白莲蒿提取物不同活性部位的制备及其作为杀螨活性物质的应用

摘要

本发明公开了一种白莲蒿提取物不同活性部位的制备，是将成熟期新鲜白莲蒿植物的地上部位阴干粉碎后进行醇提，减压浓缩，晾干，得白莲蒿提取物；再将白莲蒿提取物用蒸馏水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水相四种不同活性部位。以白莲蒿为植物源制备的杀螨剂，对农业害螨具有非常明显的触杀活性，并且对农作物有促生作用，在毒杀害螨的过程中提高了农作物的生产力和抗逆性，保证了农业生产的增产增收。作为安全无毒，绿色环保的植物源农药，对环境友好，对害虫天敌和人畜安全，对于建立新型的绿色生态农业具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于植物源农药技术领域，涉及一种杀螨活性物质的制备，尤其涉及白莲蒿不同活性部位的制备；本发明同时还涉及白莲蒿不同活性部位的杀螨活性及其制备杀螨剂的应用。

背景技术

螨类（mites）隶属于蛛形纲（Arachnida），蜱螨亚纲（Acari），种类繁多，全球约有30-50 万种，是动物界中仅次于昆虫纲的第二大生物类群。依据其经济学意义，可分为医牧蜱螨和农业害螨2大类。农业害螨破坏植物的正常生理机能，引起落叶、落蕾、落果，轻则造成减产，重则整株死亡，其中不少螨类还能传播植物病害，是公认的最难防治的农业害虫之一。

目前农业上防治害螨的，化学杀螨剂仍占现行杀螨剂品种的绝大部分；仅有的植物源、矿物油杀螨剂均还属于第一代杀螨剂，杀螨效能较低，且易产生药害。面对日益严重的环境和食品安全问题，使用高效、低毒、低残留、对环境安全的生物农药，已成为农药开发研究的新方向。

蒿属( Artemisia) 是菊科( Compositae) 春黄菊族( Anthemideae) 的一个大属，全世界约300 余种。我国有186 种， 44 变种，分布全国各地，为我国种子植物中少有的大属，是民间广泛使用的一大类药物，其中1/3 种已药用，有消炎、清热、解毒、活血、止血之效，也被报道具有杀虫、杀螨、杀菌、除草、杀线虫和杀软体动物活性（周利娟，桑晓清，孙永艳，杨文杰. 蒿属植物的农药活性及其有效成分. 江西农业大学学报, 2012, 34(4): 699-705.）。白莲蒿( Artemisia sacrorum Ledeb. )是草原区山地草原亚类中分布的1种重要的蒿类植物，分布面积较广，有清热解毒、凉血止血等功效。但是利用白莲蒿防治病虫害的功能却未见研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供白莲蒿提取物不同活性部位的制备方法；

本发明的另一目的在于提供利用白莲蒿提取物不同活性部位为杀螨活性物质制备杀螨剂的应用。

一、白莲蒿不同活性部位的制备

1、白莲蒿提取物的制备

采集成熟期新鲜白莲蒿植物地上部位，阴干粉碎后，加入其10-50倍体积的50-100%乙醇水溶液，超声或加热回流提取10-90分钟，提取液减压浓缩得浸膏，然后在通风避光处晾干，得白莲蒿提取物。

2、白莲蒿不同活性部位的制备

将白莲蒿提取物用其100-2000倍体积的蒸馏水溶解，再加入白莲蒿提取物2-10倍体积的石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层，下层水溶液用石油醚重复萃取2-5次，合并石油醚层，减压浓缩，制得白莲蒿石油醚相。

石油醚萃取后的水溶液中加入水溶液2-10倍体积的乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层水溶液用乙酸乙酯重复萃取2-5次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，制得白莲蒿乙酸乙酯相。

乙酸乙酯萃取后剩余水溶液中加入水溶液2-10倍体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，上清液为正丁醇层；下层水溶液用正丁醇重复萃取2-5次，合并正丁醇层，减压浓缩，制得白莲蒿正丁醇相。

将正丁醇萃取后剩余水溶液，减压浓缩，制得白莲蒿水相。

二、白莲蒿不同活性部位（萃取相）的杀螨活性

1、供试叶螨：叶螨是最重要的农业害螨，也是农业害螨中最大的类群。本发明测试的是采自田间未施药黄豆苗上的朱砂叶螨[Tetranychus cinnabarinus （Boiduval）]，选用雌成螨。该螨为世界植食性害螨，因其个体小、繁殖快、种群密度大、发育历期短、行动范围小、适应性强、突变率高且易发生抗药性等特点，是公认的最难防治的有害生物类群之一（何林等，植物保护学报，2004，31（4），395-400）。

2、不同浓度测试样品的配制：选取上述制备的白莲蒿不同萃取相，分别用含10%蒸馏水的丙酮液配制成2 mg/mL浓度的母液，在预试的基础上用蒸馏水将母液稀释成不同梯度浓度的溶液待测。生物测定前加入1%的表面活性剂JFC（C7-C9烷醇聚氧乙烯醚）。

