殖、诱导细胞毒性T细胞 (CTL)产生，促进B细胞增殖和免疫球蛋白合成，诱导NK细胞产生。IL-15广泛表达在各种细胞和组织中，如单核细胞，巨噬细胞，DC细胞，纤维细胞等。本发明发现虽然第一白介素复合物中不存在IL-15受体中的β和γ亚基，但是其也能激活下游的JAK1，JAK3，导致下游STAT3和STAT5的磷酸化和信号通路的激活，诱导BCL2、MAP激酶通路、LCK和SYK的磷酸化，导致细胞的增殖和成熟。第一白介素复合物能够调节T细胞和NK细胞的活化和增殖，能够维持在缺乏抗原刺激下记忆性T细胞的存活。有研究证明，在啮齿类动物的淋巴细胞中，IL-15通过诱导BCL2L1/BCL-x(L)而抑制凋亡。同样地，本发明发现在人体内第一白介素复合物也能通过诱导BCL2和/或Bcl-xL抑制T淋巴细胞的凋亡。

本发明中，IL-15的氨基酸序列不特别限定，其实例包括SEQ ID No.1所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的IL-15由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成。

本发明中，IL-15受体α(IL-15Rα)是IL-15受体的α、β和γ三条链中的α链，是形成高特异性、高亲和力IL-15Rαβγ的必要亚单位。本发明中，IL-15受体α的氨基酸序列不特别限定，只要能够具备结合IL-15的功能即可，其实例包括SEQ ID No.3所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的IL-15受体α由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成。

优选地，本发明中能够形成第一白介素复合物的前体为编码IL-15的基因和编码IL-15Rα的基因。更优选地，该前体为同时编码IL-15和IL-15Rα两个分离的单独蛋白的基因。

在示例性实施方案中，本发明的组合物包含核酸，且该核酸同时编码两种蛋白，从而有利于得到的表达产物高效地形成复合物。在该情况下，同一核酸分子包含两个基因，且两个基因之间连接例如核糖体进入位点(IRES)。可选地，还可以通过使相临的两个基因之间连接编码自剪切多肽序列的核酸序列来实现。作为示例性实例，本发明的核酸可为同时编码IL-15和IL-15Rα的核酸。此类核酸的实例包括但不限于SEQ ID No.2所示的核酸，该核酸可同时编码产生单独的IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白，产生的蛋白通过共价键直接连接形成融合蛋白。

本发明中，IL-12复合物具有IL-12类似的功能，能使活化的T细胞增殖并增加其细胞毒活性，诱导NK细胞和T细胞产生γ-干扰素(IFN-γ)，调节Th1/Th2 细胞发育，促使其向Th1细胞分化。本发明中，IL-12复合物还能诱生CTL免疫应答的细胞因子，启动细胞介导的免疫反应。IL-12复合物不但能活化先天性免疫细胞，促使APC功能，特别是促使树突状细胞(DC)成熟，提高抗原提呈的效率，还可作为第三信号直接活化初始T细胞，使其转化为效应性T细胞。另外，IL-12复合物还协同IL-18促进记忆性T细胞的活化作用，使其能迅速消除被感染的细胞，同时促进其它细胞因子的分泌，抑制病毒复制，调节其它细胞免疫功能。

在某些实施方案中，本发明的IL-12复合物是由p35和p40两个蛋白通过非共价键结合形成的异二聚体。在此情况下，IL-12复合物的前体可以是p35和 p40两个蛋白，也可以是编码IL-12p40的基因和编码IL-12p35的基因。优选地，前体为编码IL-12p40和IL-12p35融合蛋白的基因。更优选地，本发明的融合蛋白中缺少IL-12p35的信号肽。

在某些实施方案中，IL-12复合物为融合蛋白70，其氨基酸序列不特别限定，例如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，或与其同源性为95％以上，优选 97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。在此情况下，IL-12复合物的前体可以编码融合蛋白的核酸，其序列例如可以如SEQ ID No.5所示。

[抗原递呈细胞]

本发明的第二方面，提供一种抗原递呈细胞，其为人为改造的细胞。本文中，抗原递呈细胞是指机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，并将抗原递呈给免疫细胞并辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并诱发免疫应答作用的细胞。其实例包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、并指状细胞、郎罕细胞和B细胞。优选地，本发明的免疫细胞为树突状细胞，更优选为人源树突细胞。本发明的树突细胞可以是成熟的树突细胞，也可以是未成熟的树突细胞。需要注意的是，这里的树突状细胞为通过体外诱导培养获得，即，通过从外周血单核细胞(PBMC)中分离出来的单个核细胞，在不同类型培养基和各类细胞因子的刺激下诱导单个核细胞成为DC细胞。在具体实施方案中，进行体外培养所使用的培养基包括AIM-V培养基、iDC培养基和mDC培养基，进行体外诱导培养的使用的细胞因子其实例包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4。

优选地，本发明的抗原递呈细胞还包含抗原或能够产生抗原的前体，和第一方面所述的组合物。“抗原”指可以被免疫系统识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位，由APC捕获并且可以被呈递到抗原呈递细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。在某些实施方案中，本发明的抗原包括AKR1B10和GPC3。

优选地，本发明的抗原递呈细胞通过使第一方面所述的组合物引入负载所述抗原的抗原递呈细胞而得到；或者其通过第一方面所述的组合物和抗原引入所述抗原递呈细胞而得到。

[用于致敏T细胞的方法]

本发明的第三方面，提供一种用于致敏T细胞能力的方法，其包括将第二方面所述的抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤。

