用犬呼吸道冠状病毒进行疫苗接种以针对支气管炎博德特菌感染进行保护

摘要

本文提供包含犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)的组合物、组合和方法，其有效治疗或预防动物中与次生病原体(例如支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica))相关的呼吸道感染。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，并且尤其涉及免疫原性和疫苗组合物 的领域。更确切地说，本发明涉及包含犬呼吸道冠状病毒(CRCoV) 制剂的组合物，其用于治疗或预防狗的多因素疾病，尤其包含细菌 感染。

背景技术

CRCoV是高传染性的呼吸道感染，其通过狗-狗直接接触、呼吸道 分泌物气雾以及与被污染的环境或人接触而扩散。一些狗患有具有由 咳嗽、打喷嚏和流鼻涕组成的症状的轻度疾病，而其它狗具有不具临 床征象的亚临床感染，但其仍排除可以感染其它狗的病毒。感染有 CRCoV的狗可能发展为肺炎，尤其如果混合感染有其它呼吸道病原体。

感染有多种呼吸道病原体(尤其病毒性和细菌性病原体两者)的 狗可能感染犬感染性呼吸道疾病复合征(CIRDC)，其是收容在拥挤条 件(例如再安置中心和寄宿或训练狗舍)下的狗中常见的高传染性多 因素疾病。感染有CIRD的狗中所见的呼吸道病原体包括支气管炎博 德特菌(Bordetella bronchiseptica)细菌(比米斯(Bemis)等人,实验 室动物科学(Lab.Anim.Sci.),29:48-52,1977)，犬呼吸道冠状病毒 (CRCoV)(厄里斯(Erles)等人,病毒学(Virology),310(2):216-223, 2003)，犬流感病毒(CIV)(克劳福德(Crawford)等人,科学(Science), 310(5747):482-485,2005)，犬副流感病毒(CPIV)(宾恩(Binn)等人, 实验生物与医学(Exp.Biol.Med.),126:140-145,1967)，犬支原体 (Mycoplasma cynos)(乔克(Chalker)等人,微生物学(Microbiology), 150:3491-3497,2004)以及血清2型犬腺病毒(CAV-2)(迪茨费德 (Ditchfield)等人,加拿大兽医杂志(Can.Vet.J.),3:238-247,1962)。 迄今为止，尚未出现针对前述所有或大部分病原体的疫苗。

传统上，针对CIRDC和其它多病原体疾病的保护集中于投与包括 以潜在病原体中每一者为针对目标的免疫原的组合疫苗。

发明内容

本发明出乎意料地通过仅投与单种抗原来实现先前在多价产品中 寻求的目标。确切地说，通过投与犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)，申请 人已经展示与非CRCoV病原体(即支气管炎博德特菌)相关联的疾病 状态减少。这允许仅用单种单价组合物来减少复杂多方面疾病状态和/ 或以多价组合物针对细菌性病原体增加免疫原性和增强功效。

因此，本发明的一个方面提供一种治疗狗中的细菌性疾病的方法， 其包含向所述狗投与包含犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)的组合物。在 一个更具体实施例中，所述细菌性疾病是由以下各者中的至少一者造 成的：支气管炎博德特菌、犬支原体(M.cynos)和马链球菌 (Streptococcus equi.)、任选地亚种兽疫链球菌(Streptococcus  zooepidemicus)。在另一个实施例中，所述组合物进一步包含医药学上 可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。

在另一个实施例中，所述组合物进一步包含一或多种额外免疫 原。更具体地说，所述一或多种额外免疫原选自由以下各者组成的 群组：犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒-2(CAV-2)以及犬流感病 毒(CIV)。在另一个实施例中，所述一或多种额外免疫原选自由以 下各者组成的群组：犬瘟热病毒(CDV)；犬细小病毒(CPV)；犬 肠内冠状病毒(CCV)；犬腺病毒；钩端螺旋体(Leptospira)血清 变型，尤其犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流感伤寒型钩端螺 旋体(Leptospira grippotyphosa)、黄疸出血型钩端螺旋体(Leptospira  icterohaemorrhagiae)、波摩那钩端螺旋体(Leptospira pomona)和 布拉迪斯拉发钩端螺旋体(Leptospira Bratislava)；犬疱疹病毒；犬 肺病毒属；利什曼原虫(Leishmania)生物体；疏螺旋体属(Borrelia)； 支原体属；狂犬病；犬艾利希体(Ehrlichia canis)；支气管炎博德 特菌；以及其任何组合。在另一个实施例中，所述组合物主要由 CRCoV组成而无额外免疫原。

在另一个实施例中，所述组合物针对所述细菌性疾病的功效持 续时间是至少3个月或至少6个月或至少12个月的时段。

本发明的另一个实施例提供一种针对由细菌性感染在狗中造成 的犬呼吸道疾病进行保护的方法，其包含向所述狗投与犬呼吸道冠 状病毒(CRCoV)。

本发明的另一个实施例提供一种针对由混合病毒性和细菌性感 染在狗中造成的多因素犬呼吸道疾病进行保护的方法，其包含向所 述狗投与犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)。

本发明的另一个实施例提供一种治疗由支气管炎博德特菌在狗 中造成的疾病的方法，其包含向所述狗投与包含犬呼吸道冠状病毒 (CRCoV)的组合物。

本发明的另一个实施例提供一种增强包含细菌性抗原的组合物在 狗中功效的方法，其包含向所述狗共投与犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)。 本发明的另一个实施例提供一种增加包含细菌性抗原的组合物在狗中 免疫原性的方法，其包含向所述狗共投与犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)。 在前述任一者中的一个更具体实施例中，所述细菌性抗原来自支气管 炎博德特菌。

本发明的另一个实施例提供一种前述实施例中任一者中的免疫原 性组合物的方法或用途，其用于治疗或预防犬感染性呼吸道疾病复合 征(CIRDC)，其中所述组合物治疗或预防多种犬呼吸道病原体的感染。 另一个实施例提供非经肠投与如本文所描述的免疫原性组合物的用途 或方法。

另一个实施例提供包含免疫原性组合物的药剂的制造，所述药剂 用于在狗中治疗或预防犬呼吸道病原体的感染。

本发明的这些和其它实施例、特征以及优势将因本文以下阐述 的具体实施方式和所附权利要求书而变得显而易见。应理解，前述 和以下实施例中的每一者可以组合成单个实施例。

附图说明

无

具体实施方式

以下定义适用于本发明。其替代含于每一个别参考文献中的任何 矛盾定义，所述参考文献以引用的方式并入本文中。未定义的词具有 所属领域的技术人员常用的含义。此外，除非上下文另外需要，否则 单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。

“约”或“大约”在与可测量的数字变量结合使用时是指变量的指定 值和变量的全部值处于指定值的实验误差内(例如，在平均值的95％ 置信区间内)或处于指定值的10％内，以较大者为准。如果使用“约” 来提及以周为单位的时间间隔，那么“约3周”是17到25天，并且“约 2到约4周”是10到40天。

如本文所用的“佐剂”是指充当免疫反应的非特异性刺激剂的任何 物质。佐剂的进一步描述参见下文。

如本文所用的术语“动物”包括对CRCoV感染和/或犬呼吸道疾病 复合征敏感的任何动物，包括家养和野生的哺乳动物。如本文所用的 动物优选地是指狗或人类。

如本文所用的“抗体”是与来源、产生方法或其它特征无关的包含 抗原结合位点的任何多肽。其是指由于与抗原的免疫反应而特异性地 与所述抗原结合的免疫球蛋白分子或其片段。免疫球蛋白是由具有“恒 定”区和“可变”区的“轻”和“重”多肽链构成的血清蛋白，并且基于恒定 区的组成而分类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM)。抗体对给定 抗原具有“特异性”指示所述抗体的可变区排他性地识别并结合具体抗 原。所述术语包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性 抗体、多特异性(polyspecific)抗体、人类化抗体、四聚抗体、四价 抗体、多特异性(multispecific)抗体、单链抗体、结构域特异性抗体、 单结构域抗体、结构域缺失抗体、融合蛋白、ScFc融合蛋白、单链抗 体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体以及CDR 移植抗体。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白， 或可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。“抗体”可以转化为抗原结 合蛋白，其包括(但不限于)以下抗体片段，所述抗体片段包括(但 不限于)：Fab、F(ab')₂、Fab'片段、Fv片段、单链Fv(ScFv)片段、 Fd片段、dAb片段、双功能抗体、CDR3肽、限制性FR3-CDR3-FR4 肽、纳米抗体、二价纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)以及微型抗 体，和上述片段和其以化学或基因方式操控的对应物中的任一者、以 及保持抗原结合功能的其它抗体片段。这类片段通常将包含抗原结合 结构域。如所属领域的技术人员将认识到的，这类分子中的任一者可 以经工程改造(例如“种系化”)以减少其免疫原性、增加其亲和性、 改变其特异性或用于其它目的。

如本文所用的“抗原”或“免疫原”是指含有一或多个在暴露于受试 者时将诱导对所述抗原具有特异性的免疫反应的表位(线性、构象或 两者)的分子。表位是与T细胞受体或特异性抗体结合的特异性抗原 位点，并且其通常包含约3个氨基酸残基到约20个氨基酸残基。术语 抗原是指亚单位抗原，从自然界中抗原相关的完整生物体中分离和分 散的抗原；以及死亡、毒性减弱或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫 或其它微生物。术语抗原还指例如抗个体基因型抗体或其片段的抗体， 和可以模拟抗原或抗原决定子(表位)的合成肽模拟表位。术语抗原 还指在体内(例如在DNA免疫接种应用中)表达抗原或抗原决定子的 寡核苷酸或多核苷酸。

如本文所用的“抗原性”是指蛋白质或多肽与针对所述蛋白质或多 肽培养的抗体免疫特异性结合的能力。

术语“支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica/B. bronchiseptica)”是指：支气管炎博德特菌的毒性减弱活细菌、支气管 炎博德特菌的死亡全细胞提取物(菌苗)或支气管炎博德特菌的细胞 细菌提取物。

术语“细菌性疾病”或“细菌性感染”是指由特定细菌(例如支气管炎 博德特菌)直接造成或因多因素疾病状态中的细菌性病原体而加剧的 疾病。

“缓冲液”意味着防止另一种化学物质浓度变化的化学系统。质子 供体和受体系统充当缓冲液，防止氢离子浓度(pH)的显著变化。缓 冲液的另一个实例是含有弱酸和其盐(共轭碱)或弱碱和其盐(共轭 酸)的混合物的溶液。

如本文所用的“犬”包括通常称为狗的物种，但包括犬科(Canidae) 的其它成员。

如本文所用的术语“细胞系”或“宿主细胞”意味着其中病毒可以复 制或维持的原核或真核细胞。

术语共投与是指分别、依序或同时投与。共投与的抗原或药剂可 以处于同一组合物(例如多价组合疫苗)或包含不同剂型的独立组合 物中。

如本文所用的术语“培养物”意味着在不存在其它物种或类型的情 况下生长的一群细胞或微生物体。

“剂量”是指向受试者给予的疫苗或免疫原性组合物。“第一剂量” 或“初给剂量”是指在第0天给予的此类组合物的剂量。“第二剂量”或 “第三剂量”或“年剂量”是指在第一剂量之后给予的此类组合物的量，其 可以但不必是与第一剂量相同的疫苗或免疫原性组合物。

“表位”是与T细胞受体或特异性抗体结合的特异性抗原位点，并 且其通常包含约3个氨基酸残基到约20个氨基酸残基。

如本文所用的“赋形剂”是指疫苗或免疫原性组合物中的并非抗原 的非反应性载剂组分。优选的赋形剂是所属领域中已知用于非经肠注 射的赋形剂。

“片段”是指蛋白质或基因的截断部分。“功能性片段”和“生物活性 片段”是指保持全长蛋白质或基因的生物学特性的片段。

“同源性”或“同源性百分比”是指在比对序列并引入间隙(必要时) 以获得最大序列同源性百分比并且还将任何保守取代视为序列同源性 的一部分之后，候选序列中的核苷酸或氨基酸残基与比较序列中残基 相同或类似的百分比。

“同源物”或“物种同源物”包括在两种或两种以上不同物种中发现 的具有实质上多核苷酸序列同源性并且具有相同或类似生物学功能和/ 或特性的基因。如本文通过实例所描述，表示物种同源物的多核苷酸 序列优选地将在中等严格条件下杂交，并且具有相同或类似的生物活 性和/或特性。在另一个方面，表示物种同源物的多核苷酸将共用大于 约60％序列同源性、大于约70％序列同源性、大于约80％序列同源性、 大于约90％序列同源性、大于约95％序列同源性、大于约96％序列同 源性、大于约97％序列同源性、大于约98％序列同源性或大于约99％ 序列同源性。

“一致性”或“一致性百分比”是指在比对两个序列并引入间隙(必要 时)以获得最大序列一致性百分比并且不将任何保守取代视为序列一 致性的一部分之后，候选序列中的核苷酸或氨基酸与比较序列中残基 相同的百分比。

如本文所用的受试者中的“免疫反应”是指出现对抗原的体液免疫 反应、细胞免疫反应、或体液和细胞免疫反应。“体液免疫反应”是指 至少部分地由抗体介导的免疫反应。“细胞免疫反应”是由T淋巴细胞 或其它白血球或两者介导的免疫反应，并且包括由经活化T细胞、白 血球或两者产生的细胞因子、趋化因子和类似分子产生。免疫反应可 以使用所属领域中已知的标准免疫分析和中和分析来测定。

如本文所用的“免疫原性”是指蛋白质或多肽引起特异性地针对造 成所标识疾病的细菌或病毒的免疫反应的能力。

“免疫原性组合物”是含有经投与以刺激接受者体液和细胞免疫 系统对存在于所述免疫原性组合物中的抗原中的一或多者的反应的 免疫原(包括例如蛋白质，肽，全细胞，灭活、亚单位或毒性减弱 病毒，或多糖，或其组合)的制剂。“免疫接种”是在宿主中投与免 疫原性组合物并且刺激对抗原的免疫或免疫原性反应的过程。优选 的宿主是哺乳动物，例如狗。免疫原性组合物优选地是疫苗。