3、生物活性测定方法：参照FAO（联合国粮农组织）推荐的测定螨类的标准方法——玻片浸渍法，并加以改进（Wang Y. J., et al. Agrochemical Research Application. 2006, 10, 20–23.）。将双面胶带剪成2~3 cm长，贴在显微镜载玻片的一端，用镊子揭去胶带上的纸片，用零号毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上（注意：不要粘住螨足、螨须和口器），每片粘3行，每行粘10 头。在温度（25±1）℃、相对湿度85%左右的生化培养箱中放置4 h后，用双目镜观察，剔除死亡或不活泼个体。药液配好后将带螨玻片的一端浸入药液中，轻轻摇动5 s 后取出，迅速用吸水纸吸干螨体及其周围多余的药液。置于上述生化培养箱中，24 h后用双目镜检查死亡数，计算死亡率。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡。以含10%蒸馏水的丙酮液稀释同样的倍数+JFC浸渍处理作为溶剂对照。对照组死亡率在10%以下为有效测定，用Abbott 公式对处理组死亡率进行校正。5个浓度测定平行进行3次，取其平均值。试验结果分析采用SPSS统计软件（版本13.0）进行。

4、测试结果：见表1。表1的结果表明，本发明制备的白莲蒿不同萃取部位均对农业害螨具有明显的触杀活性，其中以水相和正丁醇相为最高，特别是水相部位。水相部位在0.25 mg/mL的低浓度下，就可以对朱砂叶螨产生90%以上的触杀活性，具有很好的应用价值和开发前景。

三、白莲蒿不同萃取相对农作物的促生作用

1、供试植物的培养：本实施例中以常见农作物小麦、油菜和莴苣为实验材料。选用饱满的种子，在无菌滤纸上培养发芽后，进行促生活性试验。

2、不同浓度萃取物的促生活性：实验在12孔板中进行，选取大小相仿的供试植物放入孔板中，加入相同量的无菌水。选取按照实施例2中所得的白莲蒿不同萃取相，分别配置成不同浓度的DMSO溶液，相同体积加入到孔板中，以加入同体积的DMSO为阴性对照，每个处理重复3次。处理后3-5天观察并记录植物生长情况，计算植物抑制率公式为：促生率（%）=（处理组-对照组）/对照组×100%，实验结果用SPSS软件（版本13.0）进行统计分析。

3、测试结果：见表2、3、4：

 

       

表2、3、4显示的结果表明，白莲蒿提取物的不同萃取部位对农作物小麦、油菜和莴苣都有一定的促进作用，特别是对油菜效果更为明显。油菜在我国南北方均有大面积种植，是重要的经济作物。其中，水相部位是杀螨活性最强的部位，也对农作物表现出明显的促生作用。

四、杀螨剂的制备

将上述制备的白莲蒿不同活性部位分别用含蒸馏水的丙酮液（蒸馏水的体积百分数为 0~20%）配制成浓度0.5~10 mg/mL的母液，再用蒸馏水将母液稀释成白莲蒿活性部位浓度为0.05~5.0 mg/mL的溶液；然后加入表面活性剂混合均匀，即得不同活性杀螨剂产品。上述表面活性剂为C7-C9烷醇聚氧乙烯醚，表面活性剂的加入量为药液体积的0.5~10%。

综上所述，本发明以白莲蒿为植物源制备的杀螨剂，对农业害螨具有非常明显的触杀活性，并且对农作物有促生作用，在毒杀害螨的过程中提高了农作物的生产力和抗逆性，保证了农业生产的增产增收。作为安全无毒，绿色环保的植物源农药，对环境友好，对害虫天敌和人畜安全，对于建立新型的绿色生态农业具有重要意义。此外，白莲蒿分布面积广泛，生命力强，也易于大面积培养和种植，资源丰富。因此，本发明所制备的白莲蒿杀螨剂具有原料易得，制备工艺简单，成本较低，杀螨效果明显，环境友好等优点，具有非常好的应用前景。

具体实施方式

下述通过具体实施例对本发明白莲蒿不同萃取部位的制备及其作为杀螨剂的应用做进一步说明。

实施例一

1、白莲蒿提取物的制备：采集成熟期（8月）新鲜的白莲蒿植物的地上部位，阴干，粉碎。加入20倍体积80%乙醇水溶液，超声提取30分钟，重复提取3次。将提取溶剂减压浓缩，得浸膏，在通风避光处，晾干，得白莲蒿提取物。

