一种利用叶绿素荧光参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间的方法

摘要

本发明公开了一种利用叶绿素荧光参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间的方法，其步骤：1）产油微藻常规培养及胁迫诱导：进行产油微藻的的常规自养培养；将微藻培养至对数生长中期，进行胁迫条件诱导中性脂积累；2）叶绿素荧光参数Fv/Fm检测：诱导产油过程中取样，测定Fv/Fm；3）中性脂含量检测：氯仿/甲醇萃取提取藻油，薄层层析色谱法结合图像分析软件测定中性脂含量；4）采收时间的确定：细胞内中性脂开始显著积累1-2天后，进行微藻的采收，如测定的Fv/Fm和中性脂含量显著性相关，中性脂开始显著积累后1-2天的Fv/Fm范围为Fv/Fm采收范围，相同胁迫条件诱导中性脂生产时藻液Fv/Fm达到采收范围时即为采收时间。叶绿素荧光参数Fv/Fm检测操作简单、快速，干扰因素少，准确稳定。

说明书

技术领域

本发明属于微藻生物和生物能源技术领域，更具体涉及一种利用叶绿素荧光参数 Fv/Fm确定产油微藻收获时间的方法，它适用于微藻生物能源生产方面。

背景技术

微藻是原核或者真核的单细胞光合微生物，是非常高效的太阳能转换器，分布于淡 水或者咸水中，通过吸收水环境传递的光能、水和CO₂积累生物量，可以将光能转化为 化学能，以油脂或淀粉的等有机物的形式储存在细胞内。作为最古老的低等光合生物， 某些微藻可直接利用太阳光、CO₂及含N、P等简单营养物质快速生长并在细胞内合成 大量油脂(主要是中性脂甘油三酯)，从而为生物柴油生产提供新的油脂资源。

有很多营养和环境因素控制着细胞生长和油脂含量，如：有机和无机碳源，氮源， 其他必需的大量、微量元素(镁，铜)，温度，pH水平，盐度，搅拌速度(溶解氧浓度) 等。研究发现许多微藻藻种可以通过条件诱导积累大量的油脂，平均含油量从20％到70％ 不等，一些藻种的含油量在特定条件下可能达到90％。营养胁迫特别是缺氮胁迫是最常 使用的提高藻类油脂积累的一种高效的条件诱导方式。一般认为，缺少足够的氮的基质 来培养微藻细胞生长合成蛋白质时，光合作用产生的多余的碳就会转化为储能分子，如 甘油三脂或者淀粉。据Converti et al.(Converti,et al.,2009,Chemical Engineering and  Processing:Process Intensification,48:1146-1151)报道，培养基中的NaNO₃浓度从1.5g/L 降到0.375g/L的过程中，油脂含量升高了两倍(从5.9％到15.3％)。然而，这种方式虽 然很大程度上促进了微藻中油脂的积累，提高了微藻细胞中油脂的含量，但同时会造成 微藻光合作用效率的下降，抑制生物量的积累甚至造成细胞的死亡，高含油量通常以低 生物量生产力为代价，不利于提高油脂的生产率。一些研究者(Csavina et al.,2011,Journal  of applied microbiology,111:312-318；Jiang et al.,2011,Applied Energy,88:3336-3341)利用 两级培养法，细胞首先在营养充足的情况下生长以积累生物量，培养高浓度的藻生物量， 然后通过营养胁迫诱导油脂积累，优化微藻油脂的生产。