如本文所用的“免疫学上保护量”是有效地在接受者中诱导足够预 防或改善疾病征象或症状(包括其不良健康影响或并发症)的免疫原 性反应的抗原量。可以诱导体液免疫性或细胞介导免疫性中的一或两 者。动物对组合物的免疫原性反应可以例如间接通过测量抗体效价、 淋巴细胞增殖分析或直接通过监测在用野生型株系攻击之后的征象和 症状来评估。由组合物或疫苗赋予的保护性免疫可以通过测量例如攻 击生物体排出的减少、临床征象(例如死亡、发病率、体温和整体身 体状况)的减少、受试者的健康状况和表现、病变的减少、重要组织 的总体和组织病理学来评估。免疫反应可以包含(但不限于)细胞和/ 或体液免疫性的诱导。组合物或疫苗的治疗学上有效的量可以取决于 所用特定生物体或所治疗或接种疫苗的动物的病况而变化，并且可以 由兽医确定。

如本文所用的“鼻内”投药是指通过或借助鼻子将物质(例如疫苗 或其它组合物)引入到受试者身体中，并且涉及主要通过鼻粘膜输送 物质。

术语“分离的”是指呈实质上纯形式(例如大于约95％纯度)；或以 某种方式从其天然环境中纯化或增浓的物质。术语“分离的”涵盖与其 它药剂/稀释剂/赋形剂/佐剂/蛋白质一起处于溶液中的免疫原。

“药剂(medicinal agent)”是指适用于预防、治愈或改进医学病况 或预防某种生理学病况或事件的任何药剂(agent)。

如本文所用的“单克隆抗体”是指由单个杂交瘤细胞系产生的全部 针对特定抗原上的一种表位的抗体。用于制造单克隆抗体的抗原可以 按病原体的分离蛋白或完整病原体的形式提供。“杂交瘤”是由通过骨 髓瘤细胞与产生特异性抗体的细胞融合而形成的杂交细胞组成的克隆 细胞系。一般来说，单克隆抗体是小鼠来源的。然而，单克隆抗体也 指通过噬菌体呈现技术或相当于噬菌体呈现的方法或由非小鼠来源的 杂交细胞而产生的针对抗原特定表位而制得的克隆抗体群。

如本文所用的“口服”或“经口”投药是指通过或借助嘴将物质(例如 疫苗或其它组合物)引入到受试者身体中，并且涉及吞咽或通过口腔 粘膜输送(例如，舌下或颊内吸收)或两者。气管内也是口服或经口 投药的一种手段。

如本文所用的“口鼻”投药是指通过或借助鼻子和嘴将物质(例如 疫苗或其它组合物)引入到受试者身体中，如例如通过将一或多个液 滴放在鼻子中时将发生的。口鼻投药涉及与口服和鼻内投药相关联的 输送过程。

如本文所用的“非经肠投药”是指通过或借助不包括消化道的途径 将物质(例如组合物或疫苗)引入到受试者身体中。非经肠投药包括 皮下、肌肉内、动脉内和静脉内投药。出于本发明的目的，非经肠投 药不包括主要涉及通过嘴、鼻子、气管和肺的粘膜组织输送物质的投 药途径。

如本文所用的“病原体”或“病原性微生物”意味着能够诱导或造成 其宿主动物中疾病、病痛或异常状态(优选地是呼吸道疾病，例如 CIRDC)的微生物，例如CPIV、CAV-2、CRCoV、犬支原体、CIV或 支气管炎博德特菌。

“医药学上可接受”是指物质在合理医学判断的范围内适用于与受 试者组织接触而无不当毒性、刺激、过敏反应等等，与合理的效益-风 险比相称，并且对其预定用途有效。

如本文所用的“多克隆抗体”是指针对特定病原体或抗原制得的混 合抗体群。一般来说，所述群含有多种抗体群组，每一群组针对病原 体或抗原的一个特定表位。为制造多克隆抗体，通过接种或感染将完 整病原体或分离抗原引入到宿主中，其诱导宿主制造针对所述病原体 或抗原的抗体。

如本文所用的术语“多核苷酸”意味着由在链中共价键结的核苷酸 单体所构成的有机聚合物分子。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖 核酸)是具有独特生物学功能的多核苷酸的实例。

如本文所用的术语“多肽”意味着由在链中键结的两个或两个以上 氨基酸所构成的有机聚合物分子。

如本文所用的“呼吸道”投药是指通过或借助吸入喷雾(雾化的) 物质将物质(例如疫苗或其它组合物)引入到受试者身体中。在呼吸 道投药中，主要输送机制涉及通过气管、支气管和肺中的粘膜吸收雾 化的物质，并且因此与鼻内或经口投药不同。

术语“特异性结合(specific binding/specifically binds)”等等被定义 为两个或两个以上分子形成在生理或分析条件下可测量并且具有选择 性的复合物。如果在恰当选择的条件下，抗体或其它抑制子与蛋白质 的结合不实质上受抑制，而同时非特异性结合受抑制，那么将此类结 合称为抗体或其它抑制子与蛋白质“特异性结合”。特异性结合的特征 在于高亲和性并且对化合物或蛋白质具有选择性。非特异性结合通常 亲和性低。举例来说，IgG抗体中的结合的特征大体上在于亲和性是至 少约10^-7M或更高，例如至少约10^-8M或更高，或至少约10^-9M或更 高，或至少约10^-10或更高，或至少约10^-11M或更高，或至少约10^-12M 或更高。所述术语也可适用于其中例如抗原结合结构域对不由众多抗 原带有的特定表位具有特异性的情况，在此情况下，带有所述抗原结 合结构域的抗体大体上将不结合其它抗原。

如本文所用的“特异性免疫原性片段”是指可通过对序列具有特异 性的抗体或T细胞来辨识的所述序列的一部分。

如本文所用的“受试者”是指具有免疫系统的任何动物，其包括哺 乳动物，例如狗。

如本文所用的“实质上相同”是指至少约90％、至少约95％、至少 约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列一致性程度。

如本文所用的“亚单位疫苗”和“亚单位组合物”是指包括来源于来 自所关注病原体(例如病毒、细菌、寄生虫或真菌)的抗原或与之同 源的抗原但不包括全部抗原的疫苗或组合物类型。此类组合物或疫苗 实质上不含完整病原体细胞或病原性粒子或此类细胞或粒子的裂解 物。因此，亚单位疫苗或亚单位组合物可以由来自病原体或其类似物 中的至少部分纯化或实质上纯化的免疫原性多肽制备。以亚单位疫苗 或亚单位组合物形式获得一或多种抗原的方法包括标准纯化技术、重 组产生或化学合成。因此，“亚单位疫苗”或“亚单位组合物”是指由病毒、 细菌或其它免疫原的一或多种限定抗原组分组成的疫苗或组合物。

“TCID₅₀”是指“组织培养物感染性剂量”并且被定义为感染50％给 定批次接种细胞培养物所需的病毒稀释度。多种方法可以用于计算 TCID₅₀，包括在本说明书通篇中利用的斯皮尔曼-卡勃方法 (Spearman-Karber method)。斯皮尔曼-卡勃方法的描述参见B.W.梅海 (B.W.Mahy)和H.O.坎格鲁(H.O.Kangro),病毒学方法指南(Virology  Methods Manual)25-46(1996)。

如本文所用的“治疗剂”是指辅助治疗病毒性、细菌性、寄生虫性 或真菌性感染、由其造成的疾病或病况的任何分子、化合物、病毒或 治疗(优选地是毒性减弱或死亡的病毒)或亚单位或化合物。

如本文所用的“治疗有效量”是指将在接受抗原或疫苗或组合物的 受试者(例如，狗)中诱导足够预防或改善由病原体(例如病毒、细 菌、寄生虫或真菌)感染造成的疾病征象或症状(包括其不良健康影 响或并发症)的免疫反应的抗原或疫苗或组合物量。可以诱导体液免 疫性或细胞介导免疫性、或体液和细胞介导免疫性两者。动物对抗原、 疫苗或组合物的免疫原性反应可以间接通过测量抗体效价、淋巴细胞 增殖分析或直接通过监测在用野生型株系攻击之后的征象和症状来评 估。由疫苗或组合物赋予的保护性免疫可以通过测量攻击生物体排出 的减少和/或临床征象(例如死亡、发病率、体温和整体身体状况)的 减少、受试者的健康状况和表现来评估。组合物或疫苗的治疗学上有 效的量可以取决于所用特定免疫原或受试者病况而变化，并且可以由 所属领域的技术人员确定。

“治疗”患者的疾病或患者疾病的“治疗”是指：抑制疾病或阻止其发 展；针对疾病进行保护或预防倾向于患病或尚未显示疾病症状的患者 出现疾病；或改善疾病或使疾病消退。同样，术语“保护 (protect/protecting/protection)”等等意味着疾病临床征象减少或消除。 其也可以意味着疾病病原体的减少或消除。

如本文所用的“疫苗”或“疫苗组合物”是指选自改性活病毒或细菌、 毒性减弱病毒或细菌或死亡病毒或细菌、或亚单位疫苗或前述的任何 组合的免疫原性组合物。向受试者投与疫苗引起免疫反应。疫苗可以 通过任何已知投药途径(包括非经肠、经口等等)直接引入到受试者 中。所述术语意味着预防或减少感染或预防或减少感染的一或多种征 象或症状的组合物。疫苗组合物针对病原体的保护作用通常通过在受 试者中诱导免疫反应来实现。一般来说，消除或减少感染发生、改善 征象或症状、或加速从受感染受试者消除微生物指示了疫苗组合物的 保护作用。本发明的疫苗组合物提供针对由犬呼吸道疾病病原体造成 的感染的保护作用。

如本文所用的“兽医学上可接受”是指物质在合理医学判断的范围 内适用于与兽医学受试者组织接触而无不当毒性、刺激、过敏反应等 等，与合理的效益-风险比相称，并且对其预定用途有效。

如本文所用的“兽医学上可接受的载剂”是指不干扰活性成分生物 活性的有效性并且对投与所述载剂的兽医学受试者无毒性的载剂媒 剂。

抗原、免疫原性组合物和疫苗

本发明提供免疫原性组合物和疫苗，其包含一或多种适用于向犬 投与以针对疾病(例如CIRDC)进行治疗的病毒(尤其CRCoV)和任 选地细菌或亚单位。由本发明涵盖的犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)可 以表征为存在于患有感染性呼吸道疾病的狗的呼吸道中的冠状病毒。 CRCoV在系统发生学上与牛冠状病毒(BCoV)、人冠状病毒(HCoV) 株OC43以及血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)最紧密相关；犬肠内冠状 病毒(CCoV)仅与CRCoV远距离相关。

在一个优选的实施例中，CRCoV与US 2007-0098739中所描述的 病毒相同，所述文献的内容由此以引用的方式并入，尤其与其中所描 述的CRCoV病毒株和抗原相关。适合的CRCoV免疫原性片段描述于 WO 2004/011651(皇家兽医学院(Royal Veterinary College))中。适合 的CRCoV免疫原性片段包括纤突蛋白(S)和血球凝集素酯酶(HE) 表面蛋白、膜糖蛋白(M)以及核衣壳蛋白(N)或其免疫原性部分。 在WO 2004/011651中所描述的CRCoV样纤突蛋白和HE蛋白也可能 适用作使针对CRCV的免疫反应提高的药剂。紧密相关的冠状病毒(例 如牛冠状病毒和人冠状病毒)和其免疫原性片段也可能适用作使针对 CRCV的免疫反应提高的药剂。与可以用作针对CRCV的疫苗组分的 药剂相关的WO 2004/011651的全部公开内容以引用的方式并入本文 中。适用于本发明中的CRCoV的另一个实例包括被标识为CRCoV病 毒株4182的病毒株(厄里斯等人,病毒研究(Virus Res.),124:78-87, 2007)。

由本发明涵盖的流感病毒抗原可以是来自任何鸟类或哺乳动物的 任何已标识的流感病毒株，包括(但不限于)具有H3亚型血球凝集素 和N8亚型神经氨酸酶的流感病毒，或H3N8亚型流感病毒，更常称为 H3N8病毒。流感可以是哺乳动物或禽来源的，包括(但不限于)猪、 马或犬来源的。在一个实施例中，使用犬流感抗原。在一个实施例中， 使用马流感抗原。在一个实施例中，使用具有标示为H3或N8的亚型 糖蛋白的病毒株。在一个实施例中，使用具有H3和N8亚型两种糖蛋 白的病毒株。

由本发明涵盖的流感抗原可以从家养和野生的狗、马、猪和飞禽 中分离。被选择用于样品收集的动物应显示急性和/或亚急性临床综合 症，其可以包括轻度到重度的呼吸道症状和发烧。动物还可以展现厌 食和嗜睡的征象。病毒分离的方法是所属领域的技术人员熟知的，包 括：接种哺乳动物或禽细胞培养物，用来自临床样本的鼻或咽部粘液 样品接种含胚卵，通过抹拭鼻孔或咽喉或通过收集例如脾脏、肺、扁 桃体和肝脏的组织来收集，以及肺灌洗。在细胞培养物中可以观察到 病毒的细胞病变效应。可以测试尿囊液或细胞裂解物凝集人类、鸡、 火鸡或豚鼠红血球的能力，其为存在流感病毒的假定证据。

适用于本发明中的犬流感病毒(CIV)株的代表性实例包括被标识 为A/犬/爱荷华州(Iowa)/9A1/B5/08/D12的病毒株，其在2006年6 月29日在弗吉尼亚州20110-2209马纳萨斯市大学大道10801号(10801 University Boulevard,Manassas,VA)的美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection，ATCC)以PTA-7694存放。CIV抗 原的代表性病毒株是CIV(辉瑞(Pfizer)) 中的CIV病毒株。本发明还涵盖包含被标识为马流感病毒株A/马/2/ 迈阿密(Miami)/1/63的病毒株的疫苗。此病毒株存放在ATCC，寄存 编号为VR 317。用于本发明中的流感病毒的其它实例是A/犬/爱荷华 州/13628/2005、A/马/肯塔基州(Kentucky)/1998、A/马/肯塔基州 /15/2002、A/马/俄亥俄州(Ohio)/1/2003、A/马/肯塔基州/1/1994、A/ 马/马萨诸塞州(Massachusetts)/213/2003、A/马/威斯康星州(Wisconsin) /2003、A/马/纽约(NewYork)/1999以及A/马/纽马克特(Newmarket) /A2/1993。CIV的其它优选病毒株和/或分离株包括公开于美国专利第 7,959,929号(尤其其中标识为杰克逊维尔(Jacksonville)/2005、迈阿 密/2005、佛罗里达州(FL)/242/03和佛罗里达州(Florida)/43/04的 病毒株和HA序列)、第7,384,642号、第7,572,620号以及第7,468,187 号中的病毒株和/或分离株，其内容(包括全部序列(尤其HA序列) 和病毒株)由此以引用的方式并入，如同在本文中完全阐述。另外， 适用于本文中的CIV病毒株包括在巴雷尔(Barrell)等人,兽医内科学 杂志(J.Vet.Intern.Med.),24(6),1524-1527(2010)中所描述的科罗拉 多州(Colorado)CIV分离株，其寄存编号为ADW41784。

