一种芽枝状枝孢霉及木质纤维素酶制剂

摘要

本发明涉及一种芽枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)，于2014年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9587。本发明还提供了含有所述芽枝状枝孢霉的酶制剂及其在木质纤维素原料糖化中的应用。利用本发明所提供的木质纤维素酶制剂，能够在较低的温度下完成木质纤维素原料的糖化处理过程，对原料利用更加充分、糖得率高、能耗低、特别适合于纤维素乙醇发酵生产领域的大规模产业化应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的涉及一种芽枝状枝孢霉及木质 纤维素酶制剂。

背景技术

利用农林废弃物、能源植物等木质纤维素原料转化生产燃料乙 醇，对缓解能源及环境危机具有重要意义。目前，纤维素乙醇的高成 本仍是限制其大规模工业化生产与应用的主要因素。其中，酶成本占 总成本的50～60％，其次为能耗成本。单一种类的木质纤维素酶已无 法满足工业需求，需要多种木质纤维素酶的协同作用，以实现在减少 酶用量的同时，提高对木质纤维素原料的可发酵糖得率。然而，目前 已报道木质纤维素水解复合酶的糖化效率仍不能满足产业需要。

木质纤维素原料经预处理后，残留的木质素及其衍生物对水解酶 的酶活力及其对木质纤维素的水解程度具有强烈的抑制作用。向木质 纤维素水解复合酶体系中添加木质素酶，可减小木质素及其衍生物对 水解酶的抑制，进而提高酶解效率和糖得率。然而，现有商品化木质 纤维素水解复合酶制剂中均未涉及木质素酶，已报道文献中也仅有几 例研究涉及木质素酶中的漆酶，同时含有多种木质素酶的水解复合酶 体系未见报道。

同时，已有木质纤维素水解复合酶的酶解作用温度范围为 35～65℃，适用于中低温条件下高效糖化木质纤维素的水解复合酶匮 乏，酶解温度为30℃以下且含有木质素酶的木质纤维素水解复合酶体 系尚属空白。构建含有木质素酶且适用于中低温条件下的高效木质纤 维素糖化酶系，可在提高糖得率的同时，缩减木质纤维素原料糖化与 发酵过程间的温差，增强工业可操作性，降低酶成本及能耗，推进纤 维素乙醇大规模产业化及应用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种木质素降解菌株。

本发明的第二个目的在于提供一种能够在30℃以下进行糖化过 程且含有木质素酶的木质纤维素水解复合酶体系。

本发明的第三个目的在于提供一种木质纤维素酶制剂在木质纤 维素原料糖化中的应用。

为了达到本发明的第一个目的，本发明提供了一种木质素降解菌 株(Cladosporium cladosporioides)经鉴定，种属来源为芽枝状枝孢 霉，已于2014年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)保藏编号为 CGMCC No.9587。

请给出分离、筛选、鉴定过程如下：

长白山森林土壤样品经鞣酸和Azure Blue平板筛选，获得真菌 菌株YCB，依据其18S rRNA和ITS rRNA基因序列和GenBank中 与之相似性较高的菌种序列以相邻连接法(Neighbor Joining,NJ)构 建系统发育树，显示与之最相关的菌种为Cladosporium sp.(100％)， 菌株YCB属于枝孢霉属(Cladosporium)，且与菌株Cladosporium  cladosporioides处于同一个分支，所以菌株YCB也属于这个种，命 名为Cladosporium cladosporioides YCB。

本发明所提供的芽枝状枝孢霉CGMCC NO.9587的分类学性质：

真菌YCB能够产生分生孢子，菌丝体呈灰绿色，菌丝有隔。依 据其18S rRNA和ITS rRNA基因序列和GenBank中与之相似性较 高的菌种序列以相邻连接法(Neighbor Joining,NJ)构建系统发育树， 显示与之最相关的菌种为Cladosporium sp.(100％)，菌株YCB属于 枝孢霉属(Cladosporium)，且与菌株Cladosporium cladosporioides处 于同一个分支，所以菌株YCB也属于这个种，命名为Cladosporium  cladosporioides YCB。

为达到本发明的第二个目的，本发明提供了一种木质纤维素酶制 剂，包括芽枝状枝孢霉CGMCC No.9587的发酵干粉和木聚糖酶；

可选的，所述木聚糖酶选选自棒曲霉(Aspergillus clavatus)来源 的木聚糖酶、黑曲霉(Aspergillus niger)来源的木聚糖酶和里氏木霉 (Trichoderma reesei)来源的木聚糖酶中的至少一种。

可选的，所述发酵干粉是按照以下方法制备获得的：

在4～30℃条件下，将芽枝状枝孢霉(CGMCC No.9587)按照 1％～10％的菌接种量接种于营养液中培养3～5d获得发酵液，利用浓 度为40％～85％的(NH₄)₂SO₄对发酵液进行沉淀后透析，将透析获得 的产物干燥后获得发酵干粉。

