法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-04-16
授权
授权
2015-04-01
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K47/48 申请日:20130312
实质审查的生效
2015-03-04
公开
公开
有关联邦政府发起的研究或开发的声明
本发明是在政府支持下根据授予贾斯汀·斯考特·汉斯(Justin Scot Hanes)的协定 R01CA140746、P30EY001765和U54CA151838由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)且根据授予彼特·安东尼·坎帕杰罗(Peter Anthony Campochiaro) 的协定R01EY012609由美国国家卫生研究院进行。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本发明涉及具有改进的功效、稳定性、安全性和形成纳米粒子和微粒的简易 性的非线性多嵌段共聚物-药物结合物，以及其用于活性剂的控制递送，尤其用于 活性剂向眼睛的控制递送的使用方法。
背景技术
约170万名年龄超过65岁的美国人罹患年龄相关黄斑变性(AMD)。由于美国 人口持续老龄化，预期这一数目以每年估计有200,000个新病例增长。由AMD和其 它影响后段的疾病，包括糖尿病性视网膜病变、青光眼和色素性视网膜炎所致的严重 视力丧失是全世界不可逆失明的大多数病例的原因。
目前，后段疾病的治疗在很大程度上受到如下困难限制，即向眼后部的目标组织 递送有效剂量的药物，同时避免毒性。四种投予模式通常用于向眼睛的后段递送药物： 表面、全身、眼内和眼周投予。
表面投予，例如向眼睛表面施用溶液，是用于眼部疾病的药理管理的治疗剂的最 常见投予模式。表面投予具有以下优势，即具有最低程度的侵袭性；然而，多种因素 可限制其有用性。实例包括由角膜上皮提供的对溶质流的显著阻挡，和由于引流和泪 液周转而发生的快速且广泛的角膜前损失。已估计通常少于5％的表面施用的药物透 入角膜且到达眼内组织。所滴注的剂量的大部分是借助于结膜，通过高度血管性结膜 基质且通过睑缘血管全身性吸收。显著全身性吸收也会在溶液进入鼻泪管且由鼻和鼻 咽粘膜吸收时发生。尽管最终到达前段眼部组织的表面施用的药物剂量占相对较小比 例，但表面调配物可在一些情况下有效，这主要是由于可投予的药物的极高浓度。
表面药物递送的近期进展已集中于改进眼部药物接触时间和从眼睛表面到后段 的药物递送。例如，已开发软膏、凝胶、脂质体调配物和各种持续和控制释放基质， 例如系统、胶原膜和水凝胶镜片，以改进眼部药物接触时间。使用聚合凝 胶、胶体系统和环糊精的表面递送系统也已致力于改进药物向后段的递送来研究。尽 管有这些努力，通过表面途径将治疗剂量的药物递送到眼睛后段仍存在显著挑战。
用于治疗后段疾病的药物也可全身性投予。尽管全身性投予可递送药物到眼后 部，但通常需要大的全身性剂量以在玻璃体、视网膜或脉络膜后产生治疗药物含量。 因此，全身性投予一般受与治疗剂的大全身性剂量投予相关的显著副作用困扰。
使用结膜下或眼球后注射的眼周药物递送或持续释放装置的放置会提供向眼睛 后部组织递送药物的另一途径。这种方法提供局部、持续释放药物递送的潜力。平均 17cm2的人类巩膜表面积占眼球的总表面积的95％，且相比1-cm2的角膜表面积，提 供显著更大的使药物扩散到眼睛内部的途径。另外，巩膜厚度的区域差异可能用于进 一步优化跨巩膜药物扩散，条件是持续释放递送装置或系统可能放置在其中巩膜渗透 性最大的区域中。例如，巩膜在视神经附近为1.0mm厚且在角膜巩膜缘处为平均0.53 mm厚且在赤道处薄到平均0.39mm，在大量眼睛中的赤道中其可薄到0.1mm。参看 吉拉斯基(Geroski)等人眼科研究与视力学(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.) 41(5):961-964(2000)。
玻璃体内注射表示用于向眼睛的后段投予治疗药物含量的最常见方法。虽然玻璃 体内注射提供控制眼睛的后段中的初始药物含量，同时将与药物相关的任何全身性毒 性降到最低的机会，但玻璃体内注射存在一些显著缺陷。玻璃体内注射具有一些固有 的潜在副作用，包括视网膜剥离、出血、眼内炎和白内障发展的风险。通常需要重复 注射，且患者并不总是充分耐受这些注射。此外，直接注射到玻璃体中的药物快速地 消除，使其难以在后段中维持药物的治疗有效含量。
对于投予到身体中快速消除药物的区域(例如，眼睛的后段)、用于治疗慢性疾 病或病症和/或具有窄治疗有效浓度范围(即，治疗窗)的药物，常规药物递送方法 是不适当的。常规药物投予涉及呈剂量调配物形式的治疗剂的定期给药，所述调配物 确保药物稳定性、活性和生物可用性。治疗剂的投予通常导致药物浓度的急剧初始增 加(通常到毒性含量)，随后随着药物清除和/或代谢，浓度呈稳态下降。为了维持治 疗剂在后段中的有效浓度以用于治疗慢性眼睛疾病，通常需要剂量调配物的重复投 予。定期药物递送会产生随时间振荡，通常尖峰形成到毒性含量和/或下降到治疗窗 以下的药物浓度曲线。
控制释放调配物提供了在这些情况下改进患者后果的潜力。控制释放调配物提供 使药物浓度的尖峰降到最低/消除、使副作用和/或毒性降到最低的能力。控制释放调 配物还可使药物浓度在治疗窗内维持较长时间段。因此，由于眼部注射的频率降低， 这些调配物对于患者来说是更舒适且方便的。
为此，已经研究玻璃体内持续释放装置。这些装置中最有名的是VITRASERTTM更昔洛韦(ganciclovir)植入物，其用于治疗巨细胞病毒视网膜炎。然而，例如 VITRASERTTM的植入物需要复杂且不合需要的眼内手术，且必须定期更换。
含有封装于生物可降解的聚合物粒子中的药物的持续释放调配物是一种吸引人 的替代物。纳米粒子和微粒调配物可以悬浮液形式注射，避免了眼内植入手术的需要。 当聚合物粒子降解时和/或当药物从聚合物粒子扩散出来时，药物得到释放。
一些缺陷已经阻碍了控制释放聚合纳米粒子和微粒调配物的成功开发。首先，通 常难以在粒子形成期间实现高和/或控制药物负载，尤其对于亲水性分子，例如阿霉 素(doxorubicin)。格洛芬德(Grovender T.)等人控制释放杂志(J.Controlled Release) 57(2):171-185(1999)。其次，当形成聚合粒子，尤其聚合纳米粒子时，难以实现高药 物封装效率。大多数聚合粒子在粒子表面上或附近具有不良封装的药物分子。因此， 许多粒子呈现不合需要的两阶段药物释放模式。在注射后，在纳米粒子表面上或附近 的不良封装的药物分子可快速地扩散到溶液中，产生初始药物突释。在许多聚合纳米 粒子的情况下，高达40-80％的封装药物分子在投予后最初的几小时或数十小时期间 突释。在最初的24到48小时后，药物释放变得显著较低，因为更深地埋入聚合物粒 子中的药物分子的扩散阻挡较强。所述粒子在投予后可仍产生药物浓度的急剧初始增 加，通常到毒性含量。
因此，本发明的目标是提供具有改进的关于活性剂的控制递送的特性的聚合物- 药物结合物。
本发明的目标还为提供能够有效地向眼睛递送治疗含量的一或多种活性剂持续 一段延长时间的药物调配物。
本发明的另一目标是提供治疗或预防眼睛疾病或病症的改进方法。
发明内容
提供能够形成具有改进的关于控制药物递送(尤其到眼睛)的特性的纳米粒子、 微粒和植入物的非线性多嵌段共聚物-药物结合物。所述聚合物-药物结合物含有通过 多价分支点共价连接的一或多个疏水性聚合物区段和一或多个亲水性聚合物区段以 形成含有至少三个聚合物区段的非线性多嵌段共聚物。所述聚合物-药物结合物进一 步含有共价连接于所述一或多个疏水性聚合物区段的一或多种治疗、预防或诊断剂。 通过采用聚合物-药物结合物，可形成具有更强控制的药物负载和药物释放曲线的粒 子。此外，所述结合物的溶解性可受到控制以便使可溶性药物浓度且因此使毒性降到 最低。
所述聚合物药物结合物可由下文所示的通式表示
其中
A在每次出现时独立地表示活性剂，条件是A不为HIF-1抑制剂；
X在每次出现时独立地表示疏水性聚合物区段；
Y表示多价分支点；
Z在每次出现时独立地表示亲水性聚合物区段，m为1与20之间的整数且n为0 与20之间的整数。
在一些实施例中，m为1或更大且n为0。在其它实施例中，m和n为1或更大， 以致于m+n为2或更大，例如4、5或更大。
优选地，A为适用于治疗或预防眼部疾病或病症的治疗或预防剂，例如抗青光眼 剂、抗血管生成剂、抗感染剂、消炎剂、生长因子、免疫抑制剂或抗过敏剂。
所述一或多个亲水性聚合物区段可为任何亲水性、生物相容性、非毒性聚合物或 共聚物。在优选实施例中，所述一或多个亲水性聚合物区段含有聚(亚烷基二醇)，例 如聚乙二醇(PEG)。在优选实施例中，所述聚合物-药物结合物含有超过一个亲水性 聚合物区段。
所述一或多个疏水性聚合物区段可为任何生物相容性、疏水性聚合物或共聚物。 在优选实施例中，所述疏水性聚合物或共聚物是生物可降解的。在优选实施例中，所 述疏水性聚合物是聚酐，例如聚癸二酐，或其共聚物。
可选择所述一或多个疏水性聚合物区段的降解曲线以影响活性剂活体内的释放 速率。例如，可选择所述疏水性聚合物区段以在从数天到24周，更优选地从7天到 8周，优选地从7天到3周的一段时间内降解。在其它情况下，可选择所述疏水性聚 合物区段以在从7天到2年，更优选地从数天到56周，更优选地从4周到56周，最 优选地从8周到28周的一段时间内降解。
所述分支点可为例如含有三个或三个以上官能团的有机分子。优选地，所述分支 点将含有至少两种不同类型的官能团(例如，一或多种醇和一或多种羧酸，或一或多 种卤化物和一或多种羧酸或一或多种胺)。在所述情况下，存在于所述分支点上的不 同官能团可独立地参与合成，从而允许所述疏水性和亲水性区段以控制的化学计量比 率共价连接于所述分支点。在某些实施例中，所述分支点为聚羧酸，例如柠檬酸、酒 石酸、粘酸、葡糖酸或5-羟基苯-1,2,3,-三甲酸。
在一些实施例中，所述分支点将单个疏水性聚合物区段连接于三个亲水性聚乙二 醇聚合物区段。在某些情况下，所述聚合物-药物结合物可由式I表示
其中
A为活性剂，条件是A不为HIF-1抑制剂；
L在每次出现时独立地不存在或为醚(例如-O-)、硫醚(例如-S-)、仲胺(例如 -NH-)、叔胺(例如-NR-)、仲酰胺(例如-NHCO-；-CONH-)、叔酰胺(例如-NRCO-； -CONR-)、仲氨基甲酸酯(例如-OCONH-；-NHCOO-)、叔氨基甲酸酯(例如-OCONR-； -NRCOO-)、脲(例如-NHCONH-；-NRCONH-；-NHCONR-_；-NRCONR-)、亚硫酰 基(例如-SO-)或磺酰基(例如-SOO-)；
R在每次出现时单独地为烷基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、烯基、炔基、芳 基或杂芳基，任选地经1个与5个之间的单独选自烷基、环丙基、环丁基醚、胺、卤 素、羟基、醚、腈、CF3、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、硫醚、羧酸和芳基的取代基 取代；
PEG表示聚乙二醇链；且
X表示疏水性聚合物区段。
在某些实施例中，所述分支点是柠檬酸分子，且所述亲水性聚合物区段是聚乙二 醇。在所述情况下，所述聚合物-药物结合物可由式IA表示
其中
A为活性剂，条件是A不为HIF-1抑制剂；
D在每次出现时独立地表示O或NH；
PEG表示聚乙二醇链；且
X表示疏水性聚合物区段。
所述非线性多嵌段共聚物-药物结合物形成具有改进的关于控制药物递送到眼睛 的特性的纳米粒子、微粒和植入物。还提供含有由一或多种聚合物-药物结合物与一 或多种医药学上可接受的赋形剂组合形成的纳米粒子和/或微粒的医药组合物，例如， 产生适用于注射或表面施用到眼睛的溶液或悬浮液。
还提供投予这些医药组合物和或含有一或多种非线性多嵌段共聚物-药物结 合物的植入物的方法，以治疗或预防眼睛疾病或病症，例如眼内新生血管疾病(例 如湿性年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管(CNV)和视网膜新生血管 (RNV))或与发炎相关的眼睛疾病(例如葡萄膜炎)。这些调配物和植入物可有 效地向眼睛递送治疗含量的一或多种活性剂持续一段延长时间，在一些情况下当 与投予单独活性剂相比时，具有减少的副作用。
附图说明
图1A-B是绘制在通过激光光凝术破坏C57BL/6小鼠的布鲁赫膜而不投予蒽环霉 素(anthracycline)之后14天，和在投予不同量的阿霉素或柔红霉素(daunorubicin) 后在小鼠的眼睛中观察到的CNV面积(mm2)的条线图。在蒽环霉素投予后所测量 的CNV值的情况下，在蒽环霉素后观察到的CNV面积紧邻于在未治疗的对侧眼(FE) 中所观察到的CNV面积绘制。所述条线表示脉络膜NV的平均(±SEM)面积。图 1A绘制在通过激光光凝术破坏C57BL/6小鼠的布鲁赫膜而不投予蒽环霉素(所述小 鼠的两只眼(BE)中仅注射的媒剂，左侧条线)之后14天，和在投予10、1.0和0.1 μg的柔红霉素(DNR)后在小鼠的眼睛中观察到的CNV面积(mm2)。注射10μg DNR 的眼睛展示与仅注射媒剂的对侧眼相比，CNV面积具有统计学显著减少(P<0.001， n＝10)。注射1.0μg和0.1μg DNR的眼睛未展示与仅注射媒剂的对侧眼相比，CNV 面积具有统计学显著减少(对于1.0μg，P<0.082，n＝10；对于0.1μg，P<0.399，n＝ 10)。图1B绘制在通过激光光凝术破坏C57BL/6小鼠的布鲁赫膜而不投予蒽环霉素 (所述小鼠的两只眼(BE)中仅注射的媒剂，左侧条线)之后14天，和在投予10、 1.0和0.1μg的阿霉素(DXR)后在小鼠的眼睛中观察到的CNV面积(mm2)。注射 10μg DXR的眼睛展示与仅注射媒剂的对侧眼相比，CNV面积具有统计学显著减少 (P<0.001，n＝10)。注射1.0μg和0.1μg DXR的眼睛未展示与仅注射媒剂的对侧眼 相比，CNV面积具有统计学显著减少(对于1.0μg，P<0.071，n＝10；对于0.1μg， P<0.322，n＝10)。在图2A和2B中，对侧眼(FE)和其中两只眼均仅注射媒剂的小 鼠的眼睛(BE)中的平均CNV面积类似，表明蒽环霉素的眼内注射无全身性效应。