由本发明涵盖的犬副流感病毒(CPIV)可以表征成已知为与犬舍 咳相关联的病原体的病毒之一。CPIV抗原的代表性病毒株是加5(辉瑞)中的毒性减弱CPI病毒株。CPIV抗原的另一个代 表性病毒株是名称为“NL-CPI-5”的毒性减弱CPI病毒株(爱荷华州艾 姆斯(Ames,IA)的国家兽医服务实验室(National Veterinary Service  Laboratory))。

由本发明涵盖的2型犬腺病毒(CAV-2)可以表征成也已知为与犬 舍咳相关联的病原体的病毒之一。CAV-2抗原的代表性病毒株是加5(辉瑞)中的毒性减弱CAV-2病毒株。CAV-2抗原的代 表性病毒株是标示为“曼哈顿(Manhattan)”病毒株的毒性减弱CAV-2 病毒株(爱荷华州艾姆斯的国家兽医服务实验室)。

由本发明涵盖的犬支原体描述于乔克等人,微生物学, 150:3491-3497,2004中，并且是通常与呼吸道疾病相关联的唯一支原体 属。针对犬支原体的免疫原性组合物描述于US 2007/0098739中，其以 引用的方式并入本文中。

由本发明涵盖的支气管炎博德特菌组分可以表征为与犬舍咳相关 联的细菌性病原体。由本发明涵盖的免疫原性组合物和疫苗可以是以 下各者中的一或多者：毒性减弱的活支气管炎博德特菌、支气管炎博 德特菌菌苗或细菌提取物。另外，组合物优选地还包括支气管炎博德 特菌的分离亚单位抗原。

在一个实施例中，支气管炎博德特菌制备为通过柱色谱超声纯化 的完整细胞，如在1984年10月12日提交的专利申请第FR2571618号 中所提供。支气管炎博德特菌的另一个代表性实例是细菌提取物支气 管药^TM CAe(Bronchicine^TM CAe)(辉瑞)，其由从支气管炎博德特菌 细胞提取的抗原物质制备。支气管炎博德特菌的另一个实例是存在于 中的毒性减弱的活支气管炎菌株B-C2和/或来自 那拉免 疫^TM(Naramune^TM)、尤尼瓦克(Univac) 和/或犬展^TM(Kennel-Jec^TM)的活支气管炎菌株。

另外，还可以存在(即补充有)亚单位与支气管炎博德特菌组分 组合。亚单位的代表性实例是分离百日咳杆菌粘附素抗原，优选地是 支气管炎博德特菌p68抗原，尤其是由p68特异性单克隆抗体Bord 2-7 识别的重组支气管炎博德特菌p68抗原(描述于US 7,736,658中，其 以引用的方式并入本文中)，并且在一个优选实施例中，其具有如在 US 7,736,658中所阐述的氨基酸序列或具有与所述氨基酸序列的同源 性。

由本发明涵盖的病毒可以在细胞、细胞系和宿主细胞中繁殖。所 述细胞、细胞系或宿主细胞可以是例如(但不限于)哺乳动物细胞和 非哺乳动物细胞，包括昆虫和植物细胞。其中可以繁殖由本发明涵盖 的病毒的细胞、细胞系和宿主细胞是所属领域的一般技术人员容易知 道并可获得的。

由本发明涵盖的细菌可以使用所属领域的一般技术人员已知的各 种培养基来培养和繁殖，包括培养液(液体)和琼脂(固体；半固体) 培养基两者。一些细菌也可以在哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞中培 养和繁殖。

由本发明涵盖的病毒和细菌在用于免疫原性组合物或疫苗中之前 可以是毒性减弱或灭活的。使毒性减弱和灭活的方法是所属领域的技 术人员熟知的。用于使毒性减弱的方法包括(但不限于)在适合细胞 系的细胞培养物中连续传代(病毒和一些细菌)、在培养液培养物中连 续传代(细菌)、紫外线照射(病毒和细菌)以及化学诱变(病毒和细 菌)。用于病毒或细菌灭活的方法包括(但不限于)用福马林、β丙内 酯(BPL)或二元亚乙基亚胺(BEI)处理或所属领域的技术人员已知 的其它方法。

用福马林灭活可以通过以下方式来进行：将含有微生物的悬浮液 与37％甲醛混合为最终甲醛浓度0.5％。通过在室温下连续搅拌大约24 小时来混合微生物-甲醛混合物。随后通过分析在适合细胞系或液体培 养基上的生长来测试灭活微生物混合物的残余活生物体。

对于一些抗原，用BEI灭活可以通过以下方式来进行：将本发明 的含有微生物的悬浮液与0.1M BEI(0.175N NaOH中的2-溴-乙胺) 混合为最终BEI浓度1mM。对于其它抗原，最终BEI浓度是2mM。 所属领域的技术人员将知道所用适当浓度。通过在室温下持续搅拌大 约48小时来混合病毒-BEI混合物，接着添加1.0M硫代硫酸钠直到最 终浓度0.1mM。再继续混合两小时。通过分析在适合细胞系或液体培 养基上的生长来测试含有灭活微生物的混合物的残余活病毒。

由本发明涵盖的免疫原性组合物和疫苗可以包括一或多种兽医学 上可接受的载剂。如本文所用，“兽医学上可接受的载剂”包括任何和 全部溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细 菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等等。稀释剂可以包括水、盐 水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等渗剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘 露糖醇、山梨糖醇和乳糖以及所属领域的技术人员已知的其它等渗剂。 稳定剂包括白蛋白以及所属领域的技术人员已知的其它稳定剂。防腐 剂包括硫柳汞以及所属领域的技术人员已知的其它防腐剂。

佐剂可以是可代谢的，即是指佐剂由能够由目标物种代谢的组分 组成，例如基于植物油的佐剂。可代谢的佐剂可以是可代谢的油。可 代谢的油是通常存在于植物和动物中的脂肪和油，并且通常主要由甘 油三脂(也称为三酸甘油酯或中性脂肪)的混合物组成。这些非极性 的水不溶性物质是甘油的脂肪酸三酯。甘油三脂根据其三个脂肪酸残 基或侧链的一致性和位置而不同。

佐剂也可以是不可代谢的，即是指佐剂由无法由投与乳液的动物 受试者的身体代谢的组分组成。适用于本发明组合物中的不可代谢的 油包括烷烃、烯烃、炔烃和其对应酸和醇、其醚和酯以及其混合物。 个别油化合物优选地是轻烃化合物，即此类组分具有6到30个碳原子。 油可以从石油产品中合成制备或纯化。用于本文所描述组合物中的优 选不可代谢油包括例如矿物油、石蜡油和环烷烃。术语“矿物油”是指 不可代谢的佐剂油，其是通过蒸馏技术从石蜡脂中获得的液体烃混合 物。所述术语与“液化石蜡”、“液体石蜡脂”和“白色矿物油”同义。所述 术语还试图包括“轻矿物油”，即类似地通过蒸馏石蜡脂而获得但比重 比白色矿物油略低的油。矿物油可以从各种商业来源获得，例如J.T. 贝克(J.T.Baker)(宾夕法尼亚州菲利普斯堡(Phillipsburg,PA))、 USB公司(俄亥俄州克利夫兰(Cleveland,OH))。轻矿物油可以名 称商购。

佐剂包括(但不限于)乳化剂(Emulsigen)佐剂系统(MVP实验 室；内布拉斯加州罗尔斯顿(Ralston,NE))、RIBI佐剂系统(瑞比公 司(Ribi Inc.)；蒙大拿州汉密尔顿(Hamilton,MT)、矾、氢氧化铝凝 胶、水包油乳液、油包水乳液(例如弗氏完全和不完全佐剂)、嵌段共 聚物(CytRx；佐治亚州亚特兰大(Atlanta,GA)、SAF-M(凯龙公司 (Chiron)；加利福尼亚州爱莫利维尔(Emeryville,CA))、佐剂、皂苷、Quil A、QS-21(剑桥生物技术公司 (Cambridge Biotech Inc.)；马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA))、 GPI-0100(加拉尼卡医药公司(Galenica Pharmaceuticals,Inc.)；亚拉巴 马州伯明翰(Birmingham,AL))或其它皂苷部分、单磷酰基脂质A、 阿夫立定脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)的热不稳定肠毒素(重 组或以其它方式得到)、霍乱毒素、胞壁酰二肽、角鲨烯/普朗尼克嵌段 共聚物/表面活性剂(SP-oil)、磺基脂质β-环糊精(SL-CD)、含有免疫 调节剂的脂质体(例如，CpG或poly I:C)、胞壁酰二肽(MDP)、伊斯 科基质(iscomatrix)(Quil A/磷脂酰胆碱)、CpG/DEAE-葡聚糖/矿物油 (TXO)、CpG、三萜系化合物(例如，Quil A或另一种经纯化或部分 经纯化的皂苷制剂)、固醇(例如，胆固醇)、免疫调节剂(例如，溴 化二甲基二十八烷基铵-DDA)、聚合物(例如，聚丙烯酸，例如)和Th2刺激剂(例如，糖脂，例如月桂)和其组合以及所属领域的技术人员已知的许多其它佐 剂。

可以使用的各种组合的非限制性实例包括三萜系化合物加固醇 (例如，Quil A/胆固醇，也称为QAC)，三萜系化合物加固醇、免疫调 节剂和聚合物(例如，Quil A/胆固醇/DDA/，也称为QCDC)， 以及三萜系化合物加固醇、免疫调节剂、聚合物和Th2刺激剂(例如， Quil A/胆固醇/DDA/和月桂，也称为QCDCR)。

适用于本发明情形中的佐剂和添加剂的量和浓度可以由所属领域 的技术人员容易地确定。在一个实施例中，本发明涵盖包含约20μg 到约2000μg佐剂的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施例中，以约 100μg到约1500μg、或约250μg到约1000μg、或约350μg到约750 μg的量包括佐剂。在另一个实施例中，以约500μg/2ml免疫原性组合 物或疫苗剂量的量包括佐剂。

免疫原性组合物和疫苗还可以包括抗生素。此类抗生素包括(但 不限于)来自氨基糖苷、碳青霉烯、头胞菌素、糖肽、大环内酯、青 霉素、多肽、喹诺酮、磺酰胺以及四环素类别的抗生素。在一个实施 例中，本发明涵盖包含约1μg/ml到约60μg/ml抗生素的免疫原性组合 物和疫苗。在另一个实施例中，免疫原性组合物和疫苗包含约5μg/ml 到约55μg/ml抗生素，或约10μg/ml到约50μg/ml抗生素，或约15μg/ml 到约45μg/ml抗生素，或约20μg/ml到约40μg/ml抗生素，或约25μg/ml 到约35μg/ml抗生素。在又另一个实施例中，免疫原性组合物和疫苗 包含少于约30μg/ml抗生素。

由本发明涵盖的免疫原性组合物和疫苗可以包括一或多种对病毒 或细菌、或病毒或细菌蛋白质进行编码的多核苷酸分子。在免疫原性 组合物或疫苗中可以使用DNA或RNA分子。DNA或RNA分子可以 在不存在其它药剂的情况下投与，或其可以与有助于细胞摄取(例如， 脂质体或阳离子脂质)的药剂一起投与。免疫原性组合物或疫苗中的 总多核苷酸大体上将介于约0.1μg/ml与约5.0mg/ml之间。在另一个 实施例中，免疫原性组合物或疫苗中的总多核苷酸将是约1μg/ml到约 4.0mg/ml，或约10μg/ml到约3.0mg/ml，或约100μg/ml到约2.0 mg/ml。利用核酸(DNA或mRNA)的疫苗和疫苗接种程序已经充分 描述于所属领域中，例如在美国专利第5,703,055号、美国专利第 5,580,859号、美国专利第5,589,466号中，其全部以引用的方式并入本 文中。

除上述病毒或细菌之外，由本发明涵盖的免疫原性组合物和疫苗 可以包括其它额外抗原。抗原可以呈灭活的完整或部分微生物制剂形 式，或呈通过遗传工程改造技术或化学合成获得的抗原分子形式。适 合于根据本发明使用的其它抗原包括(但不限于)来源于以下各者的 抗原：病原性病毒，例如犬瘟热病毒、犬疱疹病毒、犬流感病毒、狂 犬病病毒；病原性细菌，例如布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋 体、流感伤寒型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、波摩那钩端螺 旋体、哈博维斯钩端螺旋体(Leptospira hardjobovis)、卟啉单胞菌 (Porphyromonas spp.)、拟杆菌(Bacteriodes spp.)、疏螺旋体(Borrelia  spp.)、链球菌(Streptococcus spp.)(包括马链球菌亚种兽疫链球菌)、 艾利希体(Ehrlichia spp.)、支原体(Mycoplasma spp.)(包括犬支原体 和犬小孢子菌(Microsporum canis))。抗原也可以来源于病原性真菌， 例如念珠菌属(Candida)；原生动物，例如微小隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum)、犬新孢子虫(Neospora caninum)、刚地弓 形虫(Toxoplasma gondii)、艾美尔球虫(Eimeria spp.)、巴倍虫(Babesia  spp.)、梨形鞭毛虫(Giardia spp.)、利什曼原虫(Leishmania spp.)；或 蠕虫(helminth)，例如绦虫(Taenia)、黄蝇(Cuterebra)、棘球绦虫 (Echinococcus)和并殖吸虫(Paragonimus spp.)。

形式、剂量、投药途径

由本发明涵盖的免疫原性组合物和疫苗可以向动物投与以诱导针 对与CRCoV和另一种病原体(例如支气管炎博德特菌)相关联的多病 原性疾病病况的有效免疫反应。因此，本发明提供刺激有效免疫反应 的方法，其通过向动物投与治疗有效量的本文所描述的免疫原性组合 物或疫苗来进行。

本文所描述的免疫原性组合物和疫苗可以向动物投与以针对 CIRDC为动物受试者接种疫苗。免疫原性组合物和疫苗可以向动物投 与以预防或治疗动物中的CIRDC。因此，本文描述针对CIRDC对动物 接种疫苗和预防或治疗CIRDC的方法，其包含向所述动物投与治疗有 效量的本文所描述的免疫原性组合物或疫苗。

