一种盐生杜氏藻中微量元素含量测定方法

摘要

本发明公开了一种盐生杜氏藻中β-胡萝卜素和叶绿素a含量测定方法，属水产养殖领域。β-胡萝卜素含量测定传统上是将β-胡萝卜素标准品用石油醚-异丙醇混合液稀释成系列浓度的标准品溶液，将所得的样品溶液进行液相色谱分析，从而得知样品中β-胡萝卜素含量。该法结果准确，测试费用低，但耗时长，设备昂贵，操作繁琐。海藻中叶绿素测定传统上采用分光光度计法，操作麻烦，技术性强，设备昂贵。本发明公开的萃取法测定盐生杜氏藻中β-胡萝卜素和叶绿素a含量，操作简便，耗时短，结果准确，费用低，可一次完成多个样品的测定。

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种盐生杜氏藻中β-胡萝卜素和叶绿素a含量测定 方法。

背景技术

盐生杜氏藻Dunaliella salina为双鞭毛单细胞绿藻，广布于内陆盐湖，可耐高盐度 (20-300‰)，个体较大(16-24μm×10-13μm)，因能大量合成β-胡萝卜素(最高可达干重 的14％)而受到广泛重视。β-胡萝卜素是人体内维生素A的前体，可用于防治癌症、心血管 病及老年性痴呆等退行性疾病，还能作为高级天然色素用于食品加工。临床试验表明，盐生 杜氏藻提取的盐藻素对调节血压、降低血脂、降血糖、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、胃溃疡、 胃炎、白内障、夜盲症、干眼病有较好疗效且可明显提高机体免疫力。目前，澳大利亚、以 色列、美国、中国、日本、西班牙、加拿大等已有几十家公司从事盐生杜氏藻生产。我国具 有漫长的海岸线和星罗棋布的内陆盐湖，具有培养盐生杜氏藻生产β-胡萝卜素得天独厚的自 然条件。

β-胡萝卜素含量是衡量盐生杜氏藻质量好坏的最重要指标，藻液中β-胡萝卜素含量的 测定一直是一个麻烦、费时、费事、费力、令人头疼的工作。以前，邓同乐发明了一种β- 胡萝卜素提取物中β-胡萝卜素含量的定量检测方法(专利号CN201410235214)，具体步骤 是：1)将β-胡萝卜素标准品用石油醚-异丙醇混合液稀释成系列浓度的标准品溶液；2)称取 待测的β-胡萝卜素提取物溶于石油醚-异丙醇混合液中，作为样品溶液；3)将步骤1)所得的 标准品溶液和步骤2)所得的样品溶液分别进行高效液相色谱分析；从而分别获得系列浓度的 标准品溶液以及样品溶液中β-胡萝卜素的吸收峰面积比；4)建立β-胡萝卜素标准曲线；5) 将样品溶液中胡萝卜素的峰高代入步骤4)所得的曲线方程中，从而最终得知待测的β-胡萝 卜素提取物中β-胡萝卜素的含量。该方法结果准切可靠，测试费用低，但耗时长，设备昂 贵，操作繁琐，技术要求高，效率低。

关于海藻中叶绿素测定方法，过去黄廷林曾公开了一种水生藻类叶绿素测定方法(专利 号200410073542)，该方法用分光光度法测定水中藻类叶绿素含量，采用醋酸纤维微孔滤膜 过滤水中藻类，用90％乙醇浸泡研磨截留了藻类的醋酸纤维膜，将藻类细胞中的叶绿素萃取 到乙醇中，将萃取液离心获得澄清液，以90％乙醇作参比，用分光光度计测定萃取液在630、 647、664、750nm处的吸光度，利用测定数据计算水样中叶绿素a、b、c的含量。刘春光也 发明了一种水中浮游藻类叶绿素a的测定方法(专利号200610129454)，其原理和具体操作 步骤与黄廷林的发明相近。他们的发明测定结果准确稳定，重现性好，安全无污染，但缺点 也很明显，操作麻烦，技术性强，对测试人员要求高，设备昂贵，仪器投资大，实用性不强。

为了克服传统方法的缺点，我发明了一种萃取法测定盐生杜氏藻中β-胡萝卜素和叶绿素 a含量方法，该法操作简便，技术性要求不高，耗时短，结果准确，费用低，可一次完成多 个样品的测定。