另外，本发明提供一种用于促进辅助T细胞和杀伤T细胞产生细胞因子的方法，其包括使第二方面所述的抗原递呈细胞分别与辅助T细胞、杀伤 T细胞接触的步骤。在具体实施方案中，所述步骤通过使抗原递呈细胞与CD4 T细胞和CD8 T细胞接触并产生TNF-α和IFN-γ实现。

制备例1

本制备例用于制备编码抗原以及作为不同白介素复合物前体的DNA和 mRNA

1.制备DNA和mRNA构建体

分别构建用于产生编码IL12 p70以及IL15/IL15Rα mRNA的DNA序列，并且用于后续的体外转录反应。在编码序列之后是一段多聚腺苷片段。这些DNA序列信息如下表1所示。

另外，构建用于体外致敏的人肿瘤抗原AKR1B10和GPC3的编码序列。AKR1B10和GPC3的序列可通过Genebank数据库获得。本实施例中使用 CN107583042A中公开的抗原。

表-1 DNA序列表

名称序列号IL-15IL-15RαSEQ ID No.2IL-12SEQ ID No.5

2.体外转录

首先使用限制性内切酶将制备得到的相应DNA质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

实施例1

本实施例用于研究本发明组合物对T细胞应答的影响。

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取肝细胞癌患者静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％ CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL>2培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基>

2.用组合物转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染10μgmRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA>5>2细胞培养箱中继续培养6小时。本实验中，使用的mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照(mDC对照组)

2)只加编码AKR1B10抗原的mRNA(AKR1B10对照组)

3)编码AKR1B10抗原的mRNA与IL-12p70的mRNA(IL12组)

4)编码AKR1B10抗原的mRNA与IL15/IL15Rα的mRNA(IL15组)

5)编码AKR1B10抗原的mRNA与IL-12p70和IL15/IL15Rα的 mRNA(实验组)

3.将复苏过夜的外周血单核细胞PBMC以2×10⁶/ml的浓度接种到96>

4.在共培养的10-12天，进行胞内细胞因子检测。

在收集细胞前5-8h，将培养的T细胞混匀，调整细胞密度到2×10⁶/ml,>

准备负载抗原的DC细胞作为靶细胞。复苏已经制备的负载抗原的冻存的DC细胞，并用台盼蓝染色计数细胞，用含IL-7及IL-2细胞因子的RPMI 完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为2×10⁵/ml，每孔加入100μl细胞。

在细胞培养液中加入终浓度为2μM monensin或3μg/ml Brefeldin A，充分混匀。Monensin和Brefeldin A作为蛋白运输的阻断剂，在细胞液中的时间不应超过12h，4-6小时后，进行胞内染色检测。

5.取出细胞，将细胞转移到相应的流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、 CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-α和IFN-γ抗体进行胞内染色。

6.用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-α+和IFN-γ+细胞的比例。

6.1使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及AKR1B10抗原 mRNA转染DC细胞后，CD4 T和CD8 T细胞免疫应答结果

结果如图1和图2所示，使用本发明提供的组合物能够显著提高CD4 T 细胞亚群中IFN-γ阳性细胞比例，尤其是与单独使用IL-12和IL15/IL15Rα相比，本发明组合物具有协同的免疫增强效果。

与只转染了AKR1B10抗原的组比，使用了本发明组合物的实验组中， IFN-γ阳性的CD8 T细胞比例为2.39％，提高了8.56倍。IFN-γ和TNF-α双阳性细胞以及TNF-α阳性细胞分别提高了64％和80％。在CD4 T细胞亚群中，实验组的IFN-γ阳性细胞比例为17.2％，是AKR1B10对照的15.28倍， IFN-γ比例显著提高。IFN-γ和TNF-α双阳性细胞比例为3.22％，是AKR1B10 对照的7倍。TNF-α阳性细胞为4.06％，是AKR1B10对照的184.5％。

6.2使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA 转染DC细胞后，CD4 T和CD8 T细胞免疫应答结果。

实施例2

本实施使用GPC3抗原进行与实施例相似的实验。本实施例中，使用的 mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照(mDC对照组)

2)只加编码GPC3抗原的mRNA(GPC3对照组)

3)编码GPC3抗原的mRNA与IL-12p70的mRNA(IL12组)

4)编码GPC3抗原的mRNA与IL15/IL15Rα的mRNA(IL15组)

5)编码GPC3抗原的mRNA与IL-12p70和IL15/IL15Rα的mRNA(实验组)

结果见表2以及图3和图4。

使用本发明提供的组合物与单独使用IL-12和IL15/IL15Rα相比，本发明组合物具有协同的免疫增强效果。在CD8 T细胞亚群中，实验组的IFN-γ阳性细胞比例为3.82％，是GPC3对照的56.18倍，IFN-γ比例显著提高。 IFN-γ和TNF-α双阳性细胞比例为1％，是GPC3对照的22.22倍。TNF-α阳性细胞为1.79％，是GPC3对照的37.68倍。与只转染了GPC3抗原的组比，使用了本发明组合物的实验组中，IFN-α阳性的CD4 T细胞比例为4.87％，提高了4.43倍。IFN-γ和TNF-α双阳性细胞以及TNF-α阳性细胞分别提高了248％和152％。

表-2免疫应答结果

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110> 北京启辰生生物科技有限公司

<120> 用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物及应用

<141> 2019-11-21

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 162

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 1015

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

202530

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

354045

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

505560

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65707580

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

859095

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser

<210> 2

<211> 1951

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

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tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc 720

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tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg 1020

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taccgccgcc acaacagccg ctattgtgcc aggaagccag ctgatgccta gcaagagccc 1620

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ccctgcagtt ag 1812