取决于投药途径，由本发明涵盖的免疫原性组合物和疫苗可以制 成为各种形式。举例来说，免疫原性组合物和疫苗可以制成为适用于 可注射使用的无菌水溶液或分散液形式，或使用冷冻干燥技术制成为 冻干形式。冻干免疫原性组合物和疫苗通常维持在约4℃下，并且可以 在稳定化溶液(例如盐水或HEPES)中在存在或不存在佐剂的情况下 复原。免疫原性组合物和疫苗还可以制成为悬浮液或乳液形式。

本发明的免疫原性组合物和疫苗包括治疗有效量的上述微生物中 的一或多者。经纯化的病毒和/或细菌可以在免疫原性组合物或疫苗中 直接加以使用，或可以进一步毒性减弱或灭活。通常，免疫原性组合 物或疫苗含有约1×10²与约1×10¹²个之间的病毒或细菌粒子，或约 1×10³与约1×10¹¹个之间的粒子，或约1×10⁴与约1×10¹⁰个之间的粒子， 或约1×10⁵与约1×10⁹个之间的粒子，或约1×10⁶与约1×10⁸个之间的 粒子。微生物在免疫原性组合物或疫苗中有效提供保护作用的确切量 可以由所属领域的技术人员确定。

免疫原性组合物和疫苗大体上以介于约0.5ml与约5ml之间的体 积包含兽医学上可接受的载剂。在另一个实施例中，载剂的体积在约1 ml与约4ml之间，或在约2ml与约3ml之间。在另一个实施例中， 载剂的体积是约1ml，或是约2ml，或是约5ml。适用于免疫原性组 合物和疫苗中的兽医学上可接受的载剂可以是上文所描述的那些中的 任一者。

所属领域的技术人员可以容易地确定病毒或细菌在投药之前是否 需要进行毒性减弱或灭活。在本发明的另一个实施例中，病毒或细菌 可以在不进行额外毒性减弱的情况下直接向动物投与。治疗学上有效 的微生物量可以取决于所用特定微生物、动物病况和/或感染程度而变 化，并且可以由所属领域的技术人员确定。

根据本发明的方法，可以向动物投与单次剂量，或者，两次或两 次以上接种可以约两周到约十周的时间间隔进行。可能需要强化方案， 并且可以调节给药方案以提供最佳免疫接种。所属领域的技术人员可 以容易地确定最佳投药方案。

免疫原性组合物和疫苗可以直接投与到血流中、肌肉中、内部器 官中或皮肤下。适用于非经肠投药的手段包括静脉内、动脉内、肌肉 内以及皮下投药。适用于非经肠投药的装置包括针(包括微针)注射 器和无针注射器。

非经肠调配物通常是水溶液，其可以含有赋形剂(例如盐)、碳水 化合物、蛋白质以及缓冲剂(优选地达到pH约3到约9，或约4到约 8，或约5到约7.5，或约6到约7.5，或约7到约7.5)，但对于一些应 用，所述调配物可以更适合地调配为无菌非水溶液或调配为待与适合 的媒剂(例如无菌无热原质水或盐水)结合使用的干燥形式。

在无菌条件下例如通过冻干来制备非经肠调配物可以使用所属领 域的技术人员熟知的标准医药技术来容易地实现。

用于制备非经肠溶液的物质的溶解性可以通过使用所属领域的技 术人员已知的适当调配技术来增加，例如并入溶解性增强剂，包括缓 冲剂、盐、表面活性剂、脂质体、环糊精等等。

用于非经肠投药的组合物可以调配为立即释放或修饰释放的。修 饰释放调配物包括缓释、持续释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放 以及程控释放。因此，免疫原性组合物和疫苗可以调配为以植入式积 存形式投与的固体、半固体或触变液体，提供免疫原性组合物和疫苗 的修饰释放。

免疫原性组合物或疫苗投药的其它手段包括通过微针或无针(例 如粉末注射^TM(Powderject^TM)、生物注射^TM(Bioject^TM)等)注射来 递送。

在其中使用皮下或肌肉内注射的情况下，等渗调配物是优选的。 大体上，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、 山梨糖醇以及乳糖。在特定情况下，使用等渗溶液，例如磷酸盐缓冲 盐水。调配物可以进一步涵盖稳定剂，例如明胶和白蛋白。在一些实 施例中，向调配物中添加血管收缩剂。所提供的本发明的药物制剂大 体上是无菌且无热原质的。然而，所属领域的技术人员熟知用于医药 学上接受的载剂的调配物是在由美国农业部(United States Department  of Agriculture)或外国(例如加拿大或墨西哥或欧洲国家中任一者)同 等政府机构颁布的规定中核准用于任何犬疫苗、多肽(抗原)亚单位 免疫原性组合物和疫苗、重组病毒载体疫苗以及DNA疫苗的那些医药 载剂。因此，用于商业生产免疫原性组合物或疫苗的医药学上接受的 载剂是已经由美国或外国适当政府机构核准或将核准的载剂。免疫原 性组合物和疫苗可以进一步与医药学上可接受的佐剂混合。在免疫原 性组合物和疫苗的某些调配物中，所述免疫原性组合物或疫苗与其它 犬免疫原性组合物或疫苗组合以产生可以针对由其它犬病原体造成的 多种疾病对犬进行保护的多价产品。

检测和诊断方法

在动物中诱导的免疫反应的程度和性质可以通过使用多种技术来 评估。举例来说，可以收集来自经接种动物的血清，并且测试对免疫 原具有特异性的抗体存在或不存在。检测淋巴组织中作出反应的细胞 毒性T淋巴细胞(CTL)(指示细胞免疫反应的诱导)可以通过例如T 细胞增殖的分析来实现。相关技术充分描述于所属领域中。

试剂盒

由于可能需要与额外组合物或化合物组合投与免疫原性组合物或 疫苗(例如出于治疗特定疾病或病况的目的)，免疫原性组合物或疫苗 可以方便地包括在适合于投与或共投与组合物的试剂盒形式中或在所 述试剂盒形式中组合处于本发明的范围内。

因此，由本发明涵盖的试剂盒可以包含一或多种独立的医药组合 物(其中至少一者是根据本发明的免疫原性组合物或疫苗)和用于单 独保存所述组合物的部件(例如容器、分隔瓶或分隔的箔片小包装)。 此类试剂盒的一个实例是注射器和针等等。本发明的试剂盒尤其适用 于投与不同剂型(例如口服或非经肠)，适用于以不同给药时间间隔投 与独立组合物，或适用于针对彼此滴定独立组合物。为辅助投与由本 发明涵盖的组合物，试剂盒通常包含投药说明书。

由本发明涵盖的另一种试剂盒可以包含一或多种适用于检测受感 染动物的试剂。试剂盒可以包括用于分析样品中完整微生物、多肽、 表位或多核苷酸序列存在的试剂。病毒、细菌、多肽或多核苷酸序列 的存在可以使用抗体、PCR、杂交以及所属领域的技术人员已知的其 它检测方法来测定。

由本发明涵盖的另一种试剂盒可以提供用于针对特定表位检测抗 体的试剂。此类试剂适用于分析样品中抗体的存在，并且是所属领域 的一般技术人员容易知道并可获得的。抗体的存在可以使用所属领域 的技术人员已知的标准检测方法来测定。

在某些实施例中，试剂盒可以包括一组印刷的说明，或指示试剂 盒适用于检测受感染动物的标签。

抗体

抗体可以是单克隆、多克隆或重组的。抗体可以针对免疫原或其 一部分而制备。举例来说，基于免疫原氨基酸序列或通过克隆技术重 组制备的合成肽或天然基因产物和/或其部分可以经分离并用作免疫 原。免疫原可以用于通过所属领域的技术人员熟知的标准抗体产生技 术来产生抗体。抗体片段也可以通过所属领域的技术人员已知的方法 由抗体制备，并且包括Fab、F(ab')₂和Fv片段。

在抗体产生中，对所需抗体的筛选可以通过所属领域中已知的免 疫学标准方法来实现。一般来说，ELISA和蛋白质印迹法(Western  blotting)是优选的免疫分析类型。两种分析是所属领域的技术人员熟 知的。在分析中可以使用多克隆和单克隆抗体两者。如在所属领域中 熟知的，抗体可以与固体载体底物结合，与可检测部分偶联，或同时 结合和偶联。抗体与固体载体底物的结合也是所属领域中熟知的。涵 盖以用于本发明中的可检测部分可以包括(但不限于)荧光、金属、 酶和放射性标记，例如生物素、金、铁蛋白、碱性磷酸酶、b-半乳糖苷 酶、过氧化酶、尿素酶、荧光素、罗丹明、氚、¹⁴C以及碘化。

通过以下实例进一步展示本发明，本发明决不限于所述实例。

实施例

实例1.使用鼻内雾化用CRCV实验感染狗

研究中包括50只狗，其测定为一般健康状况良好，并且如通过 间接荧光抗体分析(IFA)所测定的，在第0天之前对针对犬呼吸道 冠状病毒(CRCoV)的抗体呈阴性。在第0天，如通过口咽拭子病 毒分离所确定，还证实动物无CRCoV。

表1.研究设计

NA＝不适用

标示为Max的CRCoV分离株用作攻击物质，并且是在HRT18G 细胞单次传代之后获得的。在HRT18G细胞上滴定攻击物质，并且 测定其感染性剂量为10^7.1TCID₅₀/mL。标示为CRCoV NP787的 CRCoV分离株也用作攻击物质，并且是在HRT18G细胞两次传代之 后获得的。在HRT18G细胞上滴定攻击物质，并且测定其感染性剂 量为10^6.5TCID₅₀/mL。

从到达开始到第-3天每日一次观察动物。在第-1天测定体重。 在攻击之前第0天从每一只动物中收集血液样品。在攻击之前第-2 天、第-1天和第0天测定鼓室温度。在第0天攻击之前从每一只狗 中收集两组口咽拭子。将一组拭子收集到VTM(病毒输送培养基) 管中以用于CRCoV病毒分离，并且将另一组收集到埃米斯培养基 (Amies media)中(细菌分离)。在第0天攻击之前从每一只狗中收 集两组鼻部拭子，一组收集到VTM管中以用于CRCoV病毒分离， 并且另一组收集到埃米斯培养基中以用于细菌分离。在攻击之前第 -2天、第-1天和第0天每日一次观察动物的呼吸道疾病临床征象。

解冻CRCoV攻击病毒储备液，并且恰当地稀释到预期攻击剂 量(10^6.0TCID₅₀/狗)。通过使含有5×10^6.0TCID₅₀的攻击雾化为每只 狗1×10^6TCID50的目标攻击剂量来同时攻击五只狗。攻击物质保 持在冰上直到攻击接种。在第0天通过在普列克斯玻璃(Plexiglass) 腔室中雾化持续总共30分钟来向来自处理组T01和T02的狗投与 盐水。首先攻击这些组以避免交叉污染。在第0天通过在普列克斯 玻璃腔室中雾化持续总共30分钟来向来自处理组T03和T04的狗 投与CRCoV Max分离株。在第0天通过在普列克斯玻璃腔室中雾 化持续总共30分钟来向来自处理组T05和T06的狗投与CRCoV  NP787。CRCoV(Max)的攻击后滴定平均值是10^5.2TCID₅₀/mL，并且 CRCoV(NP787)的攻击后滴定平均值是10^4.7TCID₅₀/mL。

在攻击之后从第0天到第14天每日测定鼓室温度。从第0天到 第14天每日一次进行临床观察，每次持续大约30分钟。从第0天 到第10天，将来自每一只狗的鼻部拭子收集到VTM管中以用于 CRCoV病毒分离。在第2天、第3天和第4天将来自每一只狗的口 咽拭子收集到VTM管中。在第4天和第14天从每一只动物中收集 血清学血液样品。

在攻击后第4天对处理组T01、T03和T05进行尸检，并且在 攻击后第14天对处理组T02、T04和T06进行尸检。用过度剂量的 巴比妥酸钠处死动物。在尸检时，无菌移出完整肺并且将其放置在 无菌盖布上。为测定肺实变的总量，对每一个肺叶单独进行实变评 分。横切气管，并且评估内腔的总体病变。由委员会注册的兽医学 病理学家对全部组织进行评估和评分。

在已经对肺进行评分之后，通过经支气管神经丛冲洗大约30.0 mL VTM(无抗生素或抗霉菌素)来灌洗右尾肺叶。在轻轻按摩肺 组织的同时，将VTM培养基缓慢抽吸回注射器中。等分灌洗流体， 并且测试其细菌学和CRCoV病毒分离。

从气管、鼻腔(包括纤毛部分)和右头叶收集组织样品。从气 管和鼻腔收集两组组织样品。一组测试其CRCoV病毒分离，而另 一组制备用于组织病理学。从右头肺叶收集三组组织样品，第一组 测试其细菌学，第二组测试其CRCoV病毒分离，而第三组制备用 于组织病理学。

使用HRT18G细胞测试鼻部和口咽拭子、组织样品以及肺灌洗 液的CRCoV病毒分离。简单来说，处理样品并接种到含有单层 HRT18G细胞的烧瓶中。将经接种的烧瓶在潮湿CO₂孵育箱中在 35℃-37℃下孵育两周。在接种后一周和两周时对经接种的烧瓶进行 取样，同时将样品接种到接种有HRT18G细胞的96孔板的4个孔 中。将经接种的板在潮湿CO₂孵育箱中在35℃-37℃下孵育5-7天。 在孵育时间段结束时，将96孔板中的细胞单层用基于丙酮的溶液固 定，并且用水洗涤。通过使用CRCoV特异性的FITC偶联抗体来进 行荧光抗体染色并且在落射荧光显微镜(epifluorescent microscope) 下观察以测定CRCoV的存在。

通过IFA测试血清样品的CRCoV抗体。简单来说，将HRT18G 细胞接种到96孔板中，并且用病毒稀释液使其感染有CRCoV以达 成每孔50-200个受感染细胞。用基于丙酮的溶液固定受感染的板， 并且冲洗。将测试血清样品直接2倍稀释到固定CRCoV的板中。 将板孵育40-60分钟。冲洗板，并且添加兔抗犬IgG的FITC偶联抗 体。将板孵育40-60分钟。在孵育之后，冲洗培养板，并且在落射 荧光显微镜下检查。抗体效价测定为展现典型(+1)或更高荧光强 度的最高血清稀释度的倒数。