2、白莲蒿不同活性部位的制备：将制得的白莲蒿提取物用200倍体积的蒸馏水溶解，在水溶液中加入3倍于水溶液体积的石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层；重复萃取3次，合并石油醚层，减压浓缩，制得白莲蒿石油醚相活性部位。将石油醚萃取后剩余水溶液中加入3倍体积的乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，制得白莲蒿乙酸乙酯相活性部位。将乙酸乙酯萃取后剩余水溶液中加入3倍体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，上清液为正丁醇层，重复萃取3次，合并正丁醇层，减压浓缩，制得白莲蒿正丁醇相活性部位。将正丁醇萃取后剩余水溶液，减压浓缩，制得白莲蒿水相活性部位。

3、杀螨剂即得制备：称取上述制备的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水相四种不同活性部位物质1-5 mg，分别加入含10%蒸馏水的丙酮液配制成2 mg/mL浓度的母液，再用蒸馏水将母液稀释成1.0 mg/mL的溶液，加入药液体积1%的表面活性剂JFC（C7~C9烷醇聚氧乙烯醚），混合均匀即得杀螨剂。杀螨剂对朱砂叶螨的杀灭效果见表1。

实施例二

1、白莲蒿提取物的制备：同实施例1。

2、白莲蒿不同活性部位的制备：将制得的白莲蒿提取物用1000倍体积的蒸馏水溶解，在水溶液中加入5倍于水溶液体积的石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层；重复萃取3次，合并石油醚层，减压浓缩，制得白莲蒿石油醚相活性部位。将石油醚萃取后剩余水溶液中加入5倍体积的乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，制得白莲蒿乙酸乙酯相活性部位。将乙酸乙酯萃取后剩余水溶液中加入5倍体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，上清液为正丁醇层，重复萃取3次，合并正丁醇层，减压浓缩，制得白莲蒿正丁醇相活性部位。将正丁醇萃取后剩余水溶液，减压浓缩，制得白莲蒿水相活性部位。

3、杀螨剂即得制备：称取上述制备的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水相四种不同活性部位物质1-5 mg，分别用含10%蒸馏水的丙酮液配制成2 mg/mL浓度的母液，再用蒸馏水将母液稀释成0.5 mg/mL的溶液，加入药液体积1%的表面活性剂JFC（C7~C9烷醇聚氧乙烯醚），混合均匀即得杀螨剂。杀螨剂对朱砂叶螨的杀灭效果见表1。

实施例三

1、白莲蒿提取物的制备：采集成熟期（8月）新鲜的白莲蒿植物的地上部位，阴干，粉碎。加入20倍体积80%乙醇水溶液，回流提取90分钟，重复提取3次。将提取溶剂减压浓缩，得浸膏，在通风避光处，晾干，得白莲蒿提取物。

2、白莲蒿不同活性部位的制备：将制得的白莲蒿提取物用1500倍体积的蒸馏水溶解，在水溶液中加入8倍于水溶液体积的石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层；重复萃取3次，合并石油醚层，减压浓缩，制得白莲蒿石油醚相活性部位。将石油醚萃取后剩余水溶液中加入8倍体积的乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，制得白莲蒿乙酸乙酯相活性部位。将乙酸乙酯萃取后剩余水溶液中加入8倍体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，上清液为正丁醇层，重复萃取3次，合并正丁醇层，减压浓缩，制得白莲蒿正丁醇相活性部位。将正丁醇萃取后剩余水溶液，减压浓缩，制得白莲蒿水相活性部位。

3、杀螨剂即得制备：称取上述制备的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水相四种不同活性部位物质1-5 mg，分别用含10%蒸馏水的丙酮液配制成2 mg/mL浓度的母液，再用蒸馏水将母液稀释成0.33 mg/mL的溶液，加入药液体积1%的表面活性剂JFC（C7~C9烷醇聚氧乙烯醚），混合均匀即得杀螨剂。杀螨剂对朱砂叶螨的杀灭效果见表1。

实施例四

1、白莲蒿提取物的制备：同实施例3。

2、白莲蒿不同活性部位的制备：将制得的白莲蒿提取物用2000倍体积的蒸馏水溶解，在水溶液中加入10倍于水溶液体积的石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层；重复萃取3次，合并石油醚层，减压浓缩，制得白莲蒿石油醚相活性部位。将石油醚萃取后剩余水溶液中加入10倍体积的乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，制得白莲蒿乙酸乙酯相活性部位。将乙酸乙酯萃取后剩余水溶液中加入10倍体积的正丁醇，剧烈振荡，静置分层，上清液为正丁醇层，重复萃取3次，合并正丁醇层，减压浓缩，制得白莲蒿正丁醇相活性部位。将正丁醇萃取后剩余水溶液，减压浓缩，制得白莲蒿水相活性部位。

3、杀螨剂即得制备：称取上述制备的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水相四种不同活性部位物质1-5 mg，分别用含10%蒸馏水的丙酮液配制成2 mg/mL浓度的母液，再用蒸馏水将母液稀释成0.25 mg/mL的溶液，加入药液体积1%的表面活性剂JFC（C7~C9烷醇聚氧乙烯醚），混合均匀即得杀螨剂。杀螨剂对朱砂叶螨的杀灭效果见表1。