通过近红外线方式来进行选择性的细胞粘附/脱落、细胞图案化及细胞收集的方法

摘要

本发明涉及通过近红外线方式的选择性细胞粘附/脱落、细胞图案化及细胞收取的方法。更为特别地，将通过照射近红外线而具有放热特性的导电聚合物或金属氧化物用作细胞培养支撑体，从而可有选择地附着/脱落细胞，而无需经过酶处理。所述支撑体具有促进肝细胞增殖或分化的效果，从而可用作肝细胞培养支撑体。所述支撑体能够在不受时间或空间的限制下进行细胞粘附/脱落，从而可用于细胞图案化。

说明书

技术领域

本发明涉及通过使用近红外线来进行选择性的细胞粘附/脱落、细胞图案化和细胞收集的方法，近红外线可用于细胞培养，而且在无胰蛋白酶的条件下能使细胞脱离。

背景技术

干细胞是具有能够自我复制及分化成至少两个细胞的能力的细胞，可分为全能干细胞（totipotent stem cells）、万能干细胞（pluripotent stem cells）和多能干细胞（multipotent stem cells）。

最近，随着生物技术的发展而广泛地使用着利用这种不断自我复制及分化成体内各种组织的干细胞的治疗方法。尤其，这种方法不仅用于人体器官的再生，而且开始被用来治疗如帕金森氏病、癌症、糖尿病等不治之症（Miyahara Y. et al., Nature Medicine, 12(4), 459-465, 2006; Kang, K. S. et al., Stem Cells, 24(6), 1620-1626, 2006; Silva, G.V. et al., Circulation, 18, 111, 2005）。虽然已研发出各种利用干细胞的治疗方法，但对细胞特性的研究仍存在很多不足，而且由于干细胞增殖和分化存在局限性，因此利用干细胞的治疗也被受限。

通常，已知干细胞分化的命运往往取决于细胞-细胞（cell to cell）、以及包含成长因子的细胞-细胞外基质（ECM），而且还受着有益环境的影响（Nakayama et al, Neurosci Res, 46, 241-249, 2003）。最近，正兴起研究干细胞与干细胞环境之间相互作用的生物工程领域。这不是常用于研究或诱导细胞功能的、控制包含于细胞培养液中的激素、生长因子或血清的方法，而是通过有细胞粘附并生长的支撑体与细胞之间的相互作用而用来控制附着、增殖、分化和细胞外基质分泌的方法（Bauer S. et al., Acta Biomaterialia, 4, 1576-1582, 2008; Guo L. et al., Biomaterials, 29, 23-32, 2008）。为此，用于研发具有生物相容性的物质并改变表面特性的化学表面改性才是关键所在。

万能干细胞可被分化成源自外胚层、中胚层和内胚层的各种细胞和组织。这些细胞源自位于受精4-5天后所形成的囊胚内的内细胞团，其被称作胚胎干细胞。它们可被分化成各种不同组织，但不能形成新生命体。

多能干细胞只能被分化成包含此细胞的组织和器官的特异性细胞。它们不仅参与胚胎期、新生儿期和成年期内的组织和器官的生长及发育，还会参与维持成体组织的稳态及诱导受损组织再生的功能，通常将组织特异性多能干细胞称为成体干细胞。

所述成体干细胞是在发育后形成胚胎各器官的阶段或在成体阶段中出现的干细胞，然而其只能被分化成一般组成特定组织的细胞。这种成体干细胞用于补充成年后在多数器官中发生的正常或病理性的细胞损失。示例性成体干细胞可包括造血干细胞（HSCs）和间充质干细胞（MSCs）。已知，所述HSCs一般可被分化成血液中的血细胞，如红细胞、白细胞和血小板，而所述MSCs可被分化成中胚层组织的细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。

根据干细胞的分化或处理方法，所述干细胞可被分化成各种细胞。为了控制干细胞的分化能力，重要的是研究及控制细胞间的相互作用及包含成长因子的细胞与细胞外基质（ECM）间的相互作用。