图2A-B是绘制在投予媒剂对照物(不存在蒽环霉素的PBS缓冲液)之后5天， 和在投予不同量的阿霉素或柔红霉素后在具有氧诱发的缺血性视网膜病变的 C57BL/6小鼠的眼睛中观察到的RNV面积(mm2)的条线图。所述条线表示RNV的 平均(±SEM)面积。图2A绘制在投予媒剂对照物(不存在蒽环霉素的PBS缓冲液， 左侧条线)之后5天，和在投予1.0、0.1和0.01μg的柔红霉素(DNR)后在具有氧 诱发的缺血性视网膜病变的C57BL/6小鼠的眼睛中观察到的RNV面积(mm2)。注 射1.0μg和0.1μg DNR的眼睛展示RNV面积的统计学显著减少(对于1.0μg， P<0.001，n＝6；对于0.1μg，P＝0.013，n＝8)。注射0.01μg DNR的眼睛未展示RNV 面积的统计学显著减少(P＝0.930，n＝6)。图2B绘制在投予媒剂对照物(不存在蒽 环霉素的PBS缓冲液，左侧条线)之后5天，和在投予1.0、0.1和0.01μg的阿霉素 (DXR)后在具有氧诱发的缺血性视网膜病变的C57BL/6小鼠的眼睛中观察到的RNV 面积(mm2)。注射1.0μg DXR的眼睛展示RNV面积的统计学显著减少(P<0.001， n＝8)。注射0.1μg和0.01μg DXR的眼睛未展示RNV面积的统计学显著减少(对于 1.0μg，P＝0.199，n＝7；对于0.1μg，P＝0.096，n＝8)。
图3A为说明非线性多嵌段共聚物-药物结合物(具体说来，DXR-PSA-PEG3纳米 粒子)治疗小鼠CNV模型中的CNV的功效的图。图3A为绘制在通过激光光凝术破 坏C57BL/6小鼠的布鲁赫膜而不投予蒽环霉素(所述小鼠的两只眼(BE)中仅注射 的媒剂，左侧条线)之后14天，和在投予10、1.0和0.1μg DXR-PSA-PEG3纳米粒 子后在小鼠的眼睛中观察到的CNV面积(mm2)的条线图。在不同量的 DXR-PSA-PEG3纳米粒子投予后所测量的CNV值的情况下，在纳米粒子投予后观察 到的CNV面积紧邻于在未治疗的对侧眼(FE)中所观察到的CNV面积绘制。所述 条线表示CNV的平均(±SEM)面积。注射10μg、1.0μg和0.1μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子的眼睛均展示与仅注射媒剂的对侧眼相比，CNV面积具有统计学显著减少 (对于10μg，P<0.001，n＝10；对于1.0μg，P＝0.009，n＝10；对于0.1μg，P＝0.007， n＝10)。一个群组具有所测量的基线CNV面积，且剩余小鼠通过在一只眼中注射1μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子且在对侧眼中仅注射媒剂来治疗。额外7天之后，在 DXR-PSA-PEG3和媒剂治疗的眼睛中测量CNV面积。图3B为绘制在投予1μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子(左侧条线)之后7天和在激光光凝术破坏布鲁赫膜之后 14天所观察到的CNV面积(mm2)的条线图。将在投予1μg DXR-PSA-PEG3纳米粒 子之后7天和在激光光凝术破坏布鲁赫膜之后14天所观察到的CNV面积(mm2)与 在激光光凝术破坏布鲁赫膜之后14天和在媒剂注射之后7天在仅注射媒剂的对侧眼 中(中心条线)以及在激光光凝术破坏布鲁赫膜之后7天在未治疗的眼中(基线；右 侧条线)所测量的CNV面积相比较。观察到CNV面积的统计学显著减少(P<0.001， n＝10)，两者是相对于仅注射媒剂的对侧眼(中心条线)以及在未治疗的眼中(右侧 条线)在激光光凝术破坏布鲁赫膜之后7天所观察到的基线CNV，表明 DXR-PSA-PEG3治疗不仅显著减少CNV(比较左侧和中间条线)，而且介导现有CNV 的衰退(比较左侧和右侧条线)。
图4为说明非线性多嵌段共聚物-药物结合物(具体说来，DXR-PSA-PEG3纳米 粒子)治疗具有氧诱发的缺血性视网膜病变的小鼠中的RNV的功效的图。图4为绘 制在投予媒剂对照物(不存在蒽环霉素的PBS缓冲液，右侧条线)之后5天，和在 投予1μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子(左侧条线)后在具有氧诱发的缺血性视网膜病 变的C57BL/6小鼠的眼睛中观察到的RNV面积(mm2)的条线图。所述条线表示 RNV的平均(±SEM)面积。相对于仅注射媒剂的对侧眼，观察到RNV面积的统计 学显著减少(P<0.001，n＝8)。
图5A-B为说明非线性多嵌段共聚物-药物结合物(具体说来，DXR-PSA-PEG3纳米粒子)抑制转基因小鼠中的视网膜下新生血管(NV)的能力的条线图，在所述 转基因小鼠中视紫红质启动子驱动光感受器中VEGF的表达(rho/VEGF小鼠)持续 至少35天。在出生后第14天(P)，在半合子rho/VEGF小鼠的一只眼中给予10μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子的眼内注射且在对侧眼中仅给予媒剂(PBS缓冲液)。图5A 为绘制在眼内注射10μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子(左侧条线)之后4周所观察到的 每个视网膜的NV面积(mm2)的条线图。相对于仅注射媒剂的对侧眼，观察到每个 视网膜的NV面积的统计学显著减少(P＝0.042，n＝5)。图5B为绘制在眼内注射10 μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子(左侧条线)之后5周所观察到的每个视网膜的NV面 积(mm2)的条线图。相对于仅注射媒剂的对侧眼，观察到每个视网膜的NV面积的 统计学显著减少(P＝0.007，n＝5)。
图6A为展示如使用库尔特粒度分析计数仪(Coulter Multisizer)所测定的以微粒 体积计的尺寸分布的图。图6B为展示如使用库尔特粒度分析计数仪所测定的以纳米 粒子体积计的尺寸分布的图。
图7A为展示随微粒和纳米粒子注射到兔眼中的时间(天数)而变，释放到房水 (AH)中的药物结合物的量(nM)的图。图7B为比较注射粒子的兔眼的房水(AH) 和玻璃体中释放的DXR药物结合物的量(nM)的条线图。所述时间(天数)对于纳 米粒子治疗的动物为105且对于微粒治疗的动物为115。
图8为展示对含有10％DXR(●)、30％DXR(■)和50％DXR(▲)的聚合物 杆来说，随时间(天数)而变的活体外阿霉素(DXR)结合物的释放的图。
图9A为展示由DXR-SA-PEG3(■)和DXR-SA-CPH-PEG(▲)制备的微粒 的活体外阿霉素(DXR)结合物释放曲线的图。图9B为展示由DXR-SA-CPH-PEG3 (▲)制备的微粒的活体外阿霉素(DXR)结合物释放曲线的图。
具体实施方式
I.定义
如本文所用，“活性剂”是指局部地和/或全身性地在体内起作用的生理学或药理 学活性物质。活性剂是投予到患者以治疗(例如治疗剂)、预防(例如预防剂)或诊 断(例如诊断剂)疾病或病症的物质。如本文所用，“眼科药物”或“眼科活性剂” 是指投予到患者以缓解、延迟发作或预防眼睛疾病或病症的一或多种症状的治疗或预 防剂，或适用于成像或以其它方式评估眼睛的诊断剂。
如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”是指聚合物‐药物结合物有效缓解、延 迟发作或预防由所述活性剂治疗的疾病或病症的一或多种症状的量，和/或聚合物‐药 物结合物有效产生所要诊断信号的量。在年龄相关黄斑变性的情况下，有效量的聚合 物‐药物结合物会延迟、减少或预防患者的视力丧失。
如本文所用，“生物相容性”和“生物可相容”一般是指材料连同其任何代谢物 或降解产物一起一般对接受者无毒且不对接受者造成任何显著的不利影响。一般来 说，生物相容性材料是当投予患者时不会引起显著发炎或免疫反应的材料。
如本文所用，“生物可降解聚合物”一般是指在生理条件下将通过酶作用或水解 而降解或腐蚀成能够由个体代谢、消除或排泄的较小单元或化学物质的聚合物。降解 时间随聚合物组成、形态，例如孔隙率、粒子尺寸和环境而变。
如本文所用，“亲水性”是指对水具有亲和力的特性。例如，亲水性聚合物(或 亲水性聚合物区段)是主要可溶于水溶液中和/或具有吸水的倾向的聚合物(或聚合 物区段)。一般来说，聚合物亲水性越强，聚合物越倾向于溶解于水中、与水混合或 由水润湿。
如本文所用，“疏水性”是指对水缺乏亲和力或甚至排斥水的特性。举例来说， 聚合物(或聚合物区段)疏水性越强，聚合物(或聚合物区段)越倾向于不溶解于水 中、不与水混合或不由水润湿。
亲水性和疏水性可以相对术语形式被提及，例如(但不限于)在一组聚合物或聚 合物区段内的一系列亲水性/疏水性。在其中论述两种或两种以上聚合物的一些实施 例中，术语“疏水性聚合物”可基于所述聚合物与另一更具亲水性的聚合物相比时的 相对疏水性来定义。
如本文所用，“纳米粒子”一般是指直径(例如平均直径)为约10nm直到(但 不包括)约1微米，优选地100nm到约1微米的粒子。所述粒子可具有任何形状。 具有球形的纳米粒子一般称为“纳米球”。
如本文所用，“微粒”一般是指直径(例如平均直径)为约1微米到约100微米， 优选地约1到约50微米，更优选地约1到约30微米，最优选地约1微米到约10微 米的粒子。所述微粒可具有任何形状。具有球形的微粒一般称为“微球”。
除非另外规定，否则如本文所用，“分子量”一般是指本体聚合物的相对平均链 长。实际上，分子量可使用各种方法，包括凝胶渗透色谱法(GPC)或毛细管测粘法 来估算或表征。GPC分子量是报告为重量平均分子量(Mw)，如与数目平均分子量 (Mn)相对比。毛细管测粘法以使用一组特定浓度、温度和溶剂条件由稀聚合物溶液 测定的固有粘度提供分子量的估算值。
如本文所用，“平均粒径”一般是指粒子群体中粒子的统计学平均粒径(直径)。 基本上球形粒子的直径可称为物理或水力直径。非球形粒子的直径可优先称为水力直 径。如本文所用，非球形粒子的直径可称为粒子表面上的两个点之间的最大直线距离。 平均粒径可使用所属领域中已知的方法，例如动态光散射来测量。
“单分散”和“均匀尺寸分布”在本文中可互换使用且描述其中所有粒子具有相 同或几乎相同尺寸的纳米粒子或微粒群体。如本文所用，单分散分布是指其中所述分 布的90％或90％以上位于中值粒径的15％内，更优选地位于中值粒径的10％内，最 优选地位于中值粒径的5％内的粒子分布。
如本文所用，“医药学上可接受的”是指在合理医学判断的范畴内适合与人类和 动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的 效益风险比相称的化合物、载剂、赋形剂、组合物和/或剂型。
如本文所用，“分支点”是指聚合物‐药物结合物中用于将一或多个亲水性聚合物 区段连接于一或多个疏水性聚合物区段的一部分。
如本文一般所用，“植入物”是指经结构化、定尺寸或以其它方式配置以优选地 通过注射或手术植入而植入体内特定区域中以便通过在植入位点处经一段延长时间 释放一或多种HIF-1抑制剂来提供治疗益处的聚合装置或元件。例如，眼内植入物为 经结构化、定尺寸或以其它方式配置以优选地通过注射或手术植入而放置于眼睛中且 通过经一段延长时间释放一或多种HIF‐1抑制剂来治疗一或多种眼睛疾病或病症的聚 合装置或元件。眼内植入物一般与眼睛的生理条件具有生物相容性且不会引起不利的 副作用。一般来说，眼内植入物可放置于眼睛中而不破坏眼睛的视力。
本文所定义的值的范围包括所述范围内的所有值以及所述范围内的所有子范围。 例如，如果所述范围是定义为0到10的整数，那么所述范围涵盖所述范围内的所有 整数以及所述范围内的任何和所有子范围，例如1-10、1-6、2-8、3-7、3-9等。
II.非线性多嵌段共聚物-药物结合物
非线性多嵌段共聚物-药物结合物可用于形成适用于递送到眼睛的纳米粒子、微 粒和植入物(例如，杆、盘、圆片等)。所述聚合物-药物结合物含有通过多价分支点 共价连接的一或多个疏水性聚合物区段和一或多个亲水性聚合物区段以形成含有至 少三个聚合物区段的非线性多嵌段共聚物。所述聚合物-药物结合物进一步含有共价 连接于所述一或多个疏水性聚合物区段的一或多种治疗、预防或诊断剂。通过采用聚 合物-药物结合物，可形成具有更强控制的药物负载和药物释放曲线的粒子。此外， 所述结合物的溶解性可受到控制以便使可溶性药物浓度且因此使毒性降到最低。
A.非线性多嵌段共聚物-药物结合物的结构
提供含有共价连接于一或多个疏水性聚合物区段的活性剂的非线性多嵌段共聚 物-药物结合物，所述一或多个疏水性聚合物区段共价连接于一或多个亲水性聚合物 区段。
所述聚合物药物结合物可由下文所示的通式表示
其中
A在每次出现时独立地表示活性剂，条件是A不为HIF-1抑制剂；
X在每次出现时独立地表示疏水性聚合物区段；