可选的，以重量份计，相对于1重量份的发酵干粉，棒曲霉来源 的木聚糖酶的用量为2-6份，黑曲霉来源的木聚糖酶的用量为2-6份， 里氏木霉来源的木聚糖酶的用量为2-6份。

本发明所提供的木质纤维素酶制剂对木质纤维素原料的糖转化 率高，由于该酶制剂可以在中低温条件下(4-30℃)使用，能够缩减 木质纤维素原料糖化与发酵过程间的温差，增强工业可操作性，降低 成本。

为了达到本发明的第二个目的，本发明提供了木质纤维素酶制剂 在木质纤维素原料糖化中的应用，包括以下步骤：所述的木质纤维素 酶制剂和木质纤维素原料混匀获得预混合物，将所述预混合物与pH 为2-6的缓冲液接触混匀获得酶解混合物，在4-30℃下对酶解混合物 进行糖化处理。

可选的，糖化处理的温度为4-15℃。

可选的，所述木质纤维素酶制剂和木质纤维素原料的重量比为 0.15-1.75：1。

可选的，相对于1g的预混合物，所述缓冲液的用量为50-1000mL， 所述缓冲液为醋酸钠缓冲液、酒石酸钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液。

利用本发明所提供的木质纤维素酶制剂，能够在较低的温度下完 成木质纤维素原料的糖化处理过程，对原料利用更加充分、糖得率高、 能耗低、特别适合于纤维素乙醇发酵生产领域的大规模产业化应用。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

芽枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)保藏编号为 CGMCC No.9587。

本发明提供了一种木质纤维素酶制剂，包括所述芽枝状枝孢霉 CGMCC No.9587的发酵干粉和木聚糖酶；

在本发明中，所述木聚糖酶可以由多种具有木聚糖分解能力的酶 复配获得，例如，所述木聚糖酶可以选自棒曲霉(Aspergillus clavatus) 来源的木聚糖酶、黑曲霉(Aspergillus niger)来源的木聚糖酶和里氏 木霉(Trichoderma reesei)来源的木聚糖酶中的至少一种。

在本发明中，所述发酵干粉和木聚糖酶的重量比为1：2-6；为了 获得最佳的木质素糖化效果，所述发酵干粉和木聚糖酶的重量比优选 为1：3-5。

在本发明所提供的方法中，以重量份计，相对于1重量份的发酵 干粉，棒曲霉来源的木聚糖酶的用量为2-6份，黑曲霉来源的木聚糖 酶的用量为2-6份，里氏木霉来源的木聚糖酶的用量为2-6份。

所述发酵干粉中含有芽枝状枝孢霉(CGMCC No.9587)所产生 的纤维素酶、木聚糖酶、木质素酶和酯酶、漆酶、锰过氧化物酶和非 锰依赖性过氧化物酶。

其中，所述发酵干粉是按照以下步骤制备获得的：

在4～30℃条件下，将芽枝状枝孢霉(CGMCC No.9587)按照 1％～10％的菌接种量接种于营养液中培养3～5d获得发酵液，利用浓 度为40％～85％的(NH₄)₂SO₄对发酵液进行沉淀后透析，将透析获得 的产物干燥后获得发酵干粉。

其中，所述营养液是以土豆培养基为基础培养基添加其他辅料制 备获得的，所述辅料选自玉米籽皮、麦麸、松木屑、甘蔗渣和豆粉中 的至少一种。

其中，所述土豆培养基具有本领域常规使用的组分，具体的，所 述土豆培养基含有20％土豆，2％蔗糖。

其中，相对于100重量份的所述土豆培养基、玉米籽皮的添加量 为10-50重量份、麦麸的添加量为10-50重量份、松木屑的添加量为 10-50重量份、甘蔗渣的添加量为10-50重量份、豆粉的添加量为10-50 重量份。

在发酵过程结束后，利用(NH₄)₂SO₄对发酵液进行沉淀后透析， 具体步骤包括离心收集发酵液，向上清液中加入(NH₄)₂SO₄，所得沉 淀进行透析除盐，(NH₄)₂SO₄的浓度为40％-85％，透析所使用的滤膜 为0.22μm孔径。

需要对透析获得的产物就进行干燥获得发酵干粉，本发明对于干 燥的方法没有特别的限制，可以采用本领域常规的烘干、冷冻干燥、 喷雾干燥或气流干燥方法进行。

本发明所提供的酶制剂对于将发酵干粉与木聚糖酶混合的方式 没有特别的限制，可以在使用前按照发酵干粉与木聚糖酶1：2-6的 重量比混合均匀，也可以在应用过程中将二者按比例使用。