通常，胰蛋白酶是作为细胞脱落的传统技术而被广泛使用的酶。胰蛋白酶会向附着于细胞培养器内的细胞中的化学键给予化学性破坏，从而破坏干细胞的细胞壁或所述细胞壁中的蛋白质。因此，当使用胰蛋白酶时，可能会破坏干细胞，从而会出现增殖能力和分化潜能的退化。此外，由于向整体培养器上处理胰蛋白酶，可能难以获取部分想要的细胞。

基于上述理由，有必要研发能容易地从培养器中使细胞脱落并在不破坏细胞的条件下能从所要部位使细胞脱落的新技术。

发明内容

技术问题

本发明提供一种细胞培养器、包括该细胞培养器的细胞培养成套装置及利用该成套装置的用于增殖、分化或脱落细胞的方法，通过使用该细胞培养器，可在能够吸收近红外线的导电化合物或金属氧化物膜的表面上培养细胞，并且通过照射近红外线及利用导电化合物或金属氧化物的光热特性在未让细胞受损的条件下容易并有选择地使细胞脱落。

本发明还涉及提供一种用于细胞培养的图案化基底，该图案化基底可通过照射近红外线并利用导电化合物或金属氧化物的光热特性来易使细胞脱落。

技术方案

本发明的一方面提供包括细胞培养区域的细胞培养器，在该细胞培养区域内可形成近红外线区内具有吸光度的导电化合物或金属氧化物膜。

本发明的另一方面提供细胞培养成套装置，该细胞培养成套装置包括本发明的细胞培养器和近红外线照射装置。

进一步，本发明的另一方面提供用于增殖或分化干细胞的方法，该方法包括在本发明的细胞培养器内培养成体干细胞的步骤。

进一步，本发明的另一方面提供通过向细胞培养器照射近红外线而使培养细胞脱落的方法。

进一步，本发明的另一方面提供用于细胞培养的图案化基底，该图案化基底包括一个基底及在该基底上形成的细胞培养区域，所述细胞培养区域包含近红外线区内具有吸光度的导电化合物或金属氧化物膜。

有益效果

本发明的特征在于，根据氧化和还原状态而具有近红外线的吸收特性，当照射近红外线时，由于将具有光热特性的导电化合物或金属氧化物用作用于细胞粘附的支撑体，从而在任何时间和场地都能用于所要部位上的细胞，尤其是成体干细胞的增殖、选择性脱落和图案化。

附图说明

图1为本发明化学式1a的杂环化合物的吸收光谱；

图2展示了本发明化学式1a的杂环化合物在近红外线吸收（808 nm）下的光热效果；

图3展示了将用本发明化学式1d的杂环化合物制成的氧化或还原（被还原而处于中性状态）膜用作干细胞的支撑体时所确认的干细胞的增殖率；

图4为展示了在用本发明化学式1a的杂环化合物制成的膜上培养的干细胞通过照射近红外线从选择区域脱落的显微镜照片；

图5展示了与红外线照射时间成比例的干细胞脱落面积；

图6为通过照射红外线从用本发明化学式1e的杂环化合物制成的膜脱落下来后在新的细胞培养器内进行培养的干细胞的显微镜照片；以及

图7展示了通过照射近红外线从用本发明化学式1e的杂环化合物制成的膜脱落下来的干细胞在细胞培养器内被分化16天而形成（a）骨细胞、（b）脂肪细胞和（c）的软骨细胞的结果。