Y表示多价分支点；
Z在每次出现时独立地表示亲水性聚合物区段，m为1与20之间的整数且n为0 与20之间的整数。
在一些实施例中，m为1或更大且n为0。在其它实施例中，m和n为1或更大， 以致于m+n为2或更大，例如4、5或更大。
在一些实施例中，所述结合物是以上结合物的混合物，其中对于一些结合物，n 是非0的整数值，且对于其它结合物，n＝0。
A可在每次出现时独立地为适用于治疗、诊断或预防眼睛疾病或病症的活性剂 (本文中统称为“药物”)，条件是A不为HIF-1抑制剂。
所述一或多个疏水性聚合物区段可独立地为任何生物相容性、疏水性聚合物或共 聚物。在一些情况下，所述一或多个疏水性聚合物区段也是生物可降解的。合适的疏 水性聚合物的实例包括聚酯(例如聚乳酸、聚乙醇酸或聚己内酯)、聚酐(例如聚癸 二酐)和其共聚物。在某些实施例中，所述疏水性聚合物是聚酐，例如聚癸二酐，或 其共聚物。
所述一或多个亲水性聚合物区段可为任何亲水性、生物相容性、非毒性聚合物或 共聚物。所述亲水性聚合物区段可为例如聚(亚烷基二醇)、多糖、聚(乙烯醇)、聚吡 咯烷酮、聚氧乙烯嵌段共聚物(普兰尼克(PLURONIC))或其共聚物。在优选实 施例中，所述一或多个亲水性聚合物区段是聚乙二醇(PEG)或由聚乙二醇(PEG) 构成。
在一些情况下，所述聚合物-药物结合物仅含有一个亲水性聚合物区段。在优选 实施例中，所述聚合物-药物结合物含有超过一个亲水性聚合物链。在某些实施例中， 所述聚合物-药物结合物含有在2个与6个之间，更优选地在3个与5个之间的亲水 性聚合物链。在一个实施例中，所述聚合物药物结合物含有三个亲水性聚合物区段。
优选地，所述一或多个亲水性聚合物区段的组合分子量将大于所述一或多个疏水 性聚合物区段的分子量。在一些情况下，所述一或多个亲水性聚合物区段的组合分子 量是所述一或多个疏水性聚合物区段的分子量的至少3倍，更优选地至少5倍，最优 选地至少10倍。
所述分支点可为例如含有三个或三个以上官能团的有机分子。优选地，所述分支 点将含有至少两种不同类型的官能团(例如，一或多种醇和一或多种羧酸，或一或多 种卤化物和一或多种羧酸)。在所述情况下，存在于所述分支点上的不同官能团可独 立地参与合成，从而允许所述疏水性和亲水性区段以控制的化学计量比率共价连接于 所述分支点。在某些实施例中，所述分支点为聚羧酸，例如柠檬酸、酒石酸、粘酸、 葡糖酸或5-羟基苯-1,2,3,-三甲酸。
在某些实施例中，所述聚合物-药物结合物由经由多价分支点共价连接的单一疏 水性聚合物区段和两个或两个以上亲水性聚合物区段形成。这种类型的示范性聚合物 -药物结合物是由下文所示的通式表示
其中
A表示活性剂，条件是A不为HIF-1抑制剂；
X表示疏水性聚合物区段；
Y表示分支点；
X在每次出现时独立地表示亲水性聚合物区段；且
n为1或2与300之间，更优选地1或2与50之间，更优选地1或2与30之间， 最优选地1或2与10之间的整数。
在某些实施例中，所述聚合物-药物结合物含有在2个与6个之间，更优选地在3 个与5个之间的亲水性聚合物链。在一个实施例中，所述聚合物药物结合物含有三个 亲水性聚合物区段。
所述分支点可为例如含有多个官能团的有机分子。优选地，所述分支点将含有至 少两种不同类型的官能团(例如，一种醇和多种羧酸，或一种羧酸和多种醇)。在某 些实施例中，所述分支点是聚羧酸，例如柠檬酸分子。
在一些实施例中，所述分支点将单个疏水性聚合物区段连接于三个亲水性聚乙二 醇聚合物区段。在某些情况下，所述聚合物-药物结合物可由式I表示
其中
A为活性剂，条件是A不为HIF-1抑制剂；
L在每次出现时独立地不存在或为醚(例如-O-)、硫醚(例如-S-)、仲胺(例如 -NH-)、叔胺(例如-NR-)、仲酰胺(例如-NHCO-；-CONH-)、叔酰胺(例如-NRCO-； -CONR-)、仲氨基甲酸酯(例如-OCONH-；-NHCOO-)、叔氨基甲酸酯(例如-OCONR-； -NRCOO-)、脲(例如-NHCONH-；-NRCONH-；-NHCONR-_；-NRCONR-)、亚硫酰 基(例如-SO-)或磺酰基(例如-SOO-)；
R在每次出现时单独地为烷基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、烯基、炔基、芳 基或杂芳基，任选地经1个与5个之间的单独选自烷基、环丙基、环丁基醚、胺、卤 素、羟基、醚、腈、CF3、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、硫醚、羧酸和芳基的取代基 取代；
PEG表示聚乙二醇链；且
X表示疏水性聚合物区段。
在某些实施例中，所述分支点是柠檬酸分子，且所述亲水性聚合物区段是聚乙二 醇。在所述情况下，所述聚合物-药物结合物可由式IA表示
其中
A为活性剂，条件是A不为HIF-1抑制剂；
D在每次出现时独立地表示O或NH；
PEG表示聚乙二醇链；且
X表示疏水性聚合物区段。
在一些实施例中，所述聚合物药物结合物由下式定义
A-X
其中
A为活性剂，条件是A不为HIF-1抑制剂；且
X为疏水性聚合物区段，优选地为聚酐。
B.活性剂
非线性多嵌段共聚物-药物结合物含有治疗、诊断和/或预防剂。所述活性剂可为 小分子活性剂和/或生物分子，例如酶、蛋白质、生长因子、多肽、多糖、脂质或核 酸。合适的小分子活性剂包括有机和有机金属化合物。在一些情况下，所述小分子活 性剂具有小于约2000g/mol，优选地小于约1500g/mol，更优选地小于约1200g/mol， 最优选地小于约1000g/mol的分子量。在其它实施例中，所述小分子活性剂具有小于 约500g/mol的分子量。所述小分子活性剂可为亲水性、疏水性或两性分子化合物。 生物分子通常具有大于约2000g/mol的分子量且可由例如氨基酸(肽、蛋白质、酶等) 或含氮碱基单元(核酸)的重复单元构成。
在优选实施例中，所述活性剂是眼科药物。在特定实施例中，所述活性剂是用于 治疗、预防或诊断后段眼的疾病或病症的药物。眼科药物的非限制性实例包括抗青光 眼剂、抗血管生成剂、抗感染剂、消炎剂、生长因子、免疫抑制剂、抗过敏剂和其组 合。
代表性抗青光眼剂包括前列腺素类似物(例如曲伏前列腺素、比马前列腺素和拉 坦前列腺素)、β-肾上腺素能受体拮抗剂(例如噻吗洛尔、倍他洛尔、左倍他洛尔和 卡替洛尔)、α-2肾上腺素能受体拮抗剂(例如溴莫尼定和安普尼定)、碳酸酐酶抑制 剂(例如布林唑胺、乙酰唑胺和多佐胺)、缩瞳剂(即拟副交感神经药，例如匹鲁卡 品和碘依可酯)、血清素能药物、毒蕈碱能药物、多巴胺能激动剂和肾上腺素能激动 剂(例如安普尼定和溴莫尼定)。
代表性抗血管生成剂包括(但不限于)血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，例 如贝伐单抗(阿瓦斯汀(AVASTIN))和rhuFAb V2(雷珠单抗，) 和其它抗VEGF化合物；(哌加他尼钠，抗VEGF适体或EYE001)(眼 科技术制药公司(Eyetech Pharmaceuticals))；色素上皮衍生因子(PEDF)；COX-2 抑制剂，例如塞来昔布(西乐葆(CELEBREX))和罗非昔布(万络(VIOXX))； 干扰素α；白细胞介素-12(IL-12)；沙利度胺()和其衍生物，例如来 那度胺()；角鲨胺；内皮抑素；血管抑素；核糖酶抑制剂，例如 (Sirna治疗学公司(Sirna Therapeutics))；多官能抗血管生成剂，例 如(AE-941)(亚特那实验室(Aeterna Laboratories),魁北克市(Quebec City),加拿大(Canada))；受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，例如舒尼替尼(舒癌 特(SUTENT))；酪氨酸激酶抑制剂，例如索拉非尼(蕾莎瓦(Nexavar))和 厄洛替尼(特罗凯(Tarceva))；表皮生长因子受体的抗体，例如帕尼单抗(维克 替比(VECTIBIX))和西妥昔单抗(爱必妥(ERBITUX))，以及所属领域中已 知的其它抗血管生成剂。
抗感染剂包括抗病毒剂，抗细菌剂、抗寄生虫剂和抗真菌剂。代表性抗病毒剂包 括更昔洛韦和阿昔洛韦。代表性抗菌剂包括氨基糖苷，例如链霉素、阿米卡星、庆大 霉素和妥布霉素；袢霉素，例如格尔德霉素和除莠霉素；碳头孢烯；碳青霉烯；头孢 菌素；糖肽，例如万古霉素、替考拉宁和替拉万星；林可酰胺；脂肽，例如达托霉素； 大环内酯，例如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素和红霉素；单胺菌素；硝基呋喃；青 霉素；多肽，例如杆菌肽、粘菌素和多粘菌素B；喹诺酮；磺酰胺；和四环素。
在一些情况下，所述活性剂是抗过敏剂，例如奥洛他定和依匹斯汀。
消炎剂包括非类固醇和类固醇消炎剂。合适的类固醇活性剂包括糖皮质激素、孕 激素、盐皮质激素和皮质类固醇。
所述眼科药物可以其中性形式，或以医药学上可接受的盐形式存在。在一些情况 下，由于活性剂的盐的有利物理特性中的一或多者，例如增强的稳定性或需要的溶解 性或溶解曲线，可需要制备含有所述盐的调配物。
一般说来，医药学上可接受的盐可通过活性剂的游离酸或碱形式与化学计量的适 当碱或酸在水中或在有机溶剂中，或在二者的混合物中反应而制备；一般说来，非水 性介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈为优选的。医药学上可接受的盐包 括由无机酸、有机酸、贱金属盐和碱土金属盐衍生的活性剂的盐，以及通过所述药物 与合适的有机配体(例如，季铵盐)反应所形成的盐。合适的盐的清单发现于例如雷 明登氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences),第20版,利平科特威廉姆 斯·威尔金斯(Lippincott Williams & Wilkins),巴尔的摩(Baltimore),马里兰州(MD), 2000,第704页中。有时以医药学上可接受的盐形式投予的眼科药物的实例包括顺丁 烯二酸噻吗洛尔、酒石酸溴莫尼定和双氯芬酸钠。
在一些情况下，所述活性剂是成像或以其它方式评估眼睛的诊断剂。示范性诊断 剂包括顺磁性分子、荧光化合物、磁性分子和放射性核素、x射线成像剂和造影剂。
C.疏水性聚合物区段
本文所述的非线性多嵌段共聚物-药物结合物可含有一或多个疏水性聚合物区 段。所述一或多个疏水性聚合物区段可为均聚物或共聚物。优选地，所述一或多个疏 水性聚合物区段是生物可降解的。
合适的疏水性聚合物的实例包括聚羟基酸，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸 乙醇酸共聚物)；聚羟基烷酸酯，例如聚-3-羟基丁酸酯或聚-4-羟基丁酸酯；聚己内酯； 聚(原酸酯)；聚酐；聚(膦腈)；聚(羟基烷酸酯)；聚(丙交己内酯)；聚碳酸酯，例如酪 氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包括合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酯酰胺； 聚酯；聚(对二氧环己酮)；聚(亚烷基烷基化物)；疏水性聚醚；聚氨酯；聚醚酯；聚 缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚硅氧烷；聚(氧乙烯)/ 聚(氧丙烯)共聚物；聚缩酮；聚磷酸酯；聚羟基戊酸酯；聚亚烷基草酸酯；聚亚烷基 丁二酸酯；聚(顺丁烯二酸)，以及其共聚物。
在优选实施例中，所述一或多个疏水性聚合物区段是聚酐或其共聚物。所述聚 酐可为脂肪族聚酐、不饱和聚酐或芳香族聚酐。代表性聚酐包括聚己二酸酐、聚反 丁烯二酸酐、聚癸二酸酐、聚顺丁烯二酸酐、聚苹果酸酐、聚邻苯二甲酸酐、聚间 苯二甲酸酐、聚天冬氨酸酐、聚对苯二甲酸酐、聚间苯二甲酸酐、聚羧基苯氧基丙 烷酐、聚羧基苯氧基己烷酐，以及这些聚酐与其它聚酐在不同摩尔比下的共聚物。 其它合适的聚酐揭示于美国专利第4,757,128号、第4,857,311号、第4,888,176号和 第4,789,724号中。所述一或多个疏水性聚合物区段也可为聚酐共聚物，例如聚(酯- 酐)或聚(酰胺-酐)。参看例如美国专利第5,756,652号和美国专利申请案第US 2010/0260703号。
在某些实施例中，所述疏水性聚合物区段是聚癸二酸酐。在某些实施例中，所述 疏水性聚合物区段是聚(1,6-双(对羧基苯氧基)己烷癸二酸共聚物)(聚(CPH-SA)。在 某些实施例中，所述疏水性聚合物区段是聚(1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷癸二酸共聚物) (聚(CPP-SA)。
在优选实施例中，所述一或多个疏水性聚合物区段是生物可降解的。在其中所述 一或多个疏水性聚合物区段是生物可降解的情况下，可选择聚合物降解曲线以影响活 性剂活体内的释放速率。例如，可选择所述一或多个疏水性聚合物区段以在从7天到 24周，更优选地从7天到8周，优选地从7天到3周的一段时间内降解。在其它情 况下，可选择所述疏水性聚合物区段以在从7天到2年，更优选地从数天到56周， 更优选地从4周到56周，最优选地从8周到28周的一段时间内降解。
所述一或多个疏水性聚合物区段的分子量可变化以制备聚合物-药物结合物，所 述结合物形成针对特定应用具有最佳特性，例如药物释放速率的粒子。所述一或多个 疏水性聚合物区段可具有约150 Da到1 MDa的分子量。在某些实施例中，所述疏水 性聚合物区段具有在约1 kDa与约100 kDa之间，更优选地在约1 kDa与约50 kDa 之间，最优选地在约1 kDa与约25 kDa之间的分子量。