发明内容

为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻中β-胡萝卜素和叶绿素a含量 测定方法，方法如下：

β-胡萝卜素含量的测定方法

步骤1将盐生杜氏藻培养至第13天时，藻细胞密度可达到250×10⁴-400×10⁴cell/每毫升， 用移液管移取藻液100毫升，装入250毫升的三角烧瓶中；

步骤2加入15克NaCl，加入80％乙二醇(由乙二醇和蒸馏水按80∶20体积比混合而成)120 毫升，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧，放在摇床上摇匀20分钟，充分萃取；

步骤3此时液体分成上清液和下浊液，用20毫升的移液管移取上清液，加入到250毫升的 容量瓶中，用80％乙二醇定容至250毫升；

步骤4转入250毫升圆底烧瓶中，在摇床上摇匀60分钟，用721型分光光度计测定在波长 425nm时的吸光值OD₄₂₅，用下式计算β-胡萝卜素含量

β-胡萝卜素含量(mg/L)＝(最后定容体积×9.84×OD₄₂₅)÷(2.91×藻液取样体积)

最后算出的β-胡萝卜素含量单位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β-胡萝卜素毫克数。 叶绿素a含量的测定方法

步骤5将盐生杜氏藻培养至第9天时，藻细胞密度可达到150×10⁴-300×10⁴cell/每毫升， 用量筒取藻液200毫升藻液，倒入500毫升的三角烧瓶中；

步骤6加入20克硫酸亚铁，加入240毫升85％的丁酮(由丁酮和蒸馏水按85∶15体积比混 合而成)，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧，放在摇床上摇匀25分钟，充分萃取；

步骤7此时液体分成明显的上下两层，上层清亮，下层浑浊，用移液管取上清液至500毫 升的容量瓶中，用85％丁酮定容至500毫升，转入1000毫升烧杯中，保鲜膜封口，橡皮筋扎 紧，置于摇床上摇匀15分钟；

步骤8用分光光度计分别测定波长624nm和725nm时的吸光值OD₆₂₄、OD₇₂₅，用下式计算叶绿 素a含量

叶绿素a含量(mg/L)＝[(19.62×OD₆₂₄+4.83×OD₇₂₅)÷藻液取样体积]×最后定容体积 最后算出的叶绿素a含量单位是mg/L，即每升藻液中含有的叶绿素a毫克数。

有益结果

关于β-胡萝卜素含量的测定方法，邓同乐曾发明了一种β-胡萝卜素提取物中β-胡萝 卜素含量的定量检测方法(专利号CN201410235214)，该方法结果准切可靠，测试费用低， 但耗时长，设备昂贵，操作繁琐，技术要求高，效率低。关于海藻中叶绿素测定方法，过去 黄廷林曾公开了一种水生藻类叶绿素测定方法(专利号200410073542)，刘春光也发明了一 种水中浮游藻类叶绿素a的测定方法(专利号200610129454)，他们的发明测定结果准确稳 定，重现性好，安全无污染，测试费用低，但缺点也很明显：操作麻烦，技术性强，对测试 人员要求高，设备昂贵，仪器投资大，实用性不强。为了克服传统方法的缺点，我发明了一 种盐生杜氏藻中β-胡萝卜素和叶绿素a含量测定方法，本发明操作简便，技术性要求不高， 耗时短，结果准确，费用低，可一次完成多个样品的测定。

附图说明

图1为盐生杜氏藻中β-胡萝卜素测定具体操作流程；

图2为盐生杜氏藻中叶绿素a含量测定具体操作流程。

具体实施方式

β-胡萝卜素含量的测定方法

1)步骤1将盐生杜氏藻培养至第13天时，藻细胞密度可达到250×10⁴-400×10⁴cell/每 毫升，用移液管移取藻液100毫升，装入250毫升的三角烧瓶中；

2)步骤2加入15克NaCl，加入80％乙二醇(由乙二醇和蒸馏水按80∶20体积比混合而成) 120毫升，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧，放在摇床上摇匀20分钟，充分萃取；

3)步骤3此时液体分成上清液和下浊液，用20毫升的移液管移取上清液，加入到250毫升 的容量瓶中，用80％乙二醇定容至250毫升；

4)步骤4转入250毫升圆底烧瓶中，在摇床上摇匀60分钟，用721型分光光度计测定在 波长425nm时的吸光值OD₄₂₅，用下式计算β-胡萝卜素含量 β-胡萝卜素含量(mg/L)＝(最后定容体积×9.84×OD₄₂₅)÷(2.91×藻液取样体积) 最后算出的β-胡萝卜素含量单位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β-胡萝卜素毫克数。 叶绿素a含量的测定方法