具体实施方式

将详述本发明的组合物。

本发明涉及包括细胞培养区域的细胞培养器，在该细胞培养区域内形成近红外线区内具有吸光度的导电化合物或金属氧化物膜。

这里使用的“细胞培养器”是指用于传统细胞培养中的容器，该容器可由适于细胞培养的材料制成，例如，可以为聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯及其共聚物、以及玻璃中的任一种材料。优选地，所述材料为能在显微镜下进行细胞计数的透明材质，但也可选有色材质。所述容器可具有光滑表面，并且可成圆形或方形，但本发明不限于此。所述细胞培养器是根据细胞特性及其用途而选取适当形状并通过在基底上插入规定图案等特殊处理来制成的。所述细胞培养器可制成呈圆筒形、矩形或多边形的结构，但本发明不限于此。所述细胞培养器包括能够附着细胞并培养的细胞培养区域，其可以为烧瓶，或具有如皮氏培养皿的封闭结构，但本发明不限于此。 

本发明的细胞培养器，其特征在于，在具有上述形状和材料的细胞培养器内的用于细胞培养的细胞培养区域上形成近红外线区内具有吸光度的导电聚合物或金属氧化物膜。

由于所述导电聚合物或金属氧化物膜利用了通过吸收近红外线能将光能转换成热能而释放热量的所述导电聚合物或金属氧化物的光热特性，将该膜用作细胞支撑体时，在照射近红外线时会使细胞从放热部位轻易脱落，不会出现根据传统胰蛋白酶处理而使得细胞壁或细胞壁蛋白质受到破损的现象，从而在细胞培养和脱落中可重复使用。                                                                                                                                                       

    此外，根据一个实施例，将所述膜用作干细胞培养支撑体时，所述干细胞的增殖率比在常用细胞培养器内的干细胞的增殖率要高，从而被选择性脱落的干细胞可以进行再培养和分化。

因此，所述导电聚合物或金属氧化物膜可被用作用于细胞增殖或分化的支撑体。

所述导电聚合物或金属氧化物的膜可由导电单体的聚合物或共聚物、或者由近红外线区内具有吸光度的金属氧化物制成。

在本发明中，近红外线的波长范围在700～2500 nm内，本发明的近红外线区内具有吸光度的导电单体也在上述范围内具有吸光度。根据一个实施例，测定在波长约808 nm处的吸光度时，当将近红外线照射至300秒时可示出约25℃的致热效果。

所述导电单体可以为选自化学式1所示的杂环化合物和苯胺中的一种或多种化学式。

【化学式1】

在化学式1中，X为N、O、S、Se或Te，

R₁与R₂相同或不同，均可以为氢原子、-(CH₂)_?-O-(CH₂)m-(CF₂)_n-(CR₇R₈)_k-(CH₂)_d-Z、、-O-CH(R₃)-CH(R₄)-O-或-O-CH₂-C(R₅)(R₆)-CH₂-O-，然而R₁和R₂不能同时为氢；

R₃、R₄、R₅和R₆相同或不同，均可以为氢原子、-(CH₂)_d-Z、-(CH₂)_?-O-(CH₂)_m-(CF₂)_n-(CR₇R₈)_k-(CH₂)_d-Z或 ，然而R₃和R₄不能同时为氢，R₅和R₆不能同时为氢；

R₇与R₈相同或不同，均可以为氢、具有1至5个碳原子的烷基或-（CH₂）_d-Z;

Z为甲基丙烯酸酯基或丙烯酸酯基；

?为0～2的整数，m为0～3的整数，n为0～5的整数，k为0～4的整数，a为0～2的整数，b为0～7的整数，且d为0～2的整数。

优选地，所述化学式1的杂环化合物可以为化学式1a～1k中的一种或多种化学式。

【化学式1a】

【化学式1b】

【化学式1c】

【化学式1d】

【化学式1e】

【化学式1f】

【化学式1g】

【化学式1h】

【化学式1i】

[Formula 1j]