在一些情况下，所述一或多个疏水性聚合物区段具有小于所述聚合物-药物结合 物的所述一或多个亲水性聚合物区段的组合平均分子量的组合平均分子量。在一个优 选实施例中，所述一或多个疏水性聚合物区段各具有小于约5 kDa的平均分子量。
D.亲水性聚合物
本文所述的非线性多嵌段共聚物-药物结合物还含有一或多个亲水性聚合物区 段。优选地，所述聚合物-药物结合物含有超过一个亲水性聚合物区段。在一些实施 例中，所述聚合物-药物结合物含有在2个与6个之间，更优选地在3个与5个之间 的亲水性聚合物区段。在某些实施例中，所述聚合物药物结合物含有三个亲水性聚合 物区段。
各亲水性聚合物区段可独立地含有任何亲水性、生物相容性(即，其不会诱发显 著发炎或免疫反应)、非毒性聚合物或共聚物。合适的聚合物的实例包括(但不限于) 聚(亚烷基二醇)，例如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)和乙二醇与丙二醇的共 聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰 胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多(糖)、聚(氨基酸)、聚(羟酸)、聚(乙烯醇)和共聚 物、三元共聚物以及其混合物。
在优选实施例中，所述一或多个亲水性聚合物区段含有聚(亚烷基二醇)链。所述 聚(亚烷基二醇)链可含有在1个与500个之间的重复单元，更优选地在40个与500 个之间的重复单元。合适的聚(亚烷基二醇)包括聚乙二醇、聚亚丙基1,2-二醇、聚(氧 化丙烯)、聚亚丙基1,3-二醇和其共聚物。
在一些实施例中，所述一或多个亲水性聚合物区段为含有一或多个聚氧化乙烯 (PEO)嵌段连同一或多个由其它生物相容性聚合物(例如聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、 聚(乙丙交酯)或聚己内酯)构成的嵌段的共聚物。所述一或多个亲水性聚合物区段可 为含有一或多个PEO嵌段连同一或多个含有聚氧化丙烯(PPO)的嵌段的共聚物。 特定实例包括PEO-PPO-PEO的三嵌段共聚物，例如泊洛沙姆(POLOXAMERS)TM和 普朗尼克(PLURONICS)TM。
在优选实施例中，所述一或多个亲水性聚合物区段是PEG链。在所述情况下， 所述PEG链可为直链或分支链，例如美国专利第5,932,462号中所述者。在某些实施 例中，所述PEG链是直链。
所述一或多个亲水性聚合物区段各可独立地具有约300Da到1MDa的分子量。 所述亲水性聚合物区段可具有介于上文所列分子量中任一者之间范围内的分子量。 在某些实施例中，所述一或多个亲水性聚合物区段各具有在约1kDa与约20kDa之 间，更优选地在约1kDa与约15kDa之间，最优选地在约1kDa与约10kDa之间 的分子量。在一个优选实施例中，所述一或多个亲水性聚合物区段各具有约5kDa 的分子量。
E.分支点
本文所述的非线性多嵌段共聚物-药物结合物含有连接所述一或多个亲水性聚合 物区段和所述一或多个疏水性聚合物区段的分支点。所述分支点可为任何多价有机、 无机或有机金属部分，以便提供超过两个连接点。在优选实施例中，所述分支点是含 有多个官能团的有机分子。
所述官能团可为任何原子或含有至少一个非碳且非氢原子的原子团，条件是所述 基团必须能够与所述疏水性和亲水性聚合物区段反应。合适的官能团包括卤素(溴、 氯和碘)；含氧官能团，例如羟基、环氧基、羰基、醛、酯、羧基和酰基氯；含氮官 能团，例如胺和跌氮化物；和含硫基团，例如硫醇。所述官能团也可为含有一或多个 非芳香族π键的烃部分，例如炔、烯烃或二烯。优选地，所述分支点将含有至少两种 不同类型的官能团(例如，一或多种醇和一或多种羧酸，或一或多种卤化物和一或多 种醇)。在所述情况下，存在于所述分支点上的不同官能团可独立地参与合成，从而 允许所述疏水性和亲水性区段以控制的化学计量比率共价连接于所述分支点。
在所述疏水性和亲水性聚合物区段与所述分支点上的官能团反应之后，所述一或 多个疏水性聚合物区段和所述一或多个亲水性聚合物区段将经由键联部分共价地接 合于所述分支点。所述键联部分的身份将由所述官能团的身份和所述疏水性和亲水性 聚合物区段的反应性位置决定(因为这些要素反应形成所述键联部分或所述键联部分 的前体)。将聚合物区段连接于所述分支点的合适键联部分的实例包括仲胺 (-CONH-)、叔酰胺(-CONR-)、仲氨基甲酸酯(-OCONH-；-NHCOO-)、叔氨基甲 酸酯(-OCONR-；-NRCOO-)、脲(-NHCONH-；-NRCONH-；-NHCONR-、-NRCONR-)、 甲醇(-CHOH-、-CROH-)、醚(-O-)和酯(-COO-、-CH2O2C-、CHRO2C-)，其中 R为烷基、芳基或杂环基。在某些实施例中，所述聚合物区段经由酯(-COO-、 -CH2O2C-、CHRO2C-)、仲酰胺(-CONH-)或叔酰胺(-CONR-)(其中R为烷基、 芳基或杂环基)连接于所述分支点。
在某些实施例中，所述分支点为聚羧酸，例如柠檬酸、酒石酸、粘酸、葡糖酸或 5-羟基苯-1,2,3,-三甲酸。示范性分支点包括以下有机化合物：
F.合成非线性多嵌段共聚物-药物结合物
非线性多嵌段共聚物-药物结合物可使用所属领域中已知的合成方法来制备。下 文论述用于制备聚合物-药物结合物的代表性方法。用于合成给定的聚合物-药物结合 物的适当途径可鉴于多种因素来确定，例如所述聚合物-药物结合物的结构、构成所 述结合物的聚合物的身份、所述活性剂的身份以及所述化合物整体的结构(因为其涉 及官能团的相容性)、保护基策略和不稳定键的存在。
除了下文论述的合成方法以外，所属领域中还已知适用于制备所述聚合物-药物 结合物的替代反应和策略。参看例如马奇(March),“高等有机化学(Advanced Organic Chemistry),”第5版,2001,威利跨科学出版社(Wiley-Interscience Publication),纽约 (New York))。
一般说来，非线性多嵌段共聚物-药物结合物是通过首先依序使所述一或多个疏 水性聚合物区段和所述一或多个亲水性聚合物区段连接于分支点以形成所述聚合物- 药物结合物的聚合部分来制备。在组装所述聚合物-药物结合物的聚合组分之后，一 或多种活性剂可接着共价地连接于所述一或多个疏水性聚合物区段。
例如，方案1和2说明含有用三个亲水性PEG区段和单一疏水性聚(癸二酸酐) 聚合物区段官能化的柠檬酸分支点的聚合物-药物结合物(DXR-PSA-PEG3)的合成。 阿霉素(DXR)结合于所述疏水性聚合物区段。
如方案1中所示，柠檬酸首先与CH3O-PEG-NH2在N,N'-二环己基碳化二亚胺 (DCC)和催化量的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下反应，在所述PEG链与所述 柠檬酸分支点的三个羧酸残基之间形成酰胺键联。所得化合物接着与酰化聚癸二酸前 体(PreSA)反应，且在无水热熔聚合条件下聚合。如方案2中所示，所得聚合物 (PSA-PEG3)接着与阿霉素反应以形成所述聚合物-药物结合物(DXR-PSA-PEG3)。
方案1：
方案2：
III.由聚合物-药物结合物形成的粒子和植入物
非线性多嵌段共聚物-药物结合物可使用所属领域中已知的多种技术形成微粒、 纳米粒子和植入物。用于粒子或植入物形成的适当方法可鉴于用于形成所述粒子/植 入物的一或多种聚合物-药物结合物的物理和化学特性(即，稳定性和溶解性)以及 所需的粒子/植入物尺寸和形态来选择。
A.粒子形态
微粒和纳米粒子可由一或多种聚合物-药物结合物形成。在一些情况下，粒子是 由单一聚合物-药物结合物形成(即，粒子由含有相同的活性剂、一或多个疏水性聚 合物区段、分支点(存在时)和一或多个亲水性聚合物区段的一种聚合物-药物结合 物形成)。
在其它实施例中，粒子是由两种或两种以上不同的聚合物-药物结合物的混合物 形成。例如，粒子可由含有不同的活性剂和相同的一或多个疏水性聚合物区段、分支 点(存在时)和一或多个亲水性聚合物区段的两种或两种以上聚合物-药物结合物形 成。所述粒子可用于例如共投予两种或两种以上活性剂。在其它情况下，粒子是由含 有相同的活性剂和不同的疏水性聚合物区段、分支点(存在时)和/或亲水性聚合物 区段的两种或两种以上聚合物-药物结合物形成。所述粒子可用于例如随时间改变活 性剂的释放速率。粒子也可由含有不同的活性剂和不同的疏水性聚合物区段、分支点 (存在时)和/或亲水性聚合物区段的两种或两种以上聚合物-药物结合物形成。
离子也可由聚合物-药物结合物与一或多种额外聚合物的掺合物形成。在这些情 况下，所述一或多种额外聚合物可为以下部分C中所述的非生物可降解或生物可降 解聚合物中的任一者，不过生物可降解聚合物为优选的。在这些实施例中，可选择所 述一或多种额外聚合物的身份和质量，例如以影响粒子稳定性，即分布到需要递送的 位点处所需的时间和递送所需的时间。
具有在10nm与1000微米之间的平均粒径的粒子适用于本文所述的组合物。在 优选实施例中，所述粒子具有在10nm与100微米之间，更优选地在约100nm与约 50微米之间，更优选地在约200nm与约50微米之间的平均粒径。在某些实施例中， 所述粒子为具有在500与700nm之间的直径的纳米粒子。所述粒子可具有任何形状， 但一般为球形形状。
在一些实施例中，由一或多种聚合物-药物结合物形成的粒子的群体为单分散粒 子群体。在其它实施例中，由一或多种聚合物-药物结合物形成的粒子的群体为多分 散粒子群体。在其中由一或多种聚合物-药物结合物形成的粒子的群体为多分散粒子 群体的一些情况下，大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的 粒径分布处于中值粒径的10％内。
优选地，由一或多种聚合物-药物结合物形成的粒子的表面上含有大量亲水性聚 合物，例如PEG。
B.形成微粒和纳米粒子的方法
由聚合物-药物结合物形成的微粒和纳米粒子可使用所属领域中已知的用于形成 聚合物微粒或纳米粒子的任何合适方法制备。用于粒子形成的方法将取决于多种因 素，包括存在于所述聚合物-药物结合物中的聚合物的特征和所需的粒径和尺寸分布。 存在于所述粒子-药物结合物中的活性剂的类型也可为一种因素，因为一些活性剂在 某些溶剂存在下，在某些温度范围内和/或在某些pH范围内不稳定。
在其中需要单分散粒子群体的情况下，所述粒子可使用产生单分散纳米粒子群体 的方法形成。或者，可使用产生多分散纳米粒子分布的方法，且所述粒子可在粒子形 成后分离以提供具有所需的平均粒径和粒径分布的粒子的群体。所述分离可使用所属 领域中已知的方法，例如筛分来执行。
用于制备微粒和纳米粒子的常见技术包括(但不限于)溶剂蒸发、热熔粒子形成、 溶剂去除、喷雾干燥、相转化、凝聚和低温铸造。粒子形成的合适方法简要描述于下 文中。医药学上可接受的赋形剂，包括pH调节剂、崩解剂、防腐剂和抗氧化剂，可 任选地在粒子形成期间并入粒子中。
1.溶剂蒸发
在这种方法中，将所述聚合物-药物结合物溶解于挥发性有机溶剂，例如二氯甲 烷中。含有所述聚合物-药物结合物的有机溶液接着悬浮于含有例如聚(乙烯醇)的表面 活性剂的水溶液中。搅拌所得乳液直到大多数有机溶剂蒸发，留下固体纳米粒子。所 得纳米粒子用水洗涤且在冻干器中干燥过夜。具有不同尺寸和形态的纳米粒子可由这 种方法获得。
含有不稳定聚合物(例如某些聚酐)的聚合物-药物结合物可在制造过程期间由 于水的存在而降解。对于这些聚合物，可使用以下两种方法，其在完全无水有机溶剂 中执行。
2.热熔粒子形成
在这种方法中，首先使所述聚合物-药物结合物熔融，且接着悬浮于不可混溶溶 剂(如硅油)中且在连续搅拌下，加热到超过所述聚合物-药物结合物的熔点5℃。一 旦所述乳液稳定，即使其冷却直到所述聚合物-药物结合物粒子固化。所得纳米粒子 通过用合适溶剂，例如石油醚倾析来洗涤，以生成自由流动粉末。用这种技术制备的 粒子的外表面通常光滑且致密。热熔粒子形成可用于制备含有水解不稳定的聚合物- 药物结合物(例如某些聚酐)的粒子。优选地，用于经由这种方法制备微粒的聚合物 -药物结合物将具有小于75,000道尔顿的总体分子量。
3.溶剂去除
溶剂去除也可用于由水解不稳定的聚合物-药物结合物制备粒子。在这种方法中， 将所述聚合物-药物结合物分散或溶解于挥发性有机溶剂，例如二氯甲烷中。这一混 合物接着通过搅拌悬浮于有机油(例如硅油)中以形成乳液。由所述乳液形成固体粒 子，其可随后由上清液中分离。用这种技术制造的球的外部形态高度依赖于所述聚合 物-药物结合物的身份。
4.喷雾干燥
在这种方法中，将所述聚合物-药物结合物溶解于有机溶剂，例如二氯甲烷中。 通过由压缩气体流驱动的微粒化喷嘴抽吸所述溶液，且所得气雾剂悬浮于加热的空气 旋风分离器中，从而使溶剂从微液滴蒸发，形成粒子。介于0.1-10微米范围内的粒子 可使用这种方法获得。
5.相转化
粒子可使用相转化方法由聚合物-药物结合物形成。在这种方法中，将所述聚合 物-药物结合物溶解于“优良”溶剂中，且将所述溶液注入强非溶剂中以使所述聚合物- 药物结合物在有利条件下自发产生微粒或纳米粒子。所述方法可用于产生在宽尺寸范 围内(包括例如约100纳米到约10微米)的纳米粒子，这些纳米粒子通常具有窄粒 径分布。
6.凝聚