5)步骤5将盐生杜氏藻培养至第9天时，藻细胞密度可达到150×10⁴-300×10⁴cell/ 每毫升，用量筒取藻液200毫升藻液，倒入500毫升的三角烧瓶中；

6)步骤6加入20克硫酸亚铁，加入240毫升85％的丁酮(由丁酮和蒸馏水按85∶15体积 比混合而成)，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧，放在摇床上摇匀25分钟，充分萃取；

7)步骤7此时液体分成明显的上下两层，上层清亮，下层浑浊，用移液管取上清液至500 毫升的容量瓶中，用85％丁酮定容至500毫升，转入1000毫升烧杯中，保鲜膜封口，橡皮筋 扎紧，置于摇床上摇匀15分钟；

8)步骤8用分光光度计分别测定波长624nm和725nm时的吸光值OD₆₂₄、OD₇₂₅，用下式计算 叶绿素a含量

叶绿素a含量(mg/L)＝[(19.62×OD₆₂₄+4.83×OD₇₂₅)÷藻液取样体积]×最后定容体积 最后算出的叶绿素a含量单位是mg/L，即每升藻液中含有的叶绿素a毫克数；

9)步骤2、3所用NaCl、乙二醇和步骤6、7所用硫酸亚铁、丁酮等化学药品纯度均需分析 纯级别而非化学纯或试剂纯；

10)步骤2、6所用蒸馏水如果用三蒸水代替更好；

11)步骤1至7中所用三角烧瓶、烧杯、圆底烧瓶、容量瓶和移液管等玻璃仪器均需洗刷干 净，后用蒸馏水润洗3遍，最后在50℃烘箱中烘干使用。

即一种盐生杜氏藻中β-胡萝卜素和叶绿素a含量测定方法，方法如下：

β-胡萝卜素含量的测定方法

步骤1将盐生杜氏藻培养至第13天时，藻细胞密度可达到250×10⁴-400×10⁴cell/每毫升， 用移液管移取藻液100毫升，装入250毫升的三角烧瓶中；

步骤2加入15克NaCl，加入80％乙二醇(由乙二醇和蒸馏水按80∶20体积比混合而成)120 毫升，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧，放在摇床上摇匀20分钟，充分萃取；

步骤3此时液体分成上清液和下浊液，用20毫升的移液管移取上清液，加入到250毫升的 容量瓶中，用80％乙二醇定容至250毫升；

步骤4转入250毫升圆底烧瓶中，在摇床上摇匀60分钟，用721型分光光度计测定在波长 425nm时的吸光值OD₄₂₅，用下式计算β-胡萝卜素含量

β-胡萝卜素含量(mg/L)＝(最后定容体积×9.84×OD₄₂₅)÷(2.91×藻液取样体积)

最后算出的β-胡萝卜素含量单位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β-胡萝卜素毫克数。 叶绿素a含量的测定方法

步骤5将盐生杜氏藻培养至第9天时，藻细胞密度可达到150×10⁴-300×10⁴cell/每毫升， 用量筒取藻液200毫升藻液，倒入500毫升的三角烧瓶中；

步骤6加入20克硫酸亚铁，加入240毫升85％的丁酮(由丁酮和蒸馏水按85∶15体积比混 合而成)，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧，放在摇床上摇匀25分钟，充分萃取；

步骤7此时液体分成明显的上下两层，上层清亮，下层浑浊，用移液管取上清液至500毫 升的容量瓶中，用85％丁酮定容至500毫升，转入1000毫升烧杯中，保鲜膜封口，橡皮筋扎 紧，置于摇床上摇匀15分钟；

步骤8用分光光度计分别测定波长624nm和725nm时的吸光值OD₆₂₄、OD₇₂₅，用下式计算叶绿 素a含量

叶绿素a含量(mg/L)＝[(19.62×OD₆₂₄+4.83×OD₇₂₅)÷藻液取样体积]×最后定容体积 最后算出的叶绿素a含量单位是mg/L，即每升藻液中含有的叶绿素a毫克数。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前 述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改 或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。