【化学式1k】

所述导电聚合物可具有平均分子量1,000～1,000,000Da。

所述导电聚合物是指由上述杂环化合物和/或苯胺发生聚合反应而生成的聚合物，是利用电学、化学、热学或光学方法或者利用引发剂聚合而成的聚合物或共聚物。

所述导电聚合物可通过利用传统催化剂的溶液聚合、通过利用电的电聚合（Macromolecular Research, 17, 791-796, 2009）、蒸汽聚合（Macromolecules, 43, 2322-2327, 2010）、溶液涂层聚合（Advanced Materials, 23, 4168-4173, 2011）或水相中的乳液聚合等来聚合杂环化合物而制成。这里所用的电聚合、蒸汽聚合、溶液涂层聚合或用于制备粒子的乳液聚合能够诱导本发明的杂环化合物发生氧化聚合，而利用常用催化剂（酸、氧化剂等）的聚合方法不仅是用于聚合杂环化合物的方法，而且还是用于聚合单体如苯胺的常用方法。

在本发明的用于制备导电聚合物膜的方法中，将所述导电聚合物通过所述聚合方法直接涂层于各种基底上，而且溶解于溶剂中的导电聚合物在被合成后通过使用各种涂层方法，如旋涂法、印刷涂布法等，可用来进行二次涂层，而通过乳液方法合成的导电聚合物粒子可被分散于溶剂中并通过二次涂层形成膜。本发明不限于所述涂层方法，而且根据化合物或步骤、或者使用或应用范围可适当地使用各种涂层方法。                    

 例如，当控制导电聚合物薄膜的掺杂态（doping state）时，将如上制成的导电聚合物薄膜置于无单体的电解质溶液（溶剂）中，通过使用循环伏安法在1V～-1V之间、以50 mV/s速率循环3次，出现所需掺杂态的电压（1V～-1V之间）时停止循环数秒后，关闭电源并用去离子溶剂进行清洗，并干燥。

所述金属氧化物可以为氧化镁、氧化锶、氧化锌、氧化铝或氧化砷等，可单独使用或至少两种的结合物。

所述导电聚合物或金属氧化物膜可具有厚度10nm～1mm。当所述厚度少于10nm时，不易形成所述膜且在膜上出现的光热现象或效果会较低。当所述厚度大于1mm时，也不易形成所述膜，而且所述物质的吸光度高时，需要将因光热现象产生的热量从邻近部位转移到基底上，此时细胞脱落所需的时间有可能很长。此外，由于本发明的细胞培养器可用在传统的细胞培养上，从而细胞种类不受限制，例如，可用于培养成体干细胞。

这里所用的“成体干细胞”是指经发育后形成胚胎的各器官的阶段或在成体阶段中出现的干细胞，其仅限于通常能够分化成特定组织的细胞。

本发明的成体干细胞可以是从源自乳腺、骨髓、脐带血、血液、肝脏、皮肤、胃肠道、胎盘或子宫等的成体干细胞中被分离并使用的。所述成体干细胞包括能被分化成星形胶质细胞的神经干细胞、能被分化成骨髓细胞的造血干细胞、能被分化成骨、软骨、脂肪、肌肉等的间充质干细胞、能被分化成肝细胞的肝干细胞等。其中，间充质干细胞是有能力分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和成纤维细胞等各种肌肉骨骼细胞的细胞。

由于所述间充质干细胞存在于脐带血（脐带）和骨髓中，与其他成体组织相比更容易被分离，而且人们正努力将所述间充质干细胞用于治疗包括这种肌肉骨骼疾病的各种疾病上。与其他干细胞不同，所述间充质干细胞易在骨髓内进行培养并得到扩增，而且与已知不同，所述干细胞可被分化成中胚层、内胚层或外胚层来源的细胞，由于使用自身细胞而不存在免疫排斥，而且与胚胎干细胞不同，那些没有向所要方向分化的细胞能引发癌的机率几乎为零，这对临床极其重要。

这里所用的术语“分化”是指在细胞进行分裂、增殖并发育过程中细胞的结构或功能被特异化，即为执行所赋予的职能，器官的细胞或组织的形态或功能出现变化的现象。通常，分化是一个系统被分裂为至少两个具有不同性质的子系统的现象。