通过血清中和测试血清样品的CRCoV血清中和抗体。简单来 说，将HRT18G细胞以适当密度接种到96孔组织培养板中，并且 在潮湿CO₂孵育箱中在35℃-37℃下孵育3-5天。当细胞单层达到 100％汇合时，用培养基冲洗孔，并且在孵育箱中用补充有胰蛋白酶 的培养基预处理1小时。制备每一个测试血清的两倍稀释液，并且 在室温下与50-300TCID₅₀CRCoV一起孵育40-60分钟。将来自每 一个血清稀释液的病毒-血清混合物接种到四个孔中。将板在潮湿 CO₂孵育箱中在35℃-37℃下孵育5-7天。在孵育之后，弃去培养基， 并且用基于丙酮的溶液固定细胞单层。弃去固定液，并且冲洗板。 通过免疫荧光使用CRCoV特异性的FITC偶联抗体在落射荧光显微 镜下来测定CRCoV的存在。血清中和抗体效价测定为中和50％孔 中病毒的最高血清稀释度的倒数。

主要功效变量是评分为级别>1的受破坏气管纤毛上皮(气管组 织病理学)和病毒分离的存在/不存在。未进行假设测试。计算每一 个处理组中气管、鼻腔和头肺叶组织病理学评分(严重性、分布、 过程和纤毛)的频率分布。另外，气管纤毛上皮进一步分类为正常 (0和1)或异常(2、3和4)。计算每一个处理中此变量的频率分布。 计算每一个处理组和时间点中来自鼻部和口咽拭子的CRCoV病毒 分离存在或不存在的频率分布。计算每一只动物在攻击后在鼻部拭 子中检测到CRCoV病毒的天数[(检测到病毒的最后天数-检测到病 毒的第一天)+1(除非未检测到病毒)]。概括每一个处理中从鼻部拭子 中检测到病毒的天数，并且其描述统计包括平均值、中值、标准差、 最小值以及最大值。计算每一个处理组中来自灌洗液和组织数据的 病毒分离存在/不存在的频率分布。计算每一个处理和时间点中抗体 效价(IFA和SN)的描述统计，包括几何平均值、最小值和最大值。 计算每一个处理组和时间点中每一种临床观察(流鼻涕、咳嗽、打 喷嚏、眼粘分泌物、结膜炎以及抑郁症)的频率分布。计算每一个 处理和时间点中温度的描述统计，包括平均值、标准差、最小值以 及最大值。另外，温度分为<37.0℃、37.0℃-39.5℃、39.6℃-40.0℃、 40.1℃-41.0℃以及41.1℃-42.0℃。计算每一个处理和时间中此新变 量的频率分布。计算每一个处理和时间中每一种测试存在/不存在的 频率分布。

结果.所有狗在第0天(在攻击投药之前)所收集的鼻部和口咽 拭子测试为CRCoV病毒分离阴性。所有狗在第0天(在攻击投药 之前)所收集的血清样品通过间接荧光分析测试为CRCoV抗体阴 性(<40IFA效价)，并且通过血清中和分析测试为CRCoV抗体阴 性(3SN效价)。所有狗在第0天所收集的鼻部和口咽拭子测试为 支气管炎博德特菌和巴氏杆菌(Pasteurella sp)阴性，但在第0天 从鼻部和口咽拭子中分离的支原体、中间葡萄球菌(Staphylococcus  intermedius)和犬链球菌(Streptococcus canis)水平不同。然而， 健康狗常具有这些微生物作为其上呼吸道正常菌丛的一部分。

投与有CRCoV Max分离株(处理组T03和T04)和CRCoV  NP787分离株(处理组T05和T06)的动物中攻击后临床征象大部 分是轻度到中度的，并且包括流鼻涕、咳嗽、打喷嚏以及眼粘分泌 物。从未观察到结膜炎，并且只有一只狗表现出抑郁症。在两种攻 击分离株(CRCoV Max与CRCoV NP787)之间似乎不存在与处理 组T03和T04(用CRCoV Max分离株攻击)以及处理组T05和T06 (用CRCoV NP787分离株攻击)中所观察到的临床征象的致病性相 关联的重大差异。

在处理组T01和T02中投与有安慰剂(盐水)的一些狗在研究 的攻击阶段期间表现出轻度和中度眼粘分泌物。然而，所有这些狗 在第0天攻击之前已经表现出轻度眼粘分泌物。所有用CRCoV Max 分离株攻击的狗(处理组T03和T04)和所有用CRCoV NP787分 离株攻击的狗(处理组T05和T06)的攻击后鼓室温度正常 (≤39.4℃)。在处理组T01和T02中投与有安慰剂的一些狗在研究的 攻击阶段期间的某一点时表现出体温过高(≥39.5℃)。然而，所有 这些狗完全正常和健康，并且之后发现用于处理组T01和T02的鼓 室温度计运行偏高。

总之，归因于CRCoV临床征象的轻度强度并归因于受攻击狗 (CRCoV Max分离株和CRCoV NP787分离株)中不存在体温过高， 这两个判据似乎不足以表征和测量实验室条件下的疾病强度。

对于处理组T03(CRCoV Max分离株，第4天尸检)，鼻部拭 子的CRCoV病毒分离的平均天数是4，而对于处理组T04(CRCoV  Max分离株，第14天尸检)是6。对于处理组T05(CRCoV NP787 分离株，第4天尸检)，鼻部拭子的CRCoV病毒分离的平均天数是 2，而对于处理组T06(CRCoV NP787分离株，第14天尸检)是5。 来自处理组T02中投与安慰剂(盐水)的四只狗在攻击后约第6天、 第7天和第8天的鼻部拭子CRCoV病毒分离呈阳性。这些动物在 攻击后阶段期间都未表现出暗示CRCoV感染的任何临床征象。在 攻击后第14天尸检时，三只狗T02具有总体轻度的肺评分。对所有 这些动物，纤毛评估视为正常的。所有这些动物都未从肺、肺灌洗 液、鼻腔以及气管中获得CRCoV分离，并且出于此原因，野生型 CRCoV分离株不太可能交叉污染安慰剂(盐水)动物房间。另外， 仅在HRT18G细胞第二传代中见到阳性CRCoV病毒分离结果。一 种可能性是样品在实验室测试阶段受交叉污染。

对于处理组T03(CRCoV Max分离株，第4天尸检)，来自口 咽拭子的CRCoV病毒分离的平均天数是2，而对于处理组T04 (CRCoV Max分离株，第14天尸检)是2。对于处理组T05(CRCoV  NP787分离株，第4天尸检)，来自口咽拭子的CRCoV病毒的平均 天数是0，而对于处理组T06(CRCoV NP787分离株，第14天尸检) 是1。由使用CRCoV Max分离株作为攻击生物体(处理组T03和 T04)从鼻腔中收集的拭子获得CRCoV分离的数值最高平均天数。 总之，在感染最早阶段期间所收集的鼻部拭子似乎更可能引起用 CRCoV Max分离株攻击的狗中的阳性CRCoV病毒分离。

在从受安慰剂(盐水)攻击的狗中收集的肺组织中未观察到 CRCoV病毒分离。对于处理组T03(CRCoV Max分离株)，在第4 天尸检时10只狗中的10只(100％)观察到肺组织的阳性CRCoV 病毒分离。对于处理组T05(CRCoV NP787分离株)，在第4天尸 检时10只狗中的7只(70％％)观察到肺组织的阳性CRCoV病毒 分离。对于处理组T04(CRCoV Max分离株)或处理组T06(CRCoV  NP787分离株)，从在第14天尸检时所收集的肺组织中未获得 CRCoV病毒分离。

在从受安慰剂(盐水)攻击的狗中收集的肺灌洗液中未观察到 CRCoV病毒分离。对于处理组T03(CRCoV Max分离株)和处理 组T05(CRCoV NP787分离株)，在第4天尸检时10只狗中的10 只(100％)观察到肺灌洗液的阳性CRCoV病毒分离。对于处理组 T04(CRCoV Max分离株)或处理组T06(CRCoV NP787分离株)， 从在第14天尸检时所收集的肺灌洗液中未获得CRCoV病毒分离。

在从受安慰剂(盐水)攻击的狗中收集的鼻腔中未观察到 CRCoV病毒分离。对于处理组T03(CRCoV Max分离株)和处理 组T05(CRCoV NP787分离株)，在第4天尸检时10只狗中的10 只(100％)观察到鼻腔的阳性CRCoV病毒分离。对于处理组T04 (CRCoV Max分离株)或处理组T06(CRCoV NP787分离株)，从 在第14天尸检时所收集的鼻腔中未获得CRCoV病毒分离。

在从受安慰剂(盐水)攻击的狗中收集的气管中未观察到 CRCoV病毒分离。对于处理组T03(CRCoV Max分离株)或处理 组T05(CRCoV NP787分离株)，在第4天尸检时10只狗中的10 只(100％)观察到气管的阳性CRCoV病毒分离。对于处理组T04 (CRCoV Max分离株)和处理组T06(CRCoV NP787分离株)，从 在第14天尸检时所收集的气管中未获得CRCoV病毒分离。

从在第4天尸检时所收集的肺、肺灌洗液、鼻腔以及气管中成 功地分离出两种攻击分离株(CRCoV Max和CRCoV NP787)。从 在第14天尸检时所收集的肺、肺灌洗液、鼻腔以及气管中未获得两 种攻击分离株(CRCoV Max和CRCoV NP787)的CRCoV病毒分 离。总之，在感染最早阶段期间所收集的肺、肺灌洗液、鼻腔以及 气管似乎更可能引起阳性CRCoV病毒分离。

在肺组织纤毛上皮中未观察到临床上明显病理性变化。在所有处 理组中的大部分狗评分为级别0。在处理组T03(CRCoV Max分离株) 中有一只狗在第4天尸检时评分为级别1。

对于处理组T01和T02(盐水)，分别在第4天和第14天尸检时， 在鼻腔纤毛上皮中未观察到临床上明显病理性变化。对于处理组T03 (CRCoV Max分离株)，在第4天尸检时，所有10只狗显示病变级别2 或更高。对于处理组T04(CRCoV Max分离株)，在第14天尸检时， 10只狗中的6只(60％)显示病变级别2或更高。对于处理组T05 (CRCoV NP787分离株)，在第4天尸检时，10只狗中的9只(90％) 显示病变级别2或更高。对于处理组T06(CRCoV NP787分离株)，在 第14天尸检时，10只狗中的7只(70％)显示病变级别2。

对于处理组T01和T02(盐水)，分别在第4天和第14天尸检时， 在气管纤毛上皮中未观察到临床上明显病理性变化。对于处理组T03 (CRCoV Max分离株)，在第4天尸检时，10只狗中的7只(70％)显 示病变级别2或更高。对于处理组T04(CRCoV Max分离株)，在第 14天尸检时，所有10只狗(100％)显示病变级别1。对于处理组T05 (CRCoV NP787分离株)，在第4天尸检时，所有10只狗(100％)显 示病变级别2或更高。对于处理组T06(CRCoV NP787分离株)，在第 14天尸检时，所有10只狗(100％)显示病变级别1。在用两种攻击分 离株(CRCoV Max和CRCoV NP787)攻击的动物的肺中未观察到级 别2或更高的病理性变化。在用两种攻击分离株(CRCoV Max和 CRCoV NP787)攻击的动物中观察到鼻腔和气管纤毛上皮中级别2或 更高的病理性变化。在第4天尸检时观察到鼻腔中和气管中的大部分 病理性变化(级别2或更高)。总之，在用两种分离株(CRCoV Max 和CRCoV NP787)攻击的动物的鼻腔和气管中观察到纤毛上皮破坏， 并且这些病理性发现似乎在感染最早阶段(第4天尸检)期间更显著。

最突出的组织病理学发现是肺、鼻腔和气管的不同级别的多灶 性炎症。

所有狗在第4天所收集的血清样品通过间接荧光分析测试为 CRCoV抗体阴性(<40IFA)。所有安慰剂(盐水)攻击狗在第14 天所收集的血清样品通过间接荧光分析测试为CRCoV抗体阴性(< 40IFA)。处理组T04(CRCoV Max分离株)中的狗在第14天尸检 时所收集的血清样品的几何平均IFA抗体效价是1040。处理组T06 (CRCoV NP787分离株)中的狗在第14天尸检时所收集的血清样品 的几何平均IFA抗体效价是1689。

所有狗在第4天所收集的血清样品通过血清中和分析测试为 CRCoV中和抗体阴性(3SN效价)。所有安慰剂(盐水)攻击狗在 第14天所收集的血清样品通过血清中和分析测试为CRCoV中和抗 体阴性(3SN效价)。处理组T04(CRCoV Max分离株)中的狗在 第14天尸检时所收集的血清样品的几何平均SN抗体效价是100。 处理组T06(CRCoV NP787分离株)中的狗在第14天尸检时所收 集的血清样品的几何平均SN抗体效价是34。

所有狗在第4天或第14天尸检时所收集的肺灌洗液和肺组织测 试为支气管炎博德特菌、巴氏杆菌、中间葡萄球菌和犬链球菌阴性。 从投与有安慰剂盐水(处理组T01和T02)的2只狗的肺灌洗液中 分离出支原体。从投与有CRCoV Max分离株(处理组T03)的3 只狗的肺灌洗液中分离出支原体。还从投与有CRCoV Max分离株 (处理组T03)的1只狗的肺组织中分离出支原体。这些狗在尸检时 不具有细菌性肺炎的迹象。所有狗在第0天(在攻击投药之前)所 收集的鼻部和口咽拭子测试为CRCoV病毒分离阴性。所有狗在第0 天(在攻击投药之前)所收集的血清样品测试为CRCoV抗体阴性 (IFA和SN)。所有狗在第0天(在攻击投药之前)所收集的鼻部和 口咽拭子测试为支气管炎博德特菌阴性。因此，符合研究的纳入判 据。

结论.用CRCoV Max分离株攻击的所有狗在攻击后阶段期间的 鼻部拭子和口咽拭子测试为病毒分离阳性。用CRCoV NP787分离 株攻击的所有狗在攻击后阶段期间鼻部拭子测试为病毒分离阳性， 而40％-50％的狗口咽拭子测试为病毒分离阳性。因此，此研究具有 有效攻击。

用CRCoV Max分离株攻击的所有狗在第4天尸检时的肺、肺 灌洗液、鼻腔以及气管测试为病毒分离阳性。用CRCoV NP787分 离株攻击的所有狗在第4天尸检时的肺灌洗液、鼻腔、气管测试为 病毒分离阳性，并且70％的狗的肺测试为病毒分离阳性。同样，这 证实此研究具有有效攻击。

投与有CRCoV Max分离株(处理组T03和T04)和CRCoV  NP787分离株(处理组T05和T06)的动物中攻击后临床征象大部 分是轻度到中度的，并且包括流鼻涕、咳嗽、打喷嚏以及眼粘分泌 物。从未观察到结膜炎和体温过高(≥39.5℃)，并且有一只狗表现 出抑郁症。临床征象和鼓室温度似乎不足以表征和测量实验室条件 下CRCoV诱导疾病的强度。