然而，胁迫条件诱导微藻应用于油脂的生产还存在许多问题需要解决。快速简便地 评估胁迫诱导过程中微藻细胞内油脂特别是中性脂积累水平，从而快速确定微藻的采收 时间是其中一个需要解决的重要问题。为了评估细胞内油脂或中性脂的积累水平从而确 定微藻的采收时间，传统的重量法(Bligh and Dyer,1959,Canadian Journal of Biochemistry  and Physiology,37:911-917)涉及细胞破碎和油脂提取，花费时间较长，且需要至少湿重 10-15mg的细胞。薄层层析色谱分析(Reiser and Somerville,1997,Journal of Bacteriology, 179:2969–2975)和气质联用质谱分析(Gouveia et al.,2009,Journal of Industrial  Microbiology&Biotechnology,36:821-826)可以检测藻类不同脂肪酸成分，时域核磁共振 系统(Todt et al.,2006,Food Chemistry,96:436-440)可以方便的量化油脂，但上述方法同样 需要在分析前细胞破碎进行油脂提取，花费时间和试剂成本较高。为了免除细胞破碎过 程，无创分析藻体细胞中的油脂，人们用BODIPY505/515或者尼罗红等中性脂荧光探针 (Chen et al.,2009,Journal of Microbiological Methods,77:41-47；Cooper et al.,2010,Journal  of Bioscience and Bioengineering,109:198-201)进行活体染色来检测细胞内中性脂水平， 但由于微藻的多样性，荧光探针对不同微藻细胞的渗透性有较大差异，并且不能染微藻 死细胞，其准确性会受许多因素干扰。拉曼光谱学也是一种令人关注的评估微藻细胞油 脂水平的方法(Heraud et al.,2007,Fems Microbiology Letters,275:24-30)，但光合生物的拉 曼光谱与色素强烈的自发荧光并发干扰了拉曼光谱的特性，限制了其应用。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种利用叶绿素荧光 参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间的方法，通过分析产油微藻胁迫诱导条件下叶绿素荧 光参数Fv/Fm和胞内中性脂的相关性，根据相关性分析结果确定胞内中性脂含量达采收 水平时的Fv/Fm范围，在此后胁迫诱导该产油微藻进行中性脂的生产过程中，定期快速 检测Fv/Fm变化即可确定采收时间进行产油微藻采收。该方法简单易行，只需前期分析 确定Fv/Fm和胞内中性脂的相关性，在此后的中性脂的生产过程中只需要检测Fv/Fm变 化即可确定采收时间。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种利用叶绿素荧光参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间的方法，其步骤是：

1)产油微藻常规培养及胁迫诱导：进行产油微藻的的常规自养培养；将微藻培养至 对数生长中期或后期时，进行胁迫条件处理诱导中性脂积累；

所述的产油微藻为小球藻、衣藻、杜氏藻、微绿球藻、眼点拟微绿球藻、葡萄藻、 栅藻、菱形藻和三角褐指藻其中的任何一种，尤其适用于小球藻；

所述的常规自养培养条件为根据使用产油微藻种类选择自养液体培养基，在温度 20-25℃,光强40-100μmol m^-2s^-1,连续光照条件下通气培养；所述的自养液体培养基为 BG11培养基、TAP培养基、Dunaliella培养基、F/2培养基和Chu10培养基；

所述的胁迫条件为营养胁迫条件中的缺氮胁迫条件；

2)叶绿素荧光参数Fv/Fm检测：胁迫条件诱导产油过程中每22－26小时取样两份， 其中一份调节OD₇₀₀为1.5-2.0，体积为2－4mL，测定叶绿素荧光参数Fv/Fm；

所述的叶绿素荧光参数是一组用于描述植物光合作用机理和光合生理状况的变量或 常数值，反映了植物“内在性”的特点，被视为是研究植物光合作用与环境关系的内在探 针。现常用于分析叶绿素荧光参数的技术称叶绿素荧光动力学技术，其在测定叶片光合 作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，该技术被 称为研究植物光合功能的快速、无损伤探针，已逐渐在环境胁迫对植物光合作用影响研 究方面得到应用。叶绿素荧光技术通常有调制和非调制两种。调制叶绿素荧光测定技术， 是利用具有一定的调制频率和强度的光源诱导，通过饱和脉冲分析方法，使叶绿素荧光 发射快速地处于某些特定状态，以进行相应荧光检测的技术。即其激发荧光的测量光具 有一定的调制(开/关)频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，因此调制荧光仪允许 测量所有生理状态下的荧光；打开一个持续时间很短(一般小于1s)的强光关闭所有的 电子门(光合作用被暂时抑制)，从而使叶绿素荧光达到最大。该技术方便野外观测之用。