这里所用的“增殖”是指通过分裂的同种细胞的增加，即通常指多细胞生物体内的细胞数的增加。随着细胞的增殖，当细胞数达到一定程度时，特征（或特性）一般会出现差异并受控制。通常，将体内细胞的增加及细胞内细胞质的新生归类为生长。然而，对于生物学上细胞数的增加来讲，将在多细胞生物体的胚胎阶段内尚未发生分化的时期视为增殖会更适合。

在本发明的细胞培养器中的被还原并处于中性状态下的导电聚合物或金属氧化物膜上培养成体干细胞时，细胞增殖会提高，而且用近红外线照射所述细胞培养器时，由于所述导电聚合物或金属氧化物膜的致热效果，细胞会脱落并未受损，然后将脱落的干细胞转移至新细胞培养器内并进行正常的增殖及分化。

本发明进一步涉及细胞培养成套装置，该细胞培养成套装置包括本发明的细胞培养器、以及近红外线照射装置。

由于本发明的成套装置包括用聚合物膜作为细胞支撑体的细胞培养器，在进行细胞培养时能够促进增殖，通过照射近红外线使照射区域内的细胞脱落，而且细胞脱落部位的聚合物膜不会被去掉，从而在细胞培养和脱落中可重复使用。特别地，所述成套装置可有效地用于收取干细胞，单独分离干细胞或研究一个干细胞的特性。

通常，在收取干细胞时为使干细胞从细胞培养器（组织培养聚苯乙烯）内脱落，利通胰蛋白酶会使那些在所述培养器内正进行增殖的干细胞整体脱落。根据本发明，在导电聚合物膜的表面上培养所述干细胞时，通过照射对所述细胞无害的近红外线可简单地收获所述细胞，而无需使用胰蛋白酶，而且可有选择性地使在目标区域内具有目标大小的干细胞脱落。亦即，所述传统方法难以单独分离干细胞或研究个别干细胞的特性，然而本发明可控制脱落区域的大小，即能够控制所收取的细胞数量，而且能使干细胞一一脱落。

    用于细胞脱落的射线可以为激光束，而且以1μW/cm²～300W/cm²，优选地以100 mW/cm²～250 W/cm²照射30秒～10小时。

因此，本发明提供通过用近红外线照射细胞培养器的用于脱落培养细胞的方法。

此外，当使用由氧化导电膜被还原成中性状态而成的导电聚合物膜时，干细胞增殖与在常用细胞培养器内所发生的增殖相比会有增加，从而所述导电聚合物膜可有益地用于通过干细胞的细胞治疗中。

由于能正常地培养通过使用所述导电膜所收取的干细胞并使其增殖，将所述干细胞诱导分化成预期细胞时，可有效地使成体干细胞分化成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞等。

此外，制备所述导电膜后，如同在下列实施例19和20中所示，可控制其掺杂程度。例如，如实施例19中所示，通过将制成氧化态的导电膜还原成中性态而控制所述掺杂程度时，如图3所示的还原-PEDOT一样，可增强对比传统细胞培养器中所使用的对照组TCPS的细胞培养效率。