使用凝聚形成粒子的技术为所属领域中已知的，例如在GB-B-929406；GB-B-929 401；和美国专利第3,266,987号、第4,794,000号和第4,460,563号中。凝聚涉及将 聚合物-药物结合物溶液分离成两种不可混溶的液相。一种相是致密凝聚相，其含有 高浓度的所述聚合物-药物结合物，而第二相含有低浓度的所述聚合物-药物结合物。 在所述致密凝聚相内，所述聚合物-药物结合物形成纳米级或微米级液滴，其凝固成 粒子。凝聚可通过温度改变、加入非溶剂或加入微盐(简单的凝聚)，或通过加入另 一聚合物，由此形成互聚物复合物(复杂的凝聚)来诱发。
7.低温铸造
用于控制释放微球的极低温度铸造的方法描述于甘博特兹(Gombotz)等人的美 国专利第5,019,400号中。在这种方法中，将所述聚合物-药物结合物溶解于溶剂中。 所述混合物接着在低于使所述聚合物-药物结合物液滴凝固的所述聚合物-药物结合 物溶液的凝固点的温度下雾化到含有液体非溶剂的容器中。当所述液滴和用于所述聚 合物-药物结合物的非溶剂温热时，所述液滴中的溶剂解冻且被提取到所述非溶剂中， 凝固成微球。
C.由聚合物-药物结合物形成的植入物
植入物可由一或多种非线性多嵌段共聚物-药物结合物形成。在优选实施例中， 所述植入物是眼内植入物。
在一些情况下，植入物是由单一聚合物-药物结合物形成(即，植入物由含有相 同的活性剂、疏水性聚合物区段、分支点(存在时)和一或多个亲水性聚合物区段的 一种聚合物-药物结合物形成)。
在其它实施例中，植入物是由两种或两种以上不同的聚合物-药物结合物的混合 物形成。例如，植入物可由含有不同的活性剂和相同的疏水性聚合物区段、分支点(存 在时)和一或多个亲水性聚合物区段的两种或两种以上聚合物-药物结合物形成。所 述植入物可用于例如共投予两种或两种以上活性剂。在其它情况下，植入物是由含有 相同的活性剂和不同的疏水性聚合物区段、分支点(存在时)和/或亲水性聚合物区 段的两种或两种以上聚合物-药物结合物形成。所述植入物可用于例如改变活性剂的 释放速率。植入物也可由含有不同的活性剂和不同的疏水性聚合物区段、分支点(存 在时)和/或亲水性聚合物区段的两种或两种以上聚合物-药物结合物形成。
植入物也可由一或多种非线性多嵌段共聚物-药物结合物与一或多种额外聚合物 的掺合物形成。在这些情况下，所述一或多种额外聚合物可为非生物可降解或生物可 降解的聚合物，不过生物可降解的聚合物为优选的。在这些实施例中，可选择所述一 或多种额外聚合物的身份和质量，例如以影响粒子稳定性，即分布到需要递送的位点 处所需的时间和递送所需的时间。
可与非线性多嵌段共聚物-药物结合物掺合的代表性合成聚合物包括聚(羟酸)，例 如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸乙醇酸共聚物)、聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(乙丙 交酯)；聚酐；聚原酸酯；聚酰胺；聚碳酸酯；聚烯烃，例如聚乙烯和聚丙烯；聚亚 烷基二醇，例如聚(乙二醇)；聚氧化烯烃，例如聚(氧化乙烯)；聚对苯二甲酸烯烃酯， 例如聚(对苯二甲酸乙二酯)；聚乙烯醇；聚乙烯醚；聚乙烯酯；聚卤化乙烯，例如聚 (氯乙烯)；聚乙烯吡咯烷酮；聚硅氧烷；聚(乙烯醇)；聚(乙酸乙烯酯)；聚苯乙烯；聚 氨酯和其共聚物；衍生化纤维素，例如烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤 维素酯、硝化纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基-丙基甲基 纤维素、羟基丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻 苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和纤维素硫酸钠盐(本文中统称为“合 成纤维素”)；丙烯酸、甲基丙烯酸或其共聚物或衍生物(包括酯)的聚合物，聚(甲 基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、 聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯 酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷 酯)(本文中统称为“聚丙烯酸”)；聚(丁酸)；聚(戊酸)；和聚(丙交己内酯)，其共聚物 和掺合物。如本文所用，“衍生物”包括具有化学基团(例如烷基、亚烷基)的取代、 添加、羟基化、氧化和由所属领域技术人员按常规所做的其它修饰的聚合物。
优选的生物可降解聚合物的实例包括羟酸(例如乳酸和乙醇酸)的聚合物和与 PEG的共聚物、聚酐、聚(原酸)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交己内酯)、 其掺合物和共聚物。
优选的天然聚合物的实例包括蛋白质，例如白蛋白和醇溶谷蛋白，例如玉米蛋白； 和多糖，例如褐藻酸盐；纤维素；和聚羟基烷酸酯，例如聚羟基丁酸酯。
植入物的活体内稳定性可在制造期间通过使用聚合物，例如与聚乙二醇(PEG) 共聚合的聚乙丙交酯来调节。
优选的非生物可降解聚合物的实例包括乙烯乙酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰 胺、其共聚物和混合物。
1.植入物尺寸和形状
植入物可具有任何几何形状，例如纤维、薄片、膜、微球、球、杆、圆盘或板。 鉴于所提出的植入物插入方法、处置简易性等，植入物尺寸由例如植入物的耐性、植 入物的位置、尺寸限制的因素决定。
在采用薄片或膜的情况下，为便于处置，所述薄片或膜将在至少约0.5mm x 0.5 mm的范围内，通常约3-10mm x 5-10mm，其中厚度为约0.1-1.0mm。在采用纤维 的情况下，纤维直径一般将在约0.05-3mm范围内，且纤维长度一般将在约0.5-10mm 范围内。
植入物的尺寸和形状也可用于控制植入位点处的释放速率、治疗时期和药物浓 度。较大的植入物将递送按比例较大的剂量，但视表面质量比而定，可具有较慢释放 速率。选择植入物的特定尺寸和几何形状以适合植入位点。
眼内植入物可具有在约5μm与约2mm之间，或在约10μm与约1mm之间的 尺寸以用针投予，可具有大于1mm或大于2mm，例如3mm或高达10mm的尺寸 以通过手术植入投予。人类的玻璃体房能够容纳相对较大的变化几何形状的植入物， 所述植入物具有例如1到10mm的长度。所述植入物可为具有约2mm x 0.75mm直 径的尺寸的圆柱形球粒(例如，杆)。所述植入物可为具有约7mm到约10mm的长 度和约0.75mm到约1.5mm的直径的圆柱形球粒。在某些实施例中，所述植入物呈 具有约0.5mm直径、约6mm长度和约1mg重量的挤压细丝的形状。
眼内植入物也可设计成至少略具柔性以便促进所述植入物插入眼睛中(例如，玻 璃体中)和随后容纳所述植入物。所述植入物的总重量通常为约250到5000μg，更 优选地为约500-1000μg。在某些实施例中，所述眼内植入物具有约500μg、750μg 或1000μg的质量。
2.制造方法
植入物可使用所属领域中已知的任何合适技术制造。用于制备植入物的合适技术 的实例包括溶剂蒸发方法、相分离方法、界面方法、成型方法、注射成型方法、挤压 方法、共挤压方法、雕刻压制方法、模切方法、热压和其组合。用于制造植入物的合 适方法可鉴于多种因素选择，包括存在于所述植入物中的聚合物/聚合物区段的特性、 存在于所述植入物中的一或多种活性剂的特性和所需的植入物形状和尺寸。用于制备 植入物的合适方法描述于例如美国专利第4,997,652号和美国专利申请公开案第US 2010/0124565号中。
在某些情况下，挤压方法可用于避免植入物制造期间对于溶剂的需要。当 使用挤压方法时，选择所述聚合物/聚合物区段和活性剂以便在制造所需的温度， 通常至少约85℃下稳定。然而，视聚合组分和所述一或多种活性剂的性质而定， 挤压方法可采用约25℃到约150℃，更优选地约65℃到约130℃的温度。
植入物可经共挤压以便提供覆盖所述植入物的全部或部分表面的涂层。所述涂层 可为易蚀的或非易蚀的，且可为不可透、半透或可透活性剂、水或其组合的。所述涂 层可用于进一步控制活性剂自所述植入物的释放。
压缩方法可用于制造植入物。压缩方法经常产生具有比挤压方法快的释放速率的 植入物。压缩方法可采用约50-150psi，更优选地约70-80psi，甚至更优选地约76psi 的压力，且使用约0℃到约115℃，更优选地约25℃的温度。
IV.医药调配物
提供含有由一或多种聚合物-药物结合物与一或多种医药学上可接受的赋形剂组 合形成的粒子的医药调配物。代表性赋形剂包括溶剂、稀释剂、pH调节剂、防腐剂、 抗氧化剂、悬浮剂、润湿剂、粘度调节剂、张力剂、稳定剂和其组合。合适的医药学 上可接受的赋形剂优选地选自公认安全级(GRAS)的材料，且可投予个体而不引起 不合需要的生物副作用或不需要的相互作用。
在一些情况下，医药调配物仅含有一种类型的聚合物-药物结合物粒子(即，并 入所述医药调配物中的聚合物-药物结合物粒子具有相同组成)。在其它实施例中，医 药调配物含有两种或两种以上不同类型的聚合物-药物结合物粒子(即，所述医药调 配物含有两个或两个以上聚合物-药物结合物粒子群体，其中所述聚合物-药物结合物 粒子群体具有不同的化学组成、不同的平均粒径和/或不同的粒径分布)。
A.额外活性剂
医药组合物可含有一或多种不存在于所述聚合物-药物结合物中的额外活性剂。 在一些情况下，一或多种额外活性剂可封装于、分散于由一或多种聚合物-药物结合 物形成的粒子中或以其它方式与所述粒子缔合。在某些实施例中，一或多种额外活性 剂也可溶解或悬浮于医药学上可接受的载剂中。
在某些实施例中，医药组合物含有一或多种局部麻醉剂。代表性局部麻醉剂包括 丁卡因、利多卡因、阿美索卡因、丙氧苯卡因、利诺卡因和丁哌卡因。在一些情况下， 一或多种额外试剂，例如透明质酸酶，也加入所述调配物中以加速且改进所述局部麻 醉剂的分散。
B.赋形剂
由所述聚合物-药物结合物形成的粒子将优选地调配为用于注射或表面施用于眼 睛的溶液或悬浮液。用于眼部投予的医药调配物优选地呈由一或多种聚合物-药物结 合物形成的粒子的无菌水溶液或悬浮液形式。可接受的溶剂包括例如水、林格氏溶液、 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)和等渗氯化钠溶液。所述调配物也可为在非毒性、肠胃 外可接受的稀释剂或溶剂(例如1,3-丁二醇)中的无菌溶液、悬浮液或乳液。
在一些情况下，所述调配物是以液体形式分布或封装。或者，用于眼科投予的调 配物可以例如通过将合适的液体调配物冻干而获得的固体形式包装。所述固体可在投 予之前用适当的载剂或稀释剂复原。
用于眼科投予的溶液、悬浮液或乳液可用维持适用于眼科投予的pH所必需的有 效量的缓冲液缓冲。合适的缓冲液为所属领域技术人员众所周知且适用的缓冲液的一 些实例为乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液。
用于眼科投予的溶液、悬浮液或乳液也可含有一或多种张度剂以调节所述调配物 的等渗范围。合适的张度剂为所属领域中众所周知的且一些实例包括甘油、甘露醇、 山梨醇、氯化钠和其它电解质。
用于眼科投予的溶液、悬浮液或乳液也可含有一或多种防腐剂以防止所述眼科制 剂的细菌污染。合适的防腐剂为所属领域中已知的且包括聚六亚甲基双胍(PHMB)、 苯扎氯铵(BAK)、稳定化氧氯复合物(另外称为普瑞特(Purite))、乙酸苯汞、 氯丁醇、山梨酸、氯己定、苄醇、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞和其混合物。
用于眼科投予的溶液、悬浮液或乳液也可含有所属领域中已知的一或多种赋形 剂，例如分散剂、润湿剂和悬浮剂。
对于其它投予途径，所述粒子或药物结合物可悬浮或乳化于如用于眼科投予的相 同媒剂中的一或多者中。其可通过注射、滴液、喷雾、表面应用或沉积于粘膜表面， 例如眼睛(眼部)、鼻子(鼻)、口腔(颊)、直肠、阴道、经口，或注射于血流、组 织或皮肤中来投予。
V.使用方法
在某些实施例中，含有由一或多种所述聚合物-药物结合物形成的粒子的医药组 合物用于治疗或预防一或多种眼睛疾病。在一些实施例中，由一或多种所述聚合物- 药物结合物形成的植入物用于治疗或预防一或多种眼睛疾病。
当投予眼睛时，所述粒子和植入物经一段延长时期，优选地长于3天，更优选地 长于7天，最优选地长于10天释放低剂量的一或多种活性剂。在一些实施例中，所 述粒子和植入物经7天到24周，更优选地7天到8周，优选地7天到3周的一段时 间释放有效剂量的一或多种活性剂。在其它情况下，所述粒子和植入物经7天到2 年，更优选地7天到56周，更优选地4周到56周，最优选地8周到28周的一段时 间释放有效剂量的一或多种活性剂。
所述聚合物-药物结合物的结构、粒子/植入物形态、粒子剂量和并入所述粒子/ 植入物中的聚合物-药物结合物的量可经调适以经一段延长时期向眼睛投予治疗有效 量的一或多种活性剂，同时使副作用减到最少，例如减少微光ERG b波振幅和/或视 网膜变性。
A.欲治疗的眼部疾病和病症
将含有由本文提供的一或多种所述聚合物-药物结合物形成的粒子的医药组合物 投予有需要的患者的眼睛以治疗或预防一或多种眼睛疾病或病症。由一或多种所述聚 合物-药物结合物形成的植入物也可投予有需要的患者的眼睛以治疗或预防一或多种 眼睛疾病或病症。
在一些情况下，所述眼睛疾病或病症影响眼睛后段。如本文所用，眼睛后段是指 眼睛的后面三分之二，包括玻璃体前界膜和它后面的所有眼部结构，例如玻璃体液、 视网膜、脉络膜和视神经。