从使用CRCoV Max分离株的鼻腔中收集的拭子获得CRCoV分 离的数值最高平均天数。在感染最早阶段期间所收集的鼻部拭子似 乎更可能引起阳性CRCoV病毒分离。

从在第4天尸检时所收集的肺、肺灌洗液、鼻腔以及气管中成 功地分离出两种攻击分离株(CRCoV Max和CRCoV NP787)。从在 第14天尸检时所收集的肺、肺灌洗液、鼻腔以及气管中未获得两种 攻击分离株(CRCoV Max和CRCoV NP787)的CRCoV病毒分离。 总之，在感染最早阶段期间所收集的肺、肺灌洗液、鼻腔以及气管 样品似乎更可能引起阳性CRCoV病毒分离。

在用两种攻击分离株(CRCoV Max和CRCoV NP787)攻击的 动物的肺中未观察到级别2或更高的病理性变化。在投与有任一攻 击分离株(CRCoV Max和CRCoV NP787)的动物中观察到鼻腔和 气管纤毛上皮中级别2或更高的病理性变化。在第4天尸检时观察 到鼻腔中和气管中的大部分病理性变化(级别2或更高)。总之，在 用分离株(CRCoV Max和CRCoV NP787)攻击的动物的鼻腔和气 管中观察到纤毛上皮破坏，并且这些病理性发现似乎在感染最早阶 段(第4天尸检)期间更显著。

所有狗在第4天或第14天尸检时所收集的肺灌洗液和肺组织测 试为支气管炎博德特菌、巴氏杆菌、中间葡萄球菌和犬链球菌阴性。 从6只狗的肺(灌洗液或组织)中分离出支原体；然而，在尸检时 未观察到细菌性肺炎。总的来说，CRCoV是从呼吸道中分离的唯一 病原体，并且似乎是造成所观察到的临床征象和组织病理学的原因。

总之，通过雾化投与的CRCoV Max分离株或CRCoV NP787分 离株引起自然宿主中的病毒感染和病毒复制。从受攻击狗的鼻部拭 子、口咽拭子、肺、肺灌洗液、鼻腔以及气管分离出CRCoV。大部 分临床征象是轻度的，并且不与疾病表征相关。然而，气管和鼻腔 纤毛上皮的破坏似乎是用于在实验室条件下表征疾病的不变参数。 CRCoV攻击模型和攻击分离株适用于CRCoV部分的疫苗功效研 究。

实例2.犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)、支气管炎博德特菌双感 染模型的发展

研究中包括30只狗，其都处于良好一般健康状况。在CRCoV 攻击(第0天)之前，所有动物如在预先筛选时通过免疫荧光抗体 分析(IFA)<40IFA效价所测定的，对针对CRCoV的抗体呈阴性， 并且对针对CRCoV的血清中和抗体呈阴性(3SN效价)。所有狗在 CRCoV攻击(第0天)之前的鼻部拭子也是CRCoV分离阴性的。 所有动物未针对博德特菌接种疫苗，并且如通过微观凝集测试 (MAT)所测定的，在博德特菌攻击(第3天)之前针对博德特菌的 抗体效价较低(<16MAT效价)。如通过细菌性鼻部拭子分离测试 所测定的，所有动物在CRCoV攻击(第0天)之前也不含博德特 菌。

表2.研究设计

使用标示为Max的CRCoV分离株作为攻击物质。在HRT-18G 细胞上繁殖和滴定病毒，并且测定其效价是10^7.1TCID₅₀/mL。使用 支气管炎博德特菌的Bihr cat菌株作为攻击物质。

到达开始到第-3天每日至少一次观察动物。在第0天CRCoV 攻击投药之前并且在第3天博德特菌攻击投药之前收集血液样品。 在第-2天、第-1天和第0天测定鼓室温度。在第0天攻击之前从每 一只狗中收集三种类型的鼻部拭子：一种收集在小瓶输送培养基 (VTM)管中以用于CRCoV病毒分离；第二种收集在埃米斯培养基 中以用于细菌检查；以及第三种收集在胰蛋白磷酸盐培养液(TPB) 中以用于博德特菌分离。在第3天博德特菌攻击投药之前收集另一 组，用于博德特菌分离。在第-2天、第-1天和第0天(攻击投药之 前)每日两次观察狗的呼吸道疾病临床征象以确立基线值。

在第0天，通过在普列克斯玻璃腔室中雾化持续大约30分钟来 向处理组T01中的狗投与无菌盐水。也在第0天，通过在普列克斯 玻璃腔室中雾化持续大约30分钟来向处理组T03中的狗投与 CRCoV。在第3天，通过在普列克斯玻璃腔室中雾化持续30分钟 来用博德特菌攻击处理组T02和T03中的狗。

在第0天进行一次临床观察(大约30分钟)，并且随后从第1 天到第23天每日两次进行临床观察(每一阶段大约30分钟)。在第 3天，在博德特菌攻击之前和之后进行观察。在第24天，进行单次 观察。在CRCoV攻击之后，从第0天到第24天每日测定鼓室温度。 在攻击投药之后从每一只狗中收集两种类型的鼻部拭子：一种从第 1天到第10天收集在VTM管中以用于CRCoV病毒分离；和第二 种在第6天开始一周分离两次持续三周并且随后在第24天收集在胰 蛋白磷酸盐培养液(TPB)中以用于博德特菌分离。在第24天尸检 之前将另一组拭子样品收集在不含木炭的埃米斯培养基中以用于细 菌检查。在第3天博德特菌攻击之前并且在第24天将用于血清学的 血液样品(大约6mL)收集在SST管中。

在攻击后第24天进行尸检。用过度剂量的巴比妥酸钠使狗安乐 死。在尸检时，无菌移出完整肺并且将其放置在无菌盖布上。为测 定肺实变的总量，对每一个肺叶单独进行评分。横切气管，并且评 估内腔的总体病变。由委员会注册的兽医学病理学家对全部组织进 行评估和评分。在已经对肺进行评分之后，通过经支气管神经丛冲 洗大约30.0mL VTM(无抗生素或抗霉菌素)来灌洗右尾肺叶。在 轻轻按摩肺组织的同时，将VTM培养基缓慢抽吸回注射器中。等 分灌洗流体，并且测试其细菌学以及CRCoV病毒分离。从气管、 鼻腔(包括纤毛部分)和右头叶收集组织样品。从气管和鼻腔收集 两组组织样品。一组测试其CRCoV病毒分离，而另一组制备用于 组织病理学。从右头肺叶收集两组组织样品。测试第一组的细菌学， 并且测试第二组的CRCoV病毒分离。从左中肺叶收集的一组组织 样品制备用于组织病理学。

在第0天CRCoV攻击之前，在第3天博德特菌攻击之前，在 第6天开始并一周分离两次持续三周，并且在第24天收集用于博德 特菌分离的鼻部拭子。每只狗使用两个卡吉抹拭(Calgiswab)拭子， 每一个鼻孔用一个拭子。在CRCoV攻击之前(第0天)，在博德特 菌攻击之前(第3天)并且在研究结束时(第24天)收集用于血清 学(通过IFA/SN用于CRCoV，并且通过MAT用于博德特菌)的血 液。在每一个时间点从每一只狗中收集大约6mL血液。从全血中 分离血清，并且倾析到两个冷冻小瓶中。使用无菌达克伦(Dacron) 拭子来进行用于病毒分离的鼻部拭子收集。在第0天CRCoV攻击 之前，在第3天博德特菌攻击之前，并且从第1天直到第10天收集 拭子。将拭子轻轻插入到每一个鼻孔(每只狗一个拭子)中并且随 后放置到含有大约3mL病毒输送培养基(补充有抗生素的VTM) 的无菌收集管中。在第0天(在攻击投药之前)并在第24天(在尸 检之前)从每一只狗中收集鼻部拭子。将拭子放置到不含木炭的埃 米斯输送培养基中。

对于博德特菌抗体分析，通过颗粒性抗原(微观)凝集测试 (MAT)来测定针对博德特菌的凝集抗体。简单来说，使用“v”底的 微量滴定板，使用含有0.05％吐温20(tween 20)的标准生理盐水 作为稀释剂来制备测试血清、已知阳性血清、阴性血清的两倍连续 稀释液。每孔添加50μL血清样品。向每一个孔中添加50μL博德 特菌抗原，并且在微量滴定板混合器上混合60秒。将板在37±2℃ 下孵育2小时，并且随后在2-8℃下孵育20-48小时。在镜台上以肉 眼读取板。效价表示为显示完全凝集的最高稀释度的倒数。

对于CRCoV间接荧光抗体分析，通过IFA滴定血清样品的抗 CRCoV抗体。简单来说，将HRT-18G细胞接种在96孔板中并且用 最佳量的CRCoV感染，以获得每孔介于50-200个之间的受感染细 胞。用基于丙酮的固定液固定受感染的板，冲洗，并且储存。将测 试血清样品直接2倍连续稀释在抗原固定的板中，并且孵育40-60 分钟。弃去测试血清，冲洗板，并且添加兔抗犬IgG的FA偶联抗 体并孵育40-60分钟。随后冲洗孔，并且在显微镜下检查板的荧光。 抗体效价测定为展现典型(+1)或更强烈荧光的最高血清稀释度的 倒数。

对于CRCoV血清中和分析，在HRT-18G细胞上测定CRCoV 血清中和抗体效价。简单来说，以适当密度将HRT-18G细胞接种在 96孔组织培养板中，并且在CO₂孵育箱中在36℃±1下孵育3-5天。 当孔中的细胞单层100％汇合时，用培养基冲洗孔，并且在孵育箱中 用补充有胰蛋白酶的培养基预处理至少1小时。制备每一个测试血 清的两倍稀释液，并且在室温下与50-422TCID₅₀CRCoV一起孵育 40-60分钟。将来自每一个血清稀释液的病毒-血清混合物接种到两 个孔中。将板在潮湿CO₂孵育箱(3％-5％CO₂)中在35℃-37℃下 孵育5-7天。当孵育完成时，使板固定，用CRCoV特异性的FITC 偶联抗体染色，并且在落射荧光显微镜下检查。血清中和抗体效价 测定为中和50％孔中病毒的最高血清稀释度的倒数。

对于CRCoV分离，在HRT-18G细胞上分析鼻部拭子、组织和 肺灌洗液样品中CRCoV的存在。简单来说，处理样品，并且接种 到接种有HRT-18G细胞的烧瓶中。在T-25烧瓶中接种鼻部样品。 在T-150烧瓶中接种组织和肺灌洗液样品。将经接种的烧瓶在CO₂孵育箱中在36℃±1下孵育过夜。随后，向每一个烧瓶中添加胎牛血 清(FBS)(每个T-25烧瓶80μL或每个T-150烧瓶500μL)。将烧 瓶在CO₂孵育箱中在36℃±1下孵育大约7天。随后收集样品，并 且接种到96孔板中的HRT细胞中。用120微升/孔接种板的四个孔， 并且用30微升/孔接种额外四个孔。将96孔板在CO₂孵育箱中在 36℃±1下孵育5到7天，并且随后用基于丙酮的固定液固定，并且 随后用CRCoV FA染料染色(所有孔)。当在显微镜下观察到典型 荧光(CRCoV FA阳性细胞)时，表明病毒在样品中存在。

对于CRCoV攻击病毒滴定，在HRT-18G上测定攻击物质的效 价。简单来说，以适当密度将HRT-18G细胞接种在96孔组织培养 板中，并且在CO₂孵育箱中在36℃±1下孵育3-5天。当细胞单层 100％汇合时，用培养基冲洗孔，并且在CO₂孵育箱中用补充有胰蛋 白酶的培养基预处理1小时。将十倍连续稀释的测试样品以每个稀 释度重复6次地接种到孔中。将板在潮湿CO₂孵育箱(3％-5％CO₂) 中在35℃-37℃下孵育5-7天。在孵育之后，弃去培养基，并且在室 温下用基于丙酮的固定液孵育细胞20-40分钟。弃去固定液，并且 用水冲洗板两次。向孔中添加CRCoV FITC偶联抗体，并且在室温 下孵育40-60分钟。当孵育完成时，用水冲洗孔两次，随后在落射 荧光显微镜下观察培养板中受CRCoV感染细胞的存在。使用斯皮 尔曼-卡勃方法计算感染力的50％终点，并且病毒效价表示为log₁₀TCID₅₀/mL。

根据标准程序评估鼻部拭子、肺组织和灌洗液样品中支气管炎 博德特菌、支原体、犬链球菌、中间葡萄球菌以及巴氏杆菌的存在。

制备用于鼻腔、肺和气管组织的载玻片，并且由委员会注册的 病理学家评估其组织病理学病变。

有效测试的判据是研究中的所有动物必须：(i)通过病毒分离 确定在第0天不含CRCoV；(ii)在第0天对CRCoV呈血清反应阴 性；(iii)通过细菌分离确定鼻部拭子在第0天和第3天(在博德特 菌攻击之前)不含博德特菌；以及(iv)在攻击之前对博德特菌敏 感，如通过第0天MAT抗体效价保持≤16所确定的。

呼吸道临床征象(包括咳嗽)是用于判断疾病程度的主要判据。 细菌分离是起支撑作用的辅助变量。

计算每一个时间点和处理中临床观察(流鼻涕、咳嗽、打喷嚏、 眼粘分泌物、反胃、抑郁症和呼吸)的频率分布。计算每一只动物 在攻击后观察时间段具有特定临床征象(流鼻涕、咳嗽、打喷嚏、眼 粘分泌物、抑郁症、反胃和呼吸)的数目和百分比以及具有特定临床 征象(流鼻涕、咳嗽、打喷嚏、眼粘分泌物、抑郁症、反胃和呼吸) 的攻击后天数。计算每一个处理中具有临床征象的时间段百分比和每 一种临床征象持续时间的描述统计，包括平均值、中值、标准差、最 小值以及最大值。每一天将动物分类为发烧(≥39.5℃)或不发烧(< 39.5℃)。计算每一个处理和时间点中发烧/不发烧的频率分布。计算 每一个处理组和时间点中来自鼻部拭子的CRCoV分离存在或不存 在的频率分布。计算每一只动物在攻击后鼻部拭子中检测有CRCoV 的天数(检测有病毒的第一天直到检测有病毒的最后一天)。计算处 理平均值、中值、标准差、最小值以及最大值。计算每一个处理组 中来自肺灌洗液、肺、鼻腔以及气管的病毒分离存在/不存在的频率 分布。计算每一个处理和时间点中细菌分离(阳性/阴性)的频率分 布。还测定每一只动物是否具有攻击后分离的细菌，并且计算每一 个处理中所述测定的频率分布。计算每一个处理组中气管、鼻腔和 左中肺叶的每种类型组织病理学评分的频率分布。另外，进一步将 气管纤毛评估分类为正常/组织学上不相关(0和1)或异常/组织学 上相关(2、3和4)，并且计算每一个处理中此分类的频率分布。