因此，本发明提供用于增殖或分化干细胞的方法，该方法包括在本发明的细胞培养器内培养成体干细胞的步骤。

本发明还涉及用于细胞培养的图案化基底，该图案化基底包括一个基底、以及在所述基底上形成并包括近红外线区内具有吸光度的导电聚合物或金属氧化物膜的细胞培养区域。

所述用于细胞培养的图案化基底可用于培养能够形成组织的血管等的细胞，而且可有效地使细胞有规则地进行排列。

由于用于细胞培养的图案化基底使用所述膜作为细胞支撑体，当照射近红外线时无需进行酶处理也能使所述细胞脱落，而且在没有照射近红外线的细胞培养区域内仍可以培养细胞。

所述近红外线区内具有吸光度的导电聚合物或金属氧化物膜具有优异的细胞粘附性，因此即使没有形成单独的细胞粘附层也能在细胞培养区域内附着细胞。

所述基底可为金属、玻璃、硅或塑料中的一种或多种绝缘基底。

所述用于细胞培养的图案化基底可具有图案化无细胞培养区域，在该图案化无细胞培养区域内形成防止细胞粘附的层。

实施例

下面，将结合制备实施例和实施例更具体地描述本发明。这些制备实施例和实施例只为例证本发明而使用，本发明的范围不受实施例的限制。

<制备实施例1> 骨髓间充质干细胞的培养

这里所用的人骨髓是由韩国塞弗伦斯医院（Severance Hospital）的临床试验审查委员会（Institutional Review Board，IRB）承认并在病人同意之下正常采集而得的。以Ficoll-pague:骨髓血液=1:1.5比例对从骨髓间充质干细胞所得的血液实施Ficoll梯度分离法。将血液样品慢慢倒入15 mL Ficoll溶液中而使之分层，然后离心分离，从而确认在试管的中间层上形成薄的血沉棕黄层（buffy coat layer），而后分离所述血沉棕黄层并移至新的试管。在所述试管中加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）来制备共50ml溶液，在2000 rpm下离心分离所述溶液10分钟，弃上清液，在沉淀物中加入50mL PBS，摇晃所述试管使之混合均匀，然后在1500 rpm下离心分离5分钟，弃上清液，最终获得细胞。将所述细胞悬浮于培养基[DMEM（低血糖）+ 1%P/S + 10% 胎牛血清]，然后在100 mm皮式培养皿中用培养基稀释，其中包括1×10⁷细胞（在皮式培养皿中培养基的量定为10mL）。在CO₂孵化器中培养所述细胞一天后，将上清液转移至新的皮式培养皿上，然后在所述培养皿底部上所附着的细胞上填入具有与在最初培养中所用的培养基相同成分的培养基。待7～10天后，通过用胰蛋白酶使细胞脱落并每T75-烧瓶中接种2×10⁵个细胞来维持所述细胞，以此培养并维持成体干细胞。

<实施例> 用导电化合物的膜的制备

膜是通过使用本发明的导电聚合物而制成的，其中所述导电聚合物是通过如表1中所示的溶液涂布聚合、蒸汽聚合、电聚合或化学聚合等方法聚合上述化学式1a至1k的导电单体而制成的。所述电聚合、蒸汽聚合、溶液涂布聚合或用于制备粒子的乳液聚合是用来诱导上述本发明的导电单体的氧化聚合的，而使用常用催化剂（酸、氧化剂等）的聚合方法是一种用于聚合单体如杂环化合物或苯胺的传统方法。

为制备所述导电聚合物膜，通过使用上述聚合方法，可将所述导电聚合物直接涂布于各种基底上。然而，溶解于溶剂中的导电聚合物，在被合成通过旋涂进行二次涂布来制备所述膜，而通过溶液方法合成的导电聚合物粒子，被分散于溶剂中后进行二次涂布来制备所述膜。

在表1中，用于电聚合的溶剂是电解质。此外，当控制所述导电聚合物薄膜的掺杂态时，将上述所制备的导电聚合物薄膜置入无单体的电解质溶液中，然后通过循环伏安法在1与-1 V之间以速率50 mV/s循环3次。在到达所要掺杂态电压（1与-1V之间的电压）时，将循环停止数秒，切断电源，然后用纯溶剂清洗并干燥所得物。在所述乳液聚合中，所述聚合物的厚度所指明的值为粒径。下面所示的细胞脱落效率是用100换算细胞脱落部分面积与近红外线照射区域面积之比而得的值。

【表1】

 

<实验实施例1> 利用导电化合物的膜的近红外线吸光度测试

在200～3300nm范围内通过使用UV-可见光谱而获得实施例1（或2）中所制备的导电聚合物膜的吸光度。在此范围内，表1中展示了在相当于近红外线波长的808nm处的吸光度。