在优选实施例中，投予含有由本文提供的一或多种所述聚合物-药物结合物形成 的粒子的医药组合物以治疗或预防眼内新生血管疾病。在某些实施例中，所述粒子是 由含有蒽环霉素(例如柔红霉素或阿霉素)的聚合物-药物结合物形成，所述蒽环霉 素抑制平滑肌细胞增殖。
眼睛疾病，尤其是特征在于眼部新生血管的眼部疾病，表示一种显著公共卫生问 题。眼内新生血管疾病的特征在于在一或多个眼睛区域中的未受抑制血管生长。在未 受抑制的情况下，所述血管形成会破坏和/或遮掩眼睛中的一或多个结构，导致视力 丧失。眼内新生血管疾病包括增殖性视网膜病变、脉络膜新生血管(CNV)、年龄相 关黄斑变性(AMD)、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、病 理性近视、希林二氏病、眼睛的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角 膜新生血管和视网膜新生血管(RNV)。眼内新生血管疾病在在世界范围内折磨数百 万人，在许多情况下导致严重视力丧失以及生活质量和生产力降低。
其它眼睛疾病和病症，例如葡萄膜炎，也难以使用现有疗法治疗。葡萄膜炎是涉 及葡萄膜的任何组件(例如虹膜、睫状体或脉络膜)的发炎的普通术语。上覆视网膜 的发炎(称为视网膜炎)或视神经发炎(称为视神经炎)可伴随或不伴随葡萄膜炎发 生。
葡萄膜炎的眼部并发症可产生严重且不可逆转的视力丧失，尤其在未被认识到或 经不当治疗时。葡萄膜炎的最常见并发症包括视网膜剥离、视网膜、视神经或虹膜的 新生血管和囊样黄斑水肿。如果在黄斑(视网膜中心5％，对视力至关重要)内发生 肿胀、渗漏和背景型糖尿病性视网膜病变(BDR)，则可发生黄斑水肿(ME)。ME 是严重视力受损的一种常见原因。
新生血管可由肿瘤引起。所述肿瘤可为良性或恶性肿瘤。示范性良性肿瘤包括错 构瘤和神经纤维瘤。示范性恶性肿瘤包括脉络膜黑素瘤、葡萄膜黑素瘤或睫状体的虹 膜、葡萄膜黑素瘤、视网膜母细胞瘤或转移性疾病(例如，脉络膜转移)。
所述新生血管可由眼部伤口造成。例如，所述伤口可为眼球的外伤性损伤(例如 角膜裂伤或眼科手术)的结果。
可投予所述聚合物-药物结合物以预防玻璃体视网膜手术后的增殖性玻璃体视网 膜病变或降低其风险，预防角膜手术(例如，角膜移植和准分子激光手术)后的角膜 混浊，预防小梁切除术的闭合，或预防或实质上减慢翼状胬肉的复发。
可投予所述聚合物-药物结合物以治疗或预防与发炎相关的眼睛疾病。在所述情 况下，所述聚合物-药物结合物优选地含有消炎剂。示范性发炎性眼睛疾病包括(但 不限于)葡萄膜炎、眼内炎和眼科外伤或手术。所述眼睛疾病也可为感染性眼睛疾病， 例如HIV视网膜病变、弓蛔虫病、弓形体病和眼内炎。
含有由一或多种所述聚合物-药物结合物形成的粒子的医药组合物也可用于治疗 或预防影响眼睛其它部分的一或多种疾病，例如干眼病、睑板腺炎、青光眼、结膜炎 (例如，过敏性结膜炎、春季结膜炎、巨乳头性结膜炎、特应性角膜结膜炎)、具有虹 膜新生血管的新生血管青光眼和虹膜炎。
基于所述活性剂的选择和投予途径，所述组合物和植入物适用于治疗其它病症。 尽管存在经由眼部途径实现的益处，包括延长的功效和发炎缓解，但所述结合物当经 由另一途径投予时也应提供益处和改进的药物动力学。
B.投予方法
1.投予模式
所述聚合物-药物结合物可通过玻璃体内注射(例如，前部、中间或后部玻璃体 注射)、结膜下注射、前房内注射、经由颞侧注射到前房中、基质内注射、角膜内注 射、视网膜下注射和眼内注射局部地投予眼睛。在一个优选实施例中，所述医药组合 物是通过玻璃体内注射投予。
或者，含有由一或多种聚合物-药物结合物形成的粒子的医药组合物可经由施用 于角膜表面的滴眼剂投予。
对于其它投予途径，所述粒子或药物结合物可悬浮或乳化于如用于眼科投予的相 同媒剂中的一或多者中。其可通过注射、滴液、喷雾、表面应用或沉积于粘膜表面， 例如眼睛(眼部)、鼻子(鼻)、口腔(颊)、直肠、阴道、经口，或注射于血流、组 织或皮肤中来投予。
本文所述的植入物可使用所属领域中已知的合适植入方法投予眼睛。在某些实施 例中，所述植入物是使用针，例如22号针经玻璃体内注射。经玻璃体内放置所述植 入物可鉴于植入物尺寸、植入物形状和欲治疗的疾病或病症而变化。
在一些实施例中，含有由一或多种所述聚合物-药物结合物形成的粒子的医药组 合物是与一或多种额外活性剂共投予。如本文所用，“共投予”是指在同一剂型内投予 所述聚合物-药物结合物和一或多种额外活性剂，以及使用不同剂型同时或基本上同 时投予所述聚合物-药物结合物和一或多种额外活性剂。如本文所用，“基本上同时” 一般意指在10分钟内，优选地在5分钟内，更优选地在2分钟内，最优选地在1分 钟内。
2.剂量(Dosage)
优选地，由所述聚合物-药物结合物形成的粒子和植入物将经一段延长时期释放 有效量的一或多种治疗剂。在优选实施例中，所述粒子和植入物经至少2周的一段时 期，更优选地经至少4周的一段时期，更优选地经至少6周的一段时期，最优选地经 至少8周的一段时期释放有效量的一或多种活性剂。在一些实施例中，所述粒子和植 入物经3个月或更长的一段时期释放有效量的一或多种活性剂。
在一些情况下，含有由一或多种聚合物-药物结合物形成的粒子的医药调配物(或 由一或多种聚合物-药物结合物形成的植入物)以治疗有效量投予有需要的患者以减 少脉络膜新生血管。在一些实施例中，含有由一或多种聚合物-药物结合物形成的粒 子的医药调配物(或由一或多种聚合物-药物结合物形成的植入物)以治疗有效量投 予有需要的患者以减少CNV面积，如通过荧光素血管造影术所测量，减少达至少 15％，更优选地至少25％，更优选地至少40％，最优选地至少50％。
在一些情况下，含有由一或多种聚合物-药物结合物形成的粒子的医药调配物(或 由一或多种聚合物-药物结合物形成的植入物)以治疗有效量投予有需要的患者以减 少视网膜新生血管。在一些情况下，医药调配物(或由一或多种聚合物-药物结合物 形成的植入物)以治疗有效量投予有需要的患者以减少RNV面积，如通过荧光素血 管造影术所测量，减少达至少15％，更优选地至少25％，更优选地至少40％，最优 选地至少50％。
有效剂量可由所属领域技术人员基于连接于所述聚合物的药物的治疗功效和测 定所述结合物的药物动力学来测定。
3.治疗功效
在年龄相关黄斑变性的情况下，患者的治疗功效可通过以下一或多者来测量：分 析从基线到所需时间的最佳矫正视力(BCVA)平均变化；分析如与基线相比，在所 需时间视力丧失少于15个字母(3行)的患者的比例；分析如与基线相比，在所需 时间视力增加大于或等于15个字母(3行)的患者的比例；分析在所需时间具有 20/2000或更差的视力斯奈伦等效值的患者的比例；分析国家眼科研究所视功能问卷 (National Eye Institute Visual Functioning Questionnaire)；和使用荧光素血管造影术分 析在所需时间的CNV尺寸和CNV渗漏量。
在某些实施例中，至少25％、更优选地至少30％、更优选地至少35％、最优选 地至少40％的具有最近发作CNV且用本文所述的调配物治疗的患者的视力改进3行 或更多行。
对于其它疾病或病症，基于所述疾病或病症的一或多种症状的缓解或减少来测定 功效。例如，在使用例如雷帕霉素的药物来限制血管成形术后肌细胞的不受控制增殖 的情况下，将以所述聚合物不存在下可与雷帕霉素相当的剂量起始，使用所述聚合物 用这一剂量分析功效，其中功效与相对于对照的再狭窄减少相关。
在治疗肿瘤的情况下，功效可测量为增殖速率的减少、肿瘤质量的减少或转移的 减少。
本发明将通过参考以下非限制性实例进一步加以了解。
实例1：制备聚酐-药物结合物粒子
合成聚合物
通过熔融缩聚来制备(聚乙二醇)3聚(癸二酸)共聚物(PEG3-PSA)。简单地说，癸 二酸在乙酸酐中回流以形成癸二酸预聚物(酰基-SA)。使用所属领域中已知的方法制 备柠檬酸-聚乙二醇(PEG3)(班沙巴特(Ben-Shabat,S.)等人大分子生物科学 (Macromol Biosci).6:1019-1025(2006))。2.0g CH3O-PEG-NH2、26mg柠檬酸、83mg 二环己基碳化二亚胺(DCC)和4.0mg 4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)加入10mL二 氯甲烷中。这一混合物在室温下搅拌过夜，接着沉淀，用乙醚洗涤，且在真空下干燥 以分离PEG3。接着，酰基-SA(90％w/v)和PEG3(10％w/v)在180℃下聚合30分 钟。每隔15分钟将氮气吹扫进烧瓶中持续30秒。将聚合物冷却到环境温度，溶解于 氯仿中，且沉淀到过量石油醚中。沉淀物通过过滤来收集且在真空下干燥到恒重。
形成DXR-PSA-PEG3纳米粒子
通过将PEG3-PSA与DXR以规定比率溶解于3mL二氯甲烷和1mL DMSO中且 在50℃下反应2小时，接着均质化(L4RT,银生机器制造公司(Silverson Machines), 东朗梅多(East Longmeadow),马萨诸塞州(MA))到100mL含有1％聚乙烯醇(25 kDa,西格玛公司(Sigma))的水溶液中来制备DXR-PSA-PEG3纳米粒子。粒子接着 通过使氯仿在室温下蒸发，同时搅拌2小时来凝固。通过离心(在4℃下，20,000×g， 持续20分钟)来收集所述粒子，且用重蒸馏水洗涤三次。通过动态光散射使用 ZetaSizer Nano ZS(马尔文仪器公司(Malvern Instruments),索思伯勒(Southborough), 马萨诸塞州(MA))来测定粒径。在25℃下在90°的散射角下执行尺寸测量。
活体外DXR-PSA-PEG3纳米粒子的DXR释放
DXR-PSA-PEG3纳米粒子以2mg/mL悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，pH 7.4) 中且在37℃下在旋转平台(140 RPM)上培育。在所选时间点，通过离心(13,500× g，持续5分钟)收集上清液且将粒子再悬浮于新鲜PBS中。由在480nm下的吸光 度测量DXR含量。
结果
以上制备的DXR-PSA-PEG3纳米粒子含有23.6％DXR(以重量计)，且具有647 nm的平均粒径。活体外研究显示，DXR在37℃下在PBS中在漏槽条件呈与癸二酸 的结合物形式以稳定方式自所述纳米粒子释放持续长达2周，其中无初始快速药物释 放阶段(即，无“突释效应”)。
实例2：治疗小鼠CNV模型中的脉络膜新生血管
材料和方法
根据视觉与眼科学研究协会关于眼科和视觉研究中动物的使用的声明 (Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)和约翰霍普金斯大学动物保护和利用委员会(Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee)的准则来治疗无病原体C57BL/6 小鼠(查尔斯河实验室(Charles River),威尔明顿(Wilmington),马萨诸塞州(MA))。
如先前所述通过激光光凝术诱发的布鲁赫膜破坏来诱发脉络膜NV(吐伯(Tobe, T.)等人,美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)135(5):1641-1646(1998))。简单地说， 5-6周龄的雌性C57BL/6小鼠用盐酸氯胺酮(100mg/kg体重)麻醉且瞳孔扩张。用 OcuLight GL二极管激光器(艾里德克斯公司(Iridex),山景城(Mountain View),加 利福尼亚(CA))的狭缝灯递送系统和呈隐形眼镜形式的手持式盖片在每只眼睛的后 极的9、12和3点钟位置处执行激光光凝术(75μm光斑尺寸，0.1 sec持续时间，120 mW)以检查视网膜。在激光照射时产生水泡指示布鲁赫膜破坏，这是获得CNV的 一个重要因素；因此，仅其中产生水泡的灼伤包括在所述研究中。
在激光诱发的布鲁赫膜破坏之后，即刻使小鼠随机分成用于眼内注射的各治疗 组。用哈佛泵微注射系统(Harvard Pump Microinjection System)和提拉式玻璃微针 在解剖显微镜下执行玻璃体内注射。
在注射后1、4、7和14天，用Micron照相机(菲尼克斯研究实验室有限公 司(Phoenix Research Laboratories Inc.),普莱森顿(Pleasanton),加利福尼亚(CA)) 拍摄眼底照片。14天后，用1ml含有25mg/ml荧光素标记的葡聚糖(2 x 106道尔顿 平均分子量；西格玛阿德里奇公司(Sigma-Aldrich),圣路易斯(St.Louis),密苏里 州(MO))的PBS灌注小鼠且通过荧光显微法检查脉络膜铺片。用尼康数码照相机 (Nikon Digital Still Camera)DXM1200(尼康仪器有限公司(Nikon Instruments Inc.), 纽约(New York),纽约州(NY))捕捉图像。使用图像分析软件(Plus； 媒体控制公司(Media Cybernetics),银泉(Silver Spring),马里兰州(MD))由不 了解治疗组的调查员测量在每个捕捉位点处的总CNV面积。
治疗氧诱发的缺血性视网膜病变
使出生后第7天(P)和P12放置于75％氧气中的C57BL/6小鼠返回室内空气且 给予PBS或含有柔红霉素、阿霉素或DXR-PSA-PEG3纳米粒子的PBS的眼内注射。 在P17，测量在视网膜表面上的视网膜NV面积。简单地说，在P17，对小鼠给予1μl 大鼠抗小鼠血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)抗体(Pharmingen,圣何塞(San Jose),加利福尼亚(CA))的眼内注射且在12小时后，使小鼠安乐死且在室温下将 眼睛固定于PBS缓冲的福尔马林中持续5小时。解剖视网膜，洗涤，且在室温下用 与Alexa 488(英俊公司(Invitrogen),卡尔斯巴德(Carlsbad),加利福尼亚(CA)) 结合的山羊抗大鼠多克隆抗体以1:500稀释度培育45分钟，且铺片。不了解治疗组 的观测者通过图像分析测量每个视网膜的NV面积。