用以下方程式计算扩散、分散和总肺涉及情况：

涉及百分比＝0.53[(0.35×右头叶)+(0.15×右中叶)+(0.40×右 尾叶)+(0.10×副叶)]+0.47[(0.30×左头叶)+(0.25×左中叶)+ (0.45×左尾叶)]

计算每一个处理和肺涉及类型的描述统计，包括平均值、中值、 标准差、最小值以及最大值。计算每一个处理组中总体病变、变色 和分泌物增加存在的频率分布。计算每一个时间点中抗体效价的处 理几何平均值、最小值和最大值。计算每一个处理组和时间点中博 德特菌存在/不存在的频率分布。

结果.所有狗在第0天(在攻击之前)所收集的血清样品通过间 接荧光分析测试为CRCoV抗体阴性(<40IFA效价)，并且通过血 清中和分析测试为CRCoV抗体阴性(3SN效价)。所有狗在第0天 (在攻击之前)所收集的鼻部拭子样品通过病毒分离测试为CRCoV 阴性。所有狗在第-21天和第0天(在攻击之前)所收集的血清样品 通过微观凝集测试而测试为博德特菌抗体阴性(<16)。所有狗在攻 击投药之前(第0天)所收集的鼻部拭子测试为博德特菌和巴氏杆 菌阴性。在第0天从鼻部拭子中分离的支原体、伪中间葡萄球菌 (Staphylococcus pseudintermedius)和犬链球菌水平不同。(这些水平 在0％-80％之间变化，其中伪中间葡萄球菌(S.pseudintermedius) 最高，为50％-80％。)然而，健康狗常具有这些微生物作为其上呼 吸道正常菌丛的一部分。因此，符合纳入判据。

对在攻击期间所收集的CRCoV攻击样品进行的滴定证实每只 狗在腔室中雾化10^4.5TCID₅₀。在攻击接种开始和结束时进行的板计 数证实每只狗在腔室中雾化平均5×10⁸CFU博德特菌。

所有处理组的攻击后鼓室温度都是正常的(≤39.4℃)。计算每 一种个别临床征象(流鼻涕、咳嗽、打喷嚏、眼粘分泌物、反胃、 抑郁症和呼吸)的平均值、标准差、中值、最小值以及最大值，以 确定在处理组T02(博德特菌)与处理组T03(CRCoV和博德特菌) 之间是否存在任何差异。与处理组T02(博德特菌，平均值＝7.2) 中的狗相比较，处理组T03(CRCoV和博德特菌，平均值＝38.3)中 狗的流鼻涕时间段百分比增加。与处理组T02(博德特菌，平均值 ＝9.6)中的狗相比较，处理组T03(CRCoV和博德特菌，平均值＝25.1) 中狗的眼粘分泌物时间段百分比也增加。

处理组T01(安慰剂，盐水)、处理组T02(博德特菌)和处理 组T03(CRCoV和博德特菌)中的所有狗在第3天所收集的血清样 品通过间接荧光分析测试为CRCoV抗体阴性(<40IFA效价)，并 且通过血清中和分析测试为CRCoV抗体阴性(3SN效价)。处理组 T01(安慰剂，盐水)和处理组T02(博德特菌)中的所有狗在第 24天所收集的血清样品通过间接荧光分析测试为CRCoV抗体阴性 (<40IFA效价)，并且通过血清中和分析测试为CRCoV抗体阴性(3 SN效价)。处理组T03(CRCoV和博德特菌)中的所有狗在第24 天所收集的血清样品通过间接荧光分析测试为CRCoV抗体阳性(几 何平均IFA效价＝3151.7)，并且通过血清中和分析测试为CRCoV 抗体阳性(几何平均SN效价＝361.8)。

处理组T01(安慰剂，盐水)、处理组T02(博德特菌)和处理 组T03(CRCoV和博德特菌)中的所有狗在第3天所收集的血清样 品通过MAT测试为博德特菌抗体阴性(≤8)。处理组T01(安慰剂， 盐水)中的所有狗在第24天所收集的血清样品通过MAT测试为博 德特菌抗体阴性(8)。处理组T02(博德特菌)中的大多数狗(10 只中的8只)和处理组T03(CRCoV和博德特菌)中的所有狗在第 24天所收集的血清样品通过MAT确定具有博德特菌抗体(16)(T02 和T03的几何平均MAT效价＝13.9)。

对于处理组T01(安慰剂，盐水)，来自鼻部拭子的CRCoV病 毒分离平均天数是0，对于处理组T02(博德特菌)是0，并且对于 处理组T03(CRCoV和博德特菌)是6。在第24天尸检时从任一处 理组中的肺灌洗液、肺组织、鼻腔或气管中未分离出CRCoV。

从在第6、9、13、16、20、23以及24天由处理组T02(博德 特菌)和处理组T03(CRCoV和博德特菌)收集的鼻部拭子中分离 出博德特菌。处理组T01(安慰剂，盐水)中的所有狗在第24天所 收集的肺灌洗液和肺组织测试为博德特菌分离阴性。处理组T02(博 德特菌)中和处理组T03(CRCoV和博德特菌)中的所有狗在第24 天所收集的肺灌洗液和肺组织测试为博德特菌阳性。在第24天从鼻 部拭子中分离的支原体、伪中间葡萄球菌和犬链球菌水平不同。处 理组T01(安慰剂，盐水)、处理组T02(博德特菌)和处理组T03 (CRCoV和博德特菌)中的所有狗在第24天测试为巴氏杆菌阴性。 处理组T03(CRCoV和博德特菌)中的一只狗从肺灌洗液中分离有 支原体。处理组T01(安慰剂，盐水)、处理组T02(博德特菌)和 处理组T03(CRCoV和博德特菌)中的所有狗在第24天尸检时的 肺灌洗液和肺组织测试为巴氏杆菌、伪中间葡萄球菌和犬链球菌阴 性。

用CRCoV和博德特菌攻击的动物(处理组T03)宏观和微观肺 病变的发病率和严重性比仅用博德特菌攻击的动物(处理组T02) 和盐水(安慰剂)动物(处理组T01)高。处理组T02与T03中微 观气管和鼻部病变的盛行率和严重性类似。在用双重攻击的动物中 观察到的肺病变发病率和严重性表明用CRCoV感染使狗倾向于在 用博德特菌感染之后出现肺炎。然而，这些数据必须与细菌和病毒 分析相关，以及与受感染动物中临床征象的表现相关。

结论.符合纳入判据在于：(i)所有狗是健康的并且未接受任何 博德特菌疫苗接种；(ii)所有狗在攻击之前是CRCoV抗体阴性(< 40IFA效价)并且是CRCoV血清中和抗体阴性(3SN效价)；(iii) 所有狗在攻击之前的鼻部拭子是CRCoV分离阴性；并且(iv)所有 狗在攻击之前对博德特菌抗体效价较低(≤8MAT效价)，并且鼻部 拭子不含博德特菌分离。

攻击视为令人满意的，因为：(i)用CRCoV攻击的所有狗的鼻 部拭子(第24天)是CRCoV病毒分离阳性；和(ii)用博德特菌 攻击的所有狗的鼻部拭子(第9天)是细菌分离阳性。

处理组T01(安慰剂，盐水)、T02(博德特菌)和T03(CRCoV 和博德特菌)的攻击后鼓室温度正常(≤39.4℃)。关于在攻击后阶 段期间评估的临床征象(流鼻涕、咳嗽、打喷嚏、眼粘分泌物、反 胃、抑郁症和呼吸)，观察到与处理组T02(博德特菌，平均值＝7.2) 中的狗相比较，处理组T03(CRCoV和博德特菌，平均值＝38.3) 中的狗流鼻涕时间段百分比增加，并且与处理组T02(博德特菌， 平均值＝9.6)中的狗相比较，处理组T03(CRCoV和博德特菌，平 均值＝25.1)中的狗眼粘分泌物时间段百分比增加。当比较处理组 T02(博德特菌)与处理组T03(CRCoV和博德特菌)时，其它临 床征象(咳嗽、打喷嚏、反胃、抑郁症和呼吸)似乎并无不同。

处理组T02(博德特菌)和T03(CRCoV和博德特菌)中的所 有狗在研究结束时(第24天)所收集的肺灌洗液和肺组织测试为博 德特菌阳性。从在研究结束时(第24天)所收集的处理组T03 (CRCoV和博德特菌)肺灌洗液、肺组织、鼻腔或气管样品中未分 离出CRCoV。先前内部研究已证实在攻击第一周内更容易从肺灌洗 液和肺组织中分离CRCoV。处理组T01(安慰剂，盐水)、T02(博 德特菌)和T03(CRCoV和博德特菌)中的所有狗在研究结束时(第 24天)所收集的肺灌洗液和肺组织测试为巴氏杆菌、伪中间葡萄球 菌、支原体(不同之处在于处理组T03的一只狗)和犬链球菌阴性。 扩散、分散和总肺实变平均值对用CRCoV和博德特菌攻击的动物 (处理组T03)来说较高。在这些动物中观察到的肺病变发病率和严 重性表明用CRCoV感染使狗倾向于在用博德特菌感染之后出现肺 炎。

总的来说，鼻涕/眼粘分泌物和尸检数据似乎指示用CRCoV预 感染狗在用博德特菌继发感染后增加呼吸道疾病的发病率和严重 性。

实例3.CRCoV疫苗针对用CRCoV和支气管炎博德特菌双重攻击 的功效

研究中包括60只狗，其都处于良好一般健康状况。所有动物都未 接受任何博德特菌疫苗接种，并且如通过微观凝集测试(MAT)所测 定的，在疫苗接种(第0天)之前针对支气管炎博德特菌的抗体水平 较低(≤8MAT效价)。如通过细菌性鼻部拭子分离测试所测定的，所 有动物在疫苗接种(第0天)之前也不含支气管炎博德特菌。在疫苗 接种(第0天)之前，所有动物如通过免疫荧光抗体分析(IFA)<40IFA 效价所测定的，以及通过血清中和(SN效价≤11)所测定的，对针对 CRCoV的抗体也呈阴性。在第0天疫苗接种之前通过鼻部拭子病毒分 离证实所有狗无CRCoV。

表3.研究设计

1-研究性兽医学产品(IVP)或对照产品(CP)-一起称为IVP。

2-皮下

在这一研究中使用标示为Max的CRCoV分离株作为攻击物质。 在HRT-18G细胞系中的第一传代产生效价为10^7.1TCID₅₀/mL的病毒储 备液。在这一研究中还使用支气管炎博德特菌Bihr cat菌株作为攻击物 质。

从到达开始直到攻击(第-7天到第42天)每日一次观察动物的一 般健康状况。在疫苗接种日(第0天和第21天)，观察动物两次(在 疫苗接种之前和之后)。在第0天和第21天(在疫苗接种之前)、第42 天(在攻击之前)和第65天从研究的所有动物中收集用于血清学的血 液样品。从每一只狗中收集三种类型的鼻部拭子。在第0天疫苗接种 之前、第42天攻击之前和第43天到第52天每日一次将鼻部拭子收集 在病毒输送培养基(VTM)管中以用于CRCoV病毒分离。将鼻部拭 子收集在含有胰蛋白磷酸盐培养液(TPB)的管中以用于博德特菌分离。 在第0天疫苗接种之前、第45天攻击之前和攻击之后每周两次持续3 周以及在第65天收集拭子。在第42天攻击之前将鼻部拭子收集在不 含木炭的埃米斯培养基中以用于细菌学检查。从第-1天开始；在第0 天和第21天疫苗接种之前和疫苗接种之后3-6小时、第1天到第7天、 以及第22天到第28天收集鼓室温度。从第40天到第65天每日一次 收集鼓室温度。在攻击日(第42天和第45天)，在攻击前和在攻击之 后3-6小时进行两次收集。

在第0天和第21天疫苗接种之前，在适当肩部区域触诊动物，以 确保在注射位点区域上无预先存在的病变。根据表3中所示的研究设 计，在第0天和第21天向动物投与适当的疫苗。向每一只狗的右肩部 区域皮下投与疫苗以进行第一疫苗接种，并且在左肩部区域中投与以 进行第二疫苗接种。在疫苗接种之前通过ELISA测试来测定CRCoV 疫苗的效力。在第0天和第21天疫苗接种后大约5小时，并且在第1 天到第7天和第22天到第28天每日一次观察动物。

在第42天，解冻CRCoV攻击病毒储备液，并且恰当地稀释以制 备传递每只狗1×10⁶目标攻击剂量的病毒悬浮液。将攻击物质保持在 冰上直到攻击接种。在第45天，使用支气管炎博德特菌Bihr cat菌株 储备液来制备攻击物质。在攻击悬浮液制备的最终步骤中，调节生物 体浓度以提供每只狗10³CFU(T01/T02)、每只狗10⁵CFU(T03/T04) 和每只狗10⁷CFU(T05/T06)的目标攻击剂量。将攻击物质保持在冰 上直到攻击接种。

在第42天，通过在普列克斯玻璃腔室中雾化来向来自所有处理组 的狗投与病毒。在第45天，通过在普列克斯玻璃腔室中雾化来用指定 水平的支气管炎博德特菌攻击来自适当处理组的狗。对于T04攻击组， 在攻击之前从研究中移出一只动物。

在第40天、第41天和第42天攻击之前每日两次(上午和下午) 观察动物的呼吸道疾病临床征象，每一个阶段持续大约30分钟。从第 42天直到第64天每日两次(上午和下午)进行临床观察，每一个阶段 大约30分钟。在第42天和第45天，观察发生在攻击之前和攻击投药 后3-6小时。在第65天，仅进行一次观察(上午)。