<实验实施例2> 通过近红外线利用导电化合物的光热效应的测定

将实施例3中所制备的导电聚合物膜置于能从底部照射近红外线的支撑台上并测定光热效应。固定808 nm的近红外线而使之输出230 mW能量并照射所制备的导电聚合物膜的底部。通过T型电热偶测定所述导电聚合物膜上部的温度来确定光热效应。在相应过程中，图2展示了根据近红外线照射时间而测定的温度值所示出的导电聚合物膜的光热效应。

如图2所示，可知通过近红外线照射温度上升了25℃或以上。

<实验实施例3> 利用导电化合物在膜上培养干细胞及有选择地脱落干细胞的方法

对实施例8中所制备的导电聚合物膜通过微弱UV射线进行消毒约2分钟，并将其用作干细胞培养中的支撑体。通过在包含导电聚合物膜的6孔板中加入骨髓来源间充质干细胞而培养干细胞，然后从所述6孔板底部照射230 mW近红外线以有选择地进行脱落。

如图3中的还原-PEDOT所示，可知道，当通过使用作为支撑体的中性导电膜培养所述干细胞时，所述干细胞的增殖速率要比在普通细胞培养器中干细胞的增殖速率更高，从而对用干细胞的细胞疗法有效。

此外，如图4和5所示，可通过近红外线照射时间控制细胞脱落面积和细胞数。

<实验实施例4>干细胞分化的确认

    对通过微UV射线对实施例9（或10）中所制备的导电聚合物膜进行消毒约2分钟，并将其用作干细胞培养中的支撑体。通过在包含导电聚合物膜的6孔板中加入骨髓来源间充质干细胞而培养干细胞，然后从所述6孔板底部照射230 mW近红外线以有选择地进行脱落。图6展示了将脱落细胞转移至细胞容器内后拍摄的各种显微镜照片。之后，通过能够分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的条件，进行诱导分化16天。此时，将在无导电膜的TCPS上培养并分化的干细胞群作为对照组。

为确认骨细胞的分化，待培养16天后，从对照组中去除培养基，用PBS清洗细胞沉淀物，后去除PBS。去除完毕后，在所述细胞沉淀物中加入蒸馏水，而后去除，此过程重复三次。将用滤纸过滤过的3% 硝酸银溶液加入到所述细胞沉淀物中，然而用箔纸包好在室温下静置30分钟。待30分钟后，去除所述箔纸和所添加的硝酸银溶液并将所述细胞沉淀物暴露于荧光灯下而诱导出所述细胞沉淀物的色变，然后在光学显微镜下进行观察。

为确认脂肪细胞的分化，待培养16天后，从对照组中去除培养基，用PBS清洗细胞沉淀物，后去除PBS。此时，用10%福尔马林处理所述细胞沉淀物，然后在室温下静置30分钟。之后，去除福尔马林，用蒸馏水清洗所述细胞沉淀物。去除完毕后，用60%异丙醇处理所述细胞沉淀物，然后在室温下静置5分钟。去除异丙醇，然后用滤纸过滤过的油红O处理所述细胞沉淀物并静置10分钟。待10分钟后，用自来水清洗所述细胞沉淀物至水变干净，然后在光学显微镜下观察染色程度。

为确认软骨细胞的分化，待培养16天后，从对照组中去除培养基，用PBS清洗细胞沉淀物，后去除PBS。用滤纸过滤过的1%番红O溶液处理所述细胞沉淀物并静置5分钟。之后，用1%醋酸处理所述细胞沉淀物3-4次，然后去除醋酸。在光学显微镜下观察染色程度。

如图7所示，可确认通过近红外线照射所脱落的干细胞经过16天的分化诱导而待16天后被分化成与对照组相同的成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞。

工业应用性

    本发明可用于细胞培养。