治疗VEGF诱发的视网膜新生血管
在P14，对在光感受器中表达VEGF的半合子视紫红质/VEGF转基因小鼠给予1 μl PBS或含有10μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子的PBS的眼内注射。在P21、P28、P35、 P42或P49，使小鼠麻醉，用荧光素标记的葡聚糖(2×106平均分子量，西格玛阿德 里奇公司(Sigma-Aldrich))灌注，且通过荧光显微法(Axioskop2 plus；蔡司公司(Zeiss), 索恩伍德(Thornwood),纽约州(NY))在400×放大倍率下检查脉络膜铺片，所述 显微镜提供窄景深，使得当沿视网膜外缘的新生血管对准焦点时，视网膜血管的剩余 部分未对准焦点，从而允许简单描绘和量化新生血管。用三色电荷耦合装置摄影机 (Cool SNAPTM-Pro；媒体控制公司(Media Cybernetics),银泉(Silver Spring),马 里兰州(MD))和帧接收器使图像数字化。设定图像分析软件(Image-Pro Plus 5.0； 媒体控制公司(Media Cybernetics),银泉(Silver Spring),马里兰州(MD))以识 别荧光染色的新生血管且使用所述软件来计算每个视网膜的总新生血管面积。执行图 像分析的调查员不了解治疗组。
记录视网膜电流图(ERG)
对成体C57BL/6小鼠给予1μl PBS或含有0.1、1.0或10μg柔红霉素或阿霉素或 者1.0或10μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子的PBS的眼内注射。在注射后1、7和14天 使用Espion ERG Diagnosys机器记录微光和适应光ERG。对于微光记录，使小鼠适 应黑暗过夜，且对于适应光记录，使小鼠适应在30cd/m2强度下的背景白光持续10 分钟。用盐酸氯胺酮(100mg/kg体重)和赛拉嗪(5mg/kg体重)麻醉小鼠。用含有 0.5％托品酰胺和0.5％盐酸苯肾上腺素的Midrin P(参天制药株式会社(Santen Pharmaceutical Co.),大阪(Osaka),日本(Japan))使瞳孔扩张。将小鼠放置于加 热到39℃的垫子上且在施用视轴角度棱镜溶液(爱尔康实验室(Alcon Labs),沃思 堡(Fort Worth),德克萨斯州(TX))之后将铂环电极放置于每个角膜上。将参考电 极皮下放置于眼睛之间的前部头皮中且将接地电极插入后部。使小鼠的头部保持在甘 兹菲尔德碗照明器中的标准化位置中，所述照明器确保眼睛的相等照明。用平衡的电 阻抗同时对两只眼睛进行记录。在介于-3.00到1.40 log cd-s/m2范围内的白光的11 个强度水准下记录微光ERG。针对各闪光强度，对6个测量值求平均值。在30cd/m2 背景下，在介于0.60到1.40 log cd-s/m2范围内的白光的3个强度水准下记录适应光 ERG。针对各闪光强度，对5个测量值求平均值。
测量外核层(ONL)厚度
测量ONL厚度。对成体C57BL/6小鼠给予1μl PBS或含有0.1、1.0或10μg柔 红霉素或阿霉素或者1.0或10μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子的PBS的眼内注射。使小 鼠安乐死，将标志物放置于角膜缘中12:00处，且去除眼睛且埋入最佳切削温度化合 物中。通过视神经平行于12:00或9:00子午线切割10微米冷冻切片。所述切片用苏 木精和曙红染色，用Axioskop显微镜(蔡司公司(Zeiss),索恩伍德(Thornwood), 纽约州(NY))检查，且使用三色电荷耦合装置(CCD)摄影机(IK-TU40A；东芝 公司(Toshiba),东京(Tokyo),日本(Japan))和帧接收器使图像数字化。使用 Image-Pro Plus软件(媒体控制公司(Media Cybernetics),银泉(Silver Spring),马 里兰州(MD))来描绘ONL的轮廓。在观测者不了解治疗组的情况下，在6个位置， 即在上极和视神经之间的距离的25％(S1)、50％(S2)和75％(S3)以及在下极和 视神经之间的距离的25％(I1)、50％(I2)和75％(I3)处测量ONL厚度。
统计学分析
数据表述为平均值±SEM。使用史都登氏t测试(Student's t-test)执行统计学分 析且P<0.05被视为显著的。
结果
蒽环霉素抑制脉络膜和视网膜NV
在预测新生血管AMD患者中的药物效应(赛新(Saishin,Y.)等人细胞生理学 杂志(J.Cell Physiol.)195:241-248(2003))的小鼠脉络膜NV模型(吐伯(Tobe,T.) 等人,美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)153:1641-1646(1998))中，眼内注射的10μg DNR抑制脉络膜NV，而注射1或0.1μg无显著效应(图1A)。同样，眼内注射的 10μg DXR抑制脉络膜NV且注射1或0.1μg不具有显著效应(图1B)。
在具有氧诱发的缺血性视网膜病变的新生小鼠(预测对增殖性糖尿病性视网膜病 变的效应的模型)中，眼内注射的1μg DNR显著减少视网膜NV面积，0.1μg引起 较小减少，且0.01μg不具有显著效应(图2A)。在用抗PECAM1活体内免疫荧光染 色(选择性地对NV和玻璃状体血管染色的技术)之后，NV在视网膜铺片上显现。 眼内注射1μg DXR而不注射0.1或0.01μg会显著影响视网膜NV面积(图2B)。在 注射1μg DNR或DXR之后5天，沉淀的药物在视网膜表面上显现。对侧眼中脉络 膜或视网膜NV的平均面积并未显著不同于其中两只眼均注射媒剂的小鼠的眼睛中 的平均面积，指示DNR或DXR的眼内注射无全身性效应。
眼内注射DNR或DXR对视网膜功能的影响
由于DNR和DXR为抗代谢物以及HIF-1抑制剂，检查通过ERG所分析的其对 视网膜功能的影响。在眼内注射1μg而非0.1μg的DNR或DXR之后14天，平均微 光和适应光b波振幅存在显著减少。这些数据指示，尽管DNR和DXR强烈地抑制 眼部NV，但团注游离药物可引起视网膜毒性。眼内注射地高辛后的视网膜毒性
先前已经证实，眼内注射0.01-0.25μg地高辛会抑制HIF-1转录活性和眼部NV (吉田(Yoshida,T.)等人美国实验生物学联合会会刊(FASEB J.)24:1759-1767 (2010))。为了探究DXR和DNR对视网膜功能的有害影响是否可能与其抑制HIF-1 活性有关，测量眼内注射0.25和0.05μg地高辛对视网膜功能的影响。在眼内注射 0.25μg地高辛之后1周，平均微光a波振幅、平均微光b波振幅和平均适应光b波 振幅存在显著减少。在视网膜中的6个测量位置中的3处，外核层厚度也存在减少， 指示光感受器细胞的死亡。这些结果与眼内注射0.25μg地高辛之后的实质毒性一 致。眼内注射0.05μg地高辛时毒性较小，当仍引起平均微光和适应光b波振幅的 显著减少。因此，对于蒽环霉素和地高辛两者，在眼睛中注射游离药物带来视网膜 毒性的风险。
DXR-聚合物纳米粒子对眼部NV的效应
首先，在具有激光诱发的脉络膜NV的小鼠中测试眼内注射DXR纳米粒子的效 应。在激光诱发的布鲁赫膜破坏之后，C57BL/6小鼠接受10、1.0或0.1μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子的眼内注射。接受1μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子的动物的 眼底照片显示在注射之后1天，上覆后部视网膜的纳米粒子出现大的橙色块，其随时 间缓慢减少且在第14天仍轻易可见。粒子在长达5周的时间段内保持可见。
在用荧光素标记的葡聚糖灌注以在第14天通过荧光显微法显现脉络膜NV的小 鼠中，与注射PBS的对侧眼相比，在给予DXR-PSA-PEG3纳米粒子的眼内注射的眼 睛中脉络膜NV的面积看起来较小。图像分析证实，与注射PBS的眼睛相比，在注 射10、1或0.1μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子的眼睛中脉络膜NV的平均面积显著较小 (图3A)。
DXR-PSA-PEG3纳米粒子对已建立的脉络膜NV的效应是通过使所述NV生长7 天且接着注射1μg DXR-PSA-PEG3纳米粒子来研究的。在注射之后7天，注射 DXR-PSA-PEG3纳米粒子的眼睛的平均脉络膜NV面积显著小于注射PBS的对照眼 中所见的面积，且还显著小于在7天时存在的脉络膜NV的基线量(图3B)。这指示， DXR-PSA-PEG3纳米粒子引起建立的脉络膜NV的衰退。
DXR-PSA-PEG3纳米粒子调配物也使用缺血诱发的视网膜新生血管模型来研究 (史密斯(Smith,L.E.H.)等人眼科研究与视力学(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.) 35:101-111(1994))。与注射PBS的对侧眼相比，眼内注射1μg DXR-PSA-PEG3纳米 粒子会显著减少平均视网膜NV面积(图4)。
在rho/VEGF转基因小鼠中在眼内注射DXR-聚合物纳米粒子之后对NV的长期抑 制
其中视紫红质启动子驱动光感受器中VEGF的表达的Rho/VEGF转基因小鼠具 有在出生后第7天(P)开始的持续VEGF表达，且提供一种卓越模型来测试治疗剂 的活性的持续时间(冈本(Okamoto,N.)等人美国病理学杂志(Am.J.Pathol.) 151:281-291(1997))。
在P14，在半合子rho/VEGF小鼠的一只眼中给予10μg DXR-PSA-PEG3纳米粒 子的眼内注射且在对侧眼中给予PBS。在注射后第4(图5A)或5周(图5B)，注 射DXR纳米粒子的眼睛中的平均视网膜下NV面积显著小于注射媒剂的对侧眼。
眼内注射1或10μg DXR纳米粒子不会引起毒性，如通过ERG或ONL厚度所测 量
在眼内注射10μg DXR-PSA-PEG3后14天，与注射PBS的眼睛相比，微光或适 应光b-波振幅无显著差异。外核层厚度也无差异，指示DXR纳米粒子不会引起光感 受器细胞死亡。
实例3.兔的药物动力学研究
材料和方法
制备PEG3-PSA聚合物
通过熔融缩合来合成(聚乙二醇)3聚(癸二酸)共聚物(PEG3-PSA)。简单地说，癸 二酸在乙酸酐中回流以形成癸二酸预聚物(酰基-SA)。通过使CH3O-PEG-NH2(2.0g)、 柠檬酸(26g)、二环己基碳化二亚胺(DCC；83mg)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP； 4.0mg)混合，加入10mL二氯甲烷中，在室温下搅拌过夜，接着沉淀且用乙醚洗涤， 且在真空下干燥来制备聚乙二醇(PEG3)。接着，酰基-SA(90％w/v)和PEG3(10％ w/v)在180℃下聚合30分钟。每隔15分钟将氮气吹扫进烧瓶中持续30秒。将聚合 物冷却到环境温度，溶解于氯仿中，且沉淀到过量石油醚中。沉淀物通过过滤来收集 且在真空下干燥到恒重，产生所述PEG3-PSA聚合物。
制备DXR-PSA-PEG3微粒和纳米粒子
为了制备DXR-PSA-PEG3纳米粒子，将80mg PEG3-PSA溶解于6mL二氯甲烷 (DCM)中且将20mg盐酸阿霉素(DXR)(NetQem有限责任公司,达勒姆(Durham), 北卡罗来纳州(NC))溶解于2mL二甲亚砜(DMSO)中。混合所述聚合物与药物 的溶液且在50℃下保持30分钟。使用L4RT均质机(银生机器制造公司(Silverson Machines),东朗梅多(East Longmeadow),马萨诸塞州(MA))使所得混合物在 50mL 1％聚乙烯醇(PVA)溶液(25kDa，Polyscience,奈尔斯(Niles),伊利诺伊 州(IL))中在10,000rpm下均质化3分钟。所述粒子悬浮液在室温下搅拌2小时以 去除二氯甲烷。通过离心(在4℃下，20,000×g，持续20分钟)来收集所述粒子， 且用超纯水洗涤三次，接着冻干。
DXR-PSA-PEG3微粒以类似方式制备。简单地说，200mg PEG3-PSA溶解于3mL DCM中且与溶解于1.5mL DMSO中的40mg DXR混合。在50℃下培育30分钟之 后，所述混合物在100mL PVA中在3,000rpm下均质化1分钟。在搅拌2小时之后， 通过离心(9,000 x g，持续25分钟)收集粒子且洗涤三次，接着冻干。
粒子表征
使用库尔特粒度仪(Coulter Multisizer)IV(贝克曼库尔特有限公司 (Beckman-Coulter Inc.),富勒顿(Fullerton),加利福尼亚(CA))测定粒径。针对 每个批次的微粒对超过100,000个粒子定尺寸以测定平均粒子直径。通过扫描电子显 微术(SEM)使用冷阴极场发射SEM(JEOL JSM-6700F,皮博迪(Peabody),马萨 诸塞州(MA))来表征粒子形态。通过将所述粒子的干粉溶解于DCM和DMSO中 来测定药物负载且使用UV分光光度计在490nm下测量吸光度。