本发明还提供了一种木质纤维素酶制剂在木质纤维素原料糖化 中的应用，包括以下步骤：将木质纤维素酶制剂和粒径为15-80目的 木质纤维素原料按照0.15-1,75：1的重量比接触混匀获得预混合物， 将所述预混合物与pH为2-6的醋酸钠缓冲液、酒石酸钠缓冲液或柠 檬酸钠缓冲液接触混匀获得酶解混合物，在4-30℃下对酶解混合物进 行糖化处理；其中，相对于1g的预混合物，醋酸钠缓冲液、酒石酸 钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液的用量为50-1000mL。

其中，所述木质纤维素原料可以为本领域常规的需要进行木质纤 维素糖化处理的生物材料，例如可以为农林废弃物、能源植物等。具 体的，可以为麦秸、菊芋茎秆或甘蔗渣。本发明所提供的方法还包括 对原料的预处理过程，包括将原料粉碎至尺寸为15-80目的颗粒，优 选的为18-70目的颗粒。

本发明对于将木质纤维素酶制剂与木质纤维素原料接触混匀的 方式没有特别的限制，只要能够使得二者充分接触从而对原料进行充 分的糖化即可。

在本发明中，糖化处理的过程可以按照本领域常规的方法进行， 值得注意的是，利用本发明所提供的木质纤维素酶制剂可以在4-30℃ 的温度下完成糖化处理步骤，特别是可以在4-15℃的低温下对木质纤 维素原料进行充分的糖化利用。

利用本发明所提供的应用所获得的糖化产物可以接下来通过乙 醇发酵过程制备纤维素乙醇。糖化液中还原糖浓度达到 5.1-14.7mg/mL。

下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理 解的是以下实施例的给出进是为了起到说明的目的，并不是用于对本 发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精 神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。

以下实施例中，土豆培养基的组成成分为20％土豆，2％蔗糖。

木质纤维素原料为麦秸、菊芋茎秆或甘蔗渣，

还原糖含量的检测方法为常规的DNS法。

实施例1

本实施例用于说明本发明所提供木质纤维素酶制剂。

将1L土豆培养基与0.05kg麦麸混合获得培养液，按照5％比例接 种芽枝状枝孢霉(CGMCC No.9587)，在30℃下恒温培养3天，收集 发酵液，用50％(NH₄)₂SO₄沉淀并透析，所获产物经喷雾干燥制成发 酵干粉。

将发酵干粉与木聚糖酶(棒曲霉Aspergillus clavatus来源，购自 宝如亿北京生物技术有限公司)按照1：2的重量比混合获得木质纤 维素酶制剂1。

实施例2

采用与实施例1相同的方法制备木质纤维素酶制剂，不同的是， 所述木聚糖酶是黑曲霉Aspergillus niger来源的(购自杰能科生物工 程有限公司)。

获得木质纤维素酶制剂2。

实施例3

采用与实施例1相同的方法制备木质纤维素酶制剂，不同的是， 所述木聚糖酶是里氏木霉Trichoderma reesei来源的(购自诺维信投 资有限公司)。

获得木质纤维素酶制剂3。

实施例4

采用与实施例1相同的方法制备木质纤维素酶制剂，不同的是， 将发酵干粉与木聚糖酶按照1：6的重量比混合获得木质纤维素酶制 剂4。

实施例5

采用与实施例1相同的方法制备木质纤维素酶制剂，不同的是， 将发酵干粉与木聚糖酶按照1：5的重量比混合获得木质纤维素酶制 剂5。

测试例1-5

分别将实施例1-5获得的木质纤维素酶制剂1-5和粒径为60目 的木质纤维素原料按照0.15：1的重量比接触混匀获得预混合物，将 0.032g所述预混合物与2mL的pH为4的醋酸钠缓冲液接触混匀获 得酶解混合物，在15℃下对酶解混合物进行糖化处理3天。获得糖 化液1-5，对糖化液中还原糖的含量进行检测，结果列于表1。

测试例6

采用与测试例1相同的方法利用木质纤维素酶制剂1对木质纤维 素原料进行糖化，不同的是，糖化的温度为4℃。获得糖化液6，对 糖化液中还原糖的含量进行检测，结果列于表1。

测试例7

采用与测试例1相同的方法利用木质纤维素酶制剂1对木质纤维 素原料进行糖化，不同的是，糖化的温度为30℃。获得糖化液7，对 糖化液中还原糖的含量进行检测，结果列于表1。

表1

糖化液 还原糖含量(mg/mL) 1 5.9 2 5.1 3 5.3 4 12.3 5 11.6 6 9.0 7 14.7

通过测试例的结果可以看出，本发明所提供的木质纤维素酶制 剂能够在低温条件下对木质纤维素原料进行糖化。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。