作为研究评估的一部分，在第65天对所有动物进行尸检。在尸检 时，无菌移出完整肺并且将其放置在无菌盖布上。粗略评估肺叶，并 且评估受感染肺体积百分比的估算值。由ACVP委员会注册的病理学 家进行组织评估。为了测定受感染肺的体积百分比，通过总体变化对 每一个肺叶中受感染组织的百分比进行评分，所述总体变化可以包括 (但不限于)变色(颜色变化)、收缩失败或肌理变化(坚韧/实变、弹 性/橡胶状、硬或捻发音)。估计分散或扩散病变涉及的百分比。横切气 管，并且评估内腔的总体病变。从气管和鼻腔中收集两种类型的组织 样品(部分)，一种用于病毒分离，并且另一部分用于组织病理学。将 右头肺叶分成两个部分，一个用于病毒分离并且一个用作细菌学样品。 在支气管神经丛处无菌切断完整左中肺叶并且收集以用于组织病理 学。在已经收集所有其它样品(病毒分离和细菌学)之后；用大约20-30 mL的10％缓冲福马林使叶片膨胀，随后放置到福马林容器中。

根据标准程序，对动物筛选通过IFA，而对所有其它样品(第0、 21、42以及65天)通过血清中和(SN)来滴定血清样品中CRCoV特 异性的抗体。

通过IFA来滴定筛选血清样品的CRCoV抗体。简单来说，将 HRT-18G细胞接种在96孔板中并且用最佳量的CRCoV感染，以获得 每孔介于50-200个之间的受感染细胞。用基于丙酮的固定液固定受感 染的板，冲洗，并且储存。将测试血清样品直接2倍连续稀释在抗原 固定的板中，并且孵育40-60分钟。弃去测试血清，冲洗板，并且添加 兔抗犬IgG的FA偶联抗体并孵育40-60分钟。随后冲洗孔，并且在显 微镜下检查板的荧光。抗体效价测定为展现典型(+1)或更强烈荧光 的最高血清稀释度的倒数。

在HRT-18G细胞上测定CRCoV血清中和抗体效价。简单来说， 以适当密度将HRT-18G细胞接种在96孔组织培养板中，并且在CO₂孵育箱中在36℃±1下孵育3-5天。当孔中的细胞单层100％汇合时， 用培养基冲洗孔，并且在孵育箱中用补充有胰蛋白酶的培养基预处理 至少1小时。制备每一个测试血清的两倍稀释液，并且在室温下与 50-422TCID₅₀CRCoV一起孵育40-60分钟。将来自每一个血清稀释液 的病毒-血清混合物接种到两个孔中。将板在潮湿CO₂孵育箱(3％-5％ CO₂)中在35℃-37℃下孵育5-7天。当孵育完成时，使板固定，用CRCoV 特异性的FITC偶联抗体染色，并且在落射荧光显微镜下检查。血清中 和抗体效价测定为中和50％孔中病毒的最高血清稀释度的倒数。

根据标准程序，通过颗粒性抗原(微观)凝集测试(MAT)来测 定针对博德特菌的凝集抗体。简单来说，在v底的微量滴定板中，使 用含有0.05％吐温20的标准生理盐水作为稀释剂来制得测试血清、已 知阳性血清、阴性血清的两倍连续稀释液。每孔添加50μL血清样品。 向每一个孔中添加50μL体积的支气管炎博德特菌抗原，并且在微量 滴定板混合器上混合60秒。将板在37±2℃下孵育2小时，并且随后在 2-8℃下储存20-48小时。在镜台上以肉眼读取板。效价表示为显示完 全凝集的最高稀释度的倒数。

在HRT-18G细胞上分析鼻部拭子和组织中CRCoV的存在。简单 来说，处理样品，并且接种到接种有HRT-18G细胞的烧瓶中。在T-25 烧瓶中接种鼻部样品。在T-150烧瓶中接种组织和肺灌洗液样品。将经 接种的烧瓶在CO₂孵育箱中在36℃±1下孵育过夜。随后，向每一个烧 瓶中添加胎牛血清(FBS)(每个T-25烧瓶80μL或每个T-150烧瓶500 μL)。将烧瓶在CO₂孵育箱中在36℃±1下孵育大约7天。随后取出样 品，并且接种到96孔板中的HRT细胞中。以120微升/孔接种板的四 个孔，并且以30微升/孔接种额外四个孔。将96孔板在CO₂孵育箱中 在36℃±1下孵育5到7天，用基于丙酮的固定液固定，并且随后用 CRCoV FA染料染色(所有孔)。当在显微镜下观察到典型荧光(CRCoV  FA阳性细胞)时，表明病毒在样品中存在。

在HRT-18G上测定攻击物质的效价。简单来说，以适当密度将 HRT-18G细胞接种在96孔组织培养板中，并且在CO₂孵育箱中在36℃ ±1下孵育3-5天。当细胞单层100％汇合时，用培养基冲洗孔，并且在 CO₂孵育箱中用补充有胰蛋白酶的培养基预处理1小时。将十倍连续稀 释的测试样品以每个稀释度重复6次地接种到孔中。将板在潮湿CO₂孵育箱(3％-5％CO₂)中在35℃-37℃下孵育5-7天。在孵育之后，弃 去培养基，并且在室温下用基于丙酮的固定液孵育细胞20-40分钟。弃 去固定液，并且用水冲洗板两次。向孔中添加CRCoV FITC偶联抗体， 并且在室温下孵育40-60分钟。当孵育完成时，用水冲洗孔两次，随后 在落射荧光显微镜下观察板中受CRCoV感染细胞的存在。使用斯皮尔 曼-卡勃方法计算感染力的50％终点，并且病毒效价表示为log₁₀TCID₅₀/mL。

根据标准程序进行来自鼻部拭子的支气管炎博德特菌分离。定性 测试每一个样品的支气管炎博德特菌(存在或不存在)。根据标准程序 评估鼻部拭子和肺组织样品中支气管炎博德特菌、支原体、犬链球菌、 中间葡萄球菌以及巴氏杆菌的存在。制备用于鼻腔、肺和气管组织的 载玻片，并且由ACVP委员会注册的病理学家评估其组织病理学病变。

计算每一只动物中咳嗽和流鼻涕的攻击后观察时间段百分比，以 及咳嗽和流鼻涕的攻击后持续天数。用通用线性混合模型单独地分析 每一种攻击剂量(T01对比T02，T03对比T04和T05对比T06)中经 平方根反正弦变换的观察时间段百分比和持续时间。模型中的固定效 果是处理，而随机效果是阻止和残余。除最小二乘平均值、标准差和 90％置信限之外，计算处理最小值和最大值。最小二乘平均值、标准差 和置信限按需要变换回原样。计算每一个处理组和时间点中来自鼻部 拭子的CRCoV病毒分离存在或不存在的频率分布。计算每一只动物在 攻击后鼻部拭子中检测有CRCoV病毒的天数(检测有病毒的第一天直 到检测有病毒的最后一天)。计算每一个处理组中来自组织数据的病毒 分离存在/不存在的频率分布。计算每一个处理中来自拭子的支气管炎 博德特菌分离的频率分布。计算每一个处理和时间点中来自鼻部拭子 的支气管炎博德特菌分离的频率分布。计算每一只动物在攻击后鼻部 拭子中检测有细菌的天数(检测有病毒的第一天直到检测有病毒的最 后一天)。计算每一个处理中天数的描述统计，包括平均值、标准差、 最小值以及最大值。计算每一个时间点和处理中临床观察(打喷嚏、 眼粘分泌物、反胃、抑郁症和呼吸)的频率分布。每一天将动物分类 为发烧(≥39.5℃)或不发烧(<39.5℃)。计算每一个处理和时间点 中发烧/不发烧的频率分布。

用以下方程式计算扩散、分散和总肺涉及情况：

涉及百分比＝0.53((0.35×右头叶)+(0.15×右中叶)+(0.40×右尾 叶)+(0.10×副叶))+0.47((0.30×左头叶)+(0.25×左中叶)+(0.45×左 尾叶))。

用通用线性混合模型单独地分析每一种攻击剂量(T01对比T02， T03对比T04和T05对比T06)中经平方根反正弦变换的涉及百分比。 模型中的固定效果是处理，而随机效果是阻止和残余。除最小二乘平 均值、标准差和90％置信限之外，还计算处理最小值和最大值。最小 二乘平均值、标准差和置信限变换回原样。计算每一个处理组中总体 病变、变色和分泌物增加存在的频率分布。计算每一个时间点和处理 中注射位点观察(膨胀和疼痛)的频率分布。将计算每一个处理组和 时间点中抗体效价的描述统计，包括几何平均值、最小值和最大值。

结果.在疫苗接种之后，在任何一只狗中都未报道有疼痛或发烧 (≥39.5℃)。报道大部分接受疫苗接种者(T02、T04、T06)在疫苗接 种时进行抓挠。在大部分接受疫苗接种者中报道注射肿胀，但大部分 狗的这些肿胀在3天或3天以内中消退。报道三只狗在第二次疫苗接 种观察后3-6小时期间具有超敏反应。用苯海拉明(Diphenhydramine) 处理其中两只狗以逆转症状。

CRCoV疫苗在第一剂量之后在接种疫苗的狗中诱导血清中和抗体 反应，指示活性免疫接种。与盐水对照组(T01、T03、T04)中GMT< 4相比较，在接种疫苗组(T02、T04、T06)中在第二次疫苗接种之后， 几何平均血清中和(SN)反应增加到GMT≥955，指示疫苗的增强剂 效果。在与盐水对照组(GMT≤446)相比时，接受疫苗接种者中在攻 击(第65天)之后实现稳健回忆SN反应(GMT≥11146)，指示有效 免疫记忆体反应。

针对双重攻击剂量滴定评估CRCoV疫苗的功效。CRCoV攻击剂 量水平(确认为10^5.5TCID₅₀/狗)保持恒定，同时支气管炎博德特菌攻 击剂量对组T01和T02给定为每只狗10³CFU的低靶标(确认为5.4× 10³)，对组T03和T04给定为每只狗10⁵CFU的中等靶标(确认为4.2 ×10⁵)，并且对组T05和T06给定为每只狗10⁷CFU的高靶标(确认为 4.3×10⁷)，以确保诱导最佳临床疾病。攻击后CRCoV和博德特菌生物 体分离数据指示三个剂量水平在接种狗中实现感染。然而，如下文所 论述，基于在狗中所诱导的临床疾病水平，较低博德特菌攻击剂量测 定为用于评估疫苗功效的最佳剂量。

盐水对照狗(T01、T03和T05)显示大范围的呼吸道临床征象， 包括咳嗽。在低剂量攻击组中，当与对照(T01)相比较时，接受疫苗 接种者(T02)的咳嗽持续时间和时间段百分比明显减少(p值分别是 0.0470和0.0033)。与接受疫苗接种者(T02)中分别是5.3和2.4相比 较，对照组(T01)中咳嗽持续时间最小二乘(LS)平均值和时间段百 分比变换回LS平均值分别是10.8和14.7。随着攻击剂量增加，在接 受疫苗接种者与对照之间的咳嗽减少逐渐减小，很可能归因于过度攻 击。咳嗽数据明确指示CRCoV疫苗能够诱导的免疫性足以减少由最佳 攻击剂量组中双重攻击诱导的咳嗽。流鼻涕数据显示，在与对照(平 均值17.4)相比时，接受疫苗接种者(T02)中流鼻涕的时间段百分比 明显减少(平均值4.6)，其中低剂量攻击组中的p值是0.0299。如对 咳嗽所论述的，由于达到过度攻击剂量，在接受疫苗接种者与对照之 间的流鼻涕减少逐渐减小。流鼻涕数据明确指示疫苗针对最佳攻击剂 量组中流鼻涕的功效。在攻击后时间段期间，每天一只报道总共5只 狗的体温≥39.5℃，其中四只来自盐水对照组，而一只来自接种疫苗组 (T02；第44天)。虽然数据显示，在低剂量下，在接受疫苗接种者中 发烧的动物与对照相比较少，但发烧不能称为CRCoV、博德特菌或双 重攻击的不变判据。因此，其不用于判断疫苗功效。

在第65天由ACVP委员会注册的病理学家进行呼吸道器官的总体 尸检评估。检查揭示主要尸检发现是肺实变。这与先前双重攻击研究 发现一致。因此，使用肺实变作为判断疫苗功效的判据。在低剂量攻 击组中，在与对照相比时，在接受疫苗接种者中观察到的分散肺实变 (平均百分比0.9对比4.02)和总肺实变(平均百分比1.44对比7.7) 明显减少，其中p值分别是0.0457和0.093。与临床征象一致，随着攻 击剂量增加并且达到过度攻击，由疫苗实现的减少逐渐减小。重要的 是应注意，如由细菌学检查结果所证实的，在肺组织中未涉及其它呼 吸道病原体，即所报道的肺部病变特异性地是双重攻击的结果。数据 表明先前用病毒感染通过影响狗的固有免疫防御而使狗倾向于感染， 引起更多侵入性细菌性感染。常在以下领域中出现的病毒-细菌感染的 典型模式：在犬呼吸道疾病复合征(CIRD)中引起狗肺炎发展或在牛 呼吸道疾病复合征(BRDC)中引起牛肺炎发展，并且可能也在其它动 物物种中引起肺炎发展。在这一研究中所获得的数据指示，在最佳攻 击剂量下，在与对照相比时，疫苗能够通过在接种疫苗的狗中减少由 双重攻击造成的支气管肺炎的出现来保护狗。

基于宏观和微观病理性分析，用CRCoV进行疫苗接种明确地通过 减少由使用10³CFU支气管炎博德特菌和10⁶TCID₅₀CRCoV的受控双 重鼻内攻击所造成的支气管肺炎的发病率和严重性来保护狗。当使用 支气管炎博德特菌的攻击剂量增加到10⁵CFU或更高时，保护效果减 少，可能归因于固有和适应性免疫反应过剩。此外，病理性发现与在 接种疫苗的狗中报道的呼吸道临床征象减少充分相关。

如所预期的，在第65天(在CRCoV攻击之后第23天)从组织中 未分离出病毒，归因于病毒感染的快速逃逸性质(quick hit-and-run  nature)。与盐水对照(T01)相比时，疫苗在接受疫苗接种者(T02) 中通过减少流鼻涕持续时间来保护狗，指示疫苗减少最佳攻击剂量组 中感染的能力。

总之，从此研究中获得的临床征象(咳嗽、流鼻涕)和肺部病变 (实变、组织病理学)数据明确地展示由针对双重CRCoV-支气管炎博 德特菌攻击的单价CRCoV疫苗得到的保护。这些数据共同指示单价 CRCoV疫苗能够在接种疫苗的狗中诱导保护性免疫，所述保护性免疫 使得由双重CRCoV-支气管炎博德特菌攻击造成的呼吸道疾病(咳嗽、 流鼻涕)和肺炎(肺实变)减少。因此，数据提供CRCoV疫苗在减少 在初始CRCoV感染与后续细菌感染之后的狗中呼吸道疾病中的效用证 据。