动物程序
色素Dutch-Belted兔用于这些研究(n＝10)。根据视觉与眼科学研究协会关于眼 科和研究中动物的使用的声明(Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement of Use of Animals in Ophthalmic and Research)和约翰霍普金斯大学动物保 护和利用委员会(Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee)的准则来 治疗动物。对于眼内注射和房水收集，用克他命(25mg/kg)和赛拉嗪(2.5mg/Kg) 的肌肉内注射来麻醉动物。当施用镇静剂时，用2.5％盐酸苯肾上腺素和10％托品酰 胺使瞳孔扩张。使用0.5％盐酸丙氧苯卡因的表面滴注来执行眼部表面麻醉。
对于注射液，将26号针小心地引入颞上缘后部1.5mm处的玻璃体腔中，其中针 尖导向中部玻璃体。将0.1mL体积的DXR-PSA-PEG3微粒或纳米粒子悬浮液递送到 右眼中，且将0.1mL媒剂(PBS)递送到左眼中。使所述针在适当位置保持10秒， 接着抽出以防止从进入位点回流。使动物返回其笼中且监测直到麻醉作用失效。
在所指示的时间，通过插入30号针穿过所述缘且去除房水来抽出房水(约0.1 mL)。样品存储在-80℃下直到使用。在研究结束时(对于纳米粒子治疗的动物为 第105天且对于微粒治疗的动物为第115天)，使用基于戊巴比妥的安乐死(>150 mg/Kg)使动物安乐死。对动物进行摘除且分离出玻璃体且存储在-80℃下直到使 用。
兔房水和玻璃体样品中释放的药物结合物的HPLC量化
在通过HPLC量化药物含量之前，使100μL房水样品或玻璃体样品与200μL甲 醇混合且在4℃下培育3小时。在离心(15,000×g，10min)且通过0.2μm PTFE过 滤器过滤之后，将150μL滤液注射到配备有cl8反相柱(5μm,4.6×250mm；格雷斯公 司(Grace),伊利诺伊州迪亚菲德(Deerfield IL))的沃特世(Waters)HPLC系统中。由 含有水和乙腈(60％:40％，v/v)的等度流动相在1mL/min下洗脱所释放的药物结合 物且使用荧光检测器(激发波长：500nm，发射波长：551nm)进行检测。估计的检 测极限为10ng/mL或20nM。在不同浓度下的一系列DXR水溶液用作校正标准物。 使用Empower 3色谱数据软件(沃特世公司(Waters Corporation),马萨诸塞州米尔 福德(Milford MA))分析数据。
结果
DXR-PSA-PEG3微粒和纳米粒子
如所述合成且表征由DXR-SA-PEG3结合物构成的微粒和纳米粒子。在冻干之前 且在媒剂(PBS)中复原之后对粒子定尺寸。在冻干之前，所述微粒呈现27.2+1.0um 的平均尺寸，且所述纳米粒子呈现0.98+0.02um的平均尺寸(表1；图6)。所述微 粒的平均药物负载为13％且所述纳米粒子为20％(表1)。
表1：DXR-PSA-PEG3微粒和纳米粒子的表征
SEM分析证实具有预期尺寸的个别粒子。图6A和6B显示分别以所述微粒和纳 米粒子的体积计的尺寸分布。
在IVT投予兔之后药物释放的持续时间
兔在其右眼中接受DXR-PSA-PEG3微粒或纳米粒子的玻璃体内注射(0.1mL) 且在其左眼中仅接受媒剂(PBS)。在所指示的时间，收集房水(约0.1mL)且使用 基于定量HPLC的分析来分析所释放的药物结合物的存在。在第115天(微粒组)或 第105天(纳米粒子组)，使动物安乐死且收集房水和玻璃体。
将每只动物的AH中所释放的药物含量与玻璃体中的含量相比较。
所有兔在玻璃体内粒子投予后均呈现持续药物释放(图7A，表2)。
表2.玻璃体内递送DXR-PSA-PEG3粒子到兔中的药物动力学。
数据呈现为平均值±SD。
在微粒和纳米粒子治疗的动物中分别在115和105天的研究持续时间内观察到远 远高出所述HPLC分析的定量极限(10ng/mL或20nM)的含量(图7A)。AH相比 于玻璃体中的释放药物含量的直接比较揭露，玻璃体含量显著高于AH中所测量的含 量，与AH相比玻璃体中高达188倍(表3，图7B)。在第115天，微粒治疗的动物 的平均释放药物含量在AH中为0.09+0.13uM且在玻璃体中为7.12+12.92uM。对于 纳米粒子治疗的动物，在第105天，平均释放药物含量在AH中为0.23+0.31uM且 在玻璃体中为11.91+10.45uM(表3)。玻璃体中的药物含量是AH中所测量的药物含 量的77-90倍。
图7A为展示在用注射到玻璃体中的微粒和纳米粒子治疗的兔的房水(AH)中 随时间(天数)而变，所释放的DXR药物结合物的量(nM)的图。图7B为比较分 别在第105天和第115天在纳米粒子和微粒治疗的兔的房水(AH)和玻璃体中释放 的药物量的条线图。
表3.房水对比玻璃体中释放的药物含量的比较
数据呈现为平均值±SD。
玻璃体内递送DXR-PSA-PEG3微粒或纳米粒子到兔眼中导致长期药物释放，分 别持续至少115或105天(所述研究的持续时间)。在玻璃体中测量的释放药物含量 比房水中测量的释放药物含量高得多，平均高77-90倍。
这些数据证实当眼内递送时DXR-PSA-PEG3持续释放且表明，DXR-PSA-PEG3将为用于治疗NV眼部疾病(包括NVAMD)的有希望的疗法。
实例4.完全生物可降解的DXR-PSA-PEG3杆的合成和活体外评估
成功地制得具有0.5mm直径、0.5cm长度和1mg质量的杆形DXR-PSA-PEG3结合物，具有三种阿霉素(DXR)药物负载含量10％、30％和50％。活体外DXR释 放证实使用所有三种杆类型时，释放持续至少25天。
材料和方法
制备PEG3-PSA聚合物
通过熔融缩合来合成(聚乙二醇)3聚(癸二酸)共聚物(PEG3-PSA)。简单地说，癸 二酸在乙酸酐中回流以形成癸二酸预聚物(酰基-SA)。通过使CH3O-PEG-NH2(2.0g)、 柠檬酸(26g)、二环己基碳化二亚胺(DCC；83mg)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP； 4.0mg)混合，加入10mL二氯甲烷中，在室温下搅拌过夜，接着沉淀且用乙醚洗涤， 且在真空下干燥来制备聚乙二醇(PEG3)。接着，酰基-SA(90％w/v)和PEG3(10％ w/v)在180℃下聚合30分钟。每隔15分钟将氮气吹扫进烧瓶中持续30秒。将聚合 物冷却到环境温度，溶解于氯仿中，且沉淀到过量石油醚中。沉淀物通过过滤来收集 且在真空下干燥到恒重，产生所述PEG3-PSA聚合物。
制备DXR-PSA-PEG3杆
为了制备DXR-PSA-PEG3杆，使用三种不同浓度的DXR来制造具有10％、30％ 和50％(w/w)的药物负载含量的杆。对于10％、30％和50％药物负载的杆，将PEG3-PSA 和盐酸阿霉素(DXR)(NetQem有限责任公司,达勒姆(Durham),北卡罗来纳州 (NC))以9:1、7:3和1:1(w/w)的比率加入CHCl3中。PEG3-PSA和DXR在50℃ 下培育1小时，之后通过真空去除CHCl3。将反应产物磨碎成细粉末且接着压缩成具 有0.5mm直径的玻璃管，所述玻璃管用作模子。所述杆从所述模子挤压出且切割成 0.5cm长度。各杆重约1mg(0.9-1.2mg)。
活体外药物释放
一根杆(约1mg)加入1ml磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，pH 7.4)中且在37℃ 下在旋转平台(140RPM)上培育。在所选时间点，收集上清液且加入新鲜PBS。由 在480nm下的吸光度测量DXR-结合物浓度。
结果
制得具有三种不同的药物负载含量10％、30％和50％的杆形DXR-PSA-PEG3结合 物。所述DXR-PSA-PEG3结合物形成具有0.5mm直径、0.5cm长度和1mg质量的杆。
使用具有药物负载含量10％、30％和50％的DXR-PSA-PEG3杆评估活体外药物 释放的持续时间(图8)。所有三种杆的药物释放持续至少25天。
这些数据证实，杆形DXR-PSA-PEG3结合物的合成是可能的。成功地合成由具 有不同药物浓度的DXR-PSA-PEG3结合物构成的杆，且所有杆均呈现活体外持续药 物释放。这些数据还表明，可制得不同尺寸、质量和药物含量的杆且可优化药物释放 速率以针对每种递送的药物且针对每种治疗适应症获得最有效的药物递送曲线。
实例5.制造DXR-PCPH-PSA-PEG3聚合物结合物
合成由完全生物可降解的DXR-PSA-PCPH-PEG3聚合物药物结合物构成的微粒 且与所述DXR-PSA-PEG3微粒相比，呈现较慢药物释放速率和更长的持续药物释放 持续时间。将PCPH加入所述聚合物中会增加聚合物-药物结合物的疏水性，导致药 物释放的持续时间延长，这大概是由于DXR溶解性降低。
材料和方法
合成1,6-双(对羧基苯氧基)己烷(CPH)
如考尼克斯(Conix)(1966)所述，合成1,6-双(对羧基苯氧基)己烷(CPH)。简单 地说，搅拌水(80mL)中的对羟基苯甲酸(27.6g)和氢氧化钠(16.0g)且加热到 回流温度。经30分钟时间加入1,6-二溴己烷(96％，15.7mL)，同时维持在回流温度 下，且另外回流3.5小时。将溶解于水(10mL)中的氢氧化钠(4.0g)加入所述混 合物中且再回流2小时，接着使反应混合物在室温下静置过夜。通过过滤分离所述二 钠盐，用40mL甲醇洗涤且溶解于蒸馏水中。将所述溶液温热到60-70℃且用6 N硫 酸酸化。通过过滤分离所述二元酸且在真空下干燥到恒重。
合成PreCPH
1,6-双(对羧基苯氧基)己烷(CPH)(10.0g)在氮气下在200mL乙酸酐中回流30 分钟，接着通过过滤去除未反应的二酸且通过蒸发去除溶剂。残留物从二甲基甲酰胺 和乙醚中再结晶，用无水乙醚洗涤且在真空下干燥到恒重。
合成PEG3-PSA-PCPH预聚物
通过熔融缩合来合成(聚乙二醇)3聚(癸二酸)聚(CPH)共聚物(PEG3-SA-PCPH)。 简单地说，癸二酸在乙酸酐中回流以形成癸二酸预聚物(酰基-SA)。通过使 CH3O-PEG-NH2(2.0g)、柠檬酸(26g)、二环己基碳化二亚胺(DCC；83mg)和 4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP；4.0mg)混合，加入10mL二氯甲烷中，在室温下搅 拌过夜，接着沉淀且用乙醚洗涤，且在真空下干燥来制备聚乙二醇(PEG3)。接着， PEG3(10％w/v)、酰基-SA(60％w/v)和preCPH(30％w/v)在180℃下聚合30分 钟。每隔15分钟将氮气吹扫进烧瓶中持续30秒。将聚合物冷却到环境温度，溶解于 氯仿中，且沉淀到过量石油醚中。沉淀物通过过滤来收集且在真空下干燥到恒重，产 生所述PEG3-PSA-PCPH预聚物。
制备DXR-PSA-PCPH-PEG3微粒
为了制备DXR-PSA-PCPH-PEG3微粒，将200mg PEG3-PSA-PCPH溶解于3mL 二氯甲烷(DCM)中且与溶解于1.5mL DMSO中的40mg盐酸阿霉素(DXR)(NetQem 有限责任公司,达勒姆(Durham),北卡罗来纳州(NC))混合。在50℃下培育30 分钟之后，所述混合物在100mL PVA中在3,000rpm下均质化1分钟。在搅拌2小 时之后，通过离心(9,000 x g，持续25分钟)收集粒子且洗涤三次，接着冻干。
粒子表征
使用库尔特粒度仪(Coulter Multisizer)IV(贝克曼库尔特有限公司 (Beckman-Coulter Inc.),富勒顿(Fullerton),加利福尼亚(CA))测定粒径。针对 每个批次的微粒对超过100,000个粒子定尺寸以测定平均粒子直径。
活体外药物释放
DXR-PSA-PCPH-PEG3微粒(2mg)悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，pH 7.4) 中且在37℃下在旋转平台(140 RPM)上培育。在所选时间点，通过离心(13,500 x g， 持续5分钟)收集上清液且将粒子再悬浮于新鲜PBS中。由在480 nm下的吸光度测 量DXR-结合物。
结果
合成DXR-PSA-PCPH-PEG3微粒且所述微粒呈现24.3±8.7um的平均尺寸，其中 药物负载含量为13.9％。
在所述DXR-PSA-PCPH-PEG3微粒与所述DXR-PSA-PEG3微粒之间比较活体外 药物释放的持续时间(平均尺寸22.5±8.3um)。所述DXR-PSA-PEG3微粒显示持续 45天的药物释放，而所述DXR-PSA-PCPH-PEG3微粒显示较慢药物释放速率和持续 超过75天的药物释放(图9)。
合成由完全生物可降解的DXR-PSA-PCPH-PEG3聚合物药物结合物构成的微粒。 与所述DXR-PSA-PEG3-微粒(未加入所述CPH聚合物的粒子)相比，所述 DXR-PSA-PCPH-PEG3微粒呈现较慢药物释放速率和更长的持续药物释放持续时间。 将CPH加入所述聚合物中会增加所释放的药物结合物的疏水性，这预期降低DXR的 溶解性，且导致药物释放持续时间延长。
这些数据证实，通过改变聚合物化学性质以增加所释放的药物结合物的疏水 性，可改进药物释放的含量和持续时间，指示可优化这些参数以针对每种递送的 药物且针对每种治疗适应症获得最有效的药物递送曲线。
机译： 用于递送活性剂的非线性多嵌段共聚物 - 药物缀合物
机译： 用于递送活性剂的非线性多嵌段共聚物 - 药物缀合物
机译： 用于递送活性剂的非线性多嵌段共聚物药物共轭物