3)中性脂含量检测：另一份藻样体积为1－2mL，12000g离心收集沉淀，氯仿/甲 醇萃取的方法(Zhang et al.,2013,PLoS ONE 8(7):e69225)提取藻油，薄层层析色谱法 (Zhang et al.,2013,PLoS ONE 8(7):e69225)结合图像分析软件ImageJ(ver1.41,NIH)技术 测定中性脂含量；

4)产油微藻采收时间的确定：当细胞内中性脂开始显著积累1-2天后，出于时间成 本的考虑，可进行微藻的采收，根据测定的Fv/Fm和中性脂含量使用数据统计分析软件 SPSS 13进行相关性分析。如二者存在显著性相关，中性脂开始显著积累后1-2天的Fv/Fm 范围即为Fv/Fm采收范围。此后进行相同胁迫条件诱导中性脂生产时，藻液Fv/Fm达到 Fv/Fm采收范围时即为微藻的采收时间。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

1)本发明中叶绿素荧光参数Fv/Fm检测操作简单、快速，干扰因素少，准确稳定。

2)本发明在中性脂的诱导生产过程中检测Fv/Fm过程免于细胞破碎和油脂提取步骤， 且检测过程中不添加任何试剂，降低了时间和试剂成本。

3)本发明在中性脂的诱导生产过程中检测Fv/Fm对细胞无损，检测过程需要细胞生 物量较少，且检测后细胞可继续进行中性脂诱导生产，几乎无损耗。

附图说明

图1为实施例1中叶绿素荧光参数Fv/Fm随缺氮胁迫时间的变化曲线。

图2为实施例1中薄层层析分析和中性脂含量随缺氮胁迫时间的变化曲线。

A、薄层层析，M：标准品；B、中性脂含量。

图3为实施例2中叶绿素荧光参数Fv/Fm随缺氮胁迫时间的变化曲线。

图4为实施例2中薄层层析分析和中性脂含量随缺氮胁迫时间的变化曲线。

A、薄层层析，M：标准品；B、中性脂含量。

图5为实施例3步骤2中叶绿素荧光参数Fv/Fm随缺氮胁迫时间的变化曲线。

图6为实施例3步骤3中性脂含量随缺氮胁迫时间的变化曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

该方法适合微藻中的产油微藻，尤其适用于油脂生产量高的小球藻。该方法适合营养 胁迫诱导中性脂积累的生产过程，尤其适用于缺氮胁迫诱导过程。由于产油微藻种类很 多，无法列出所有微藻种类的适用于该方法的具体实施步骤，故以产油微藻小球藻和缺 氮胁迫为例，说明该方法的具体实施步骤，但不构成对本发明的限制。

实施例1：

一种利用叶绿素荧光参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间的方法，以产油小球藻 Chlorella sp.C2(Chen et al.,2014,Plant&Cell Physiology,55:634-644)500mL培养规模为 例，其步骤是：

1、产油微藻(小球藻)自养培养和缺氮胁迫处理：将无菌的BG11液体培养基加 入1L无菌三角烧瓶中，培养基体积为500mL。再将实验室保存，进行液体活化的纯化 小球藻Chlorella sp.C2接种于BG11液体培养基中，接种密度为OD₇₀₀＝0.05，最后同时 在温度为25℃，光照强度为70μmol m^-2s^-1条件下连续光照通气培养；

以700nm为扫描波长，建立OD值与生物量之间的标准曲线，通过对液体培养基 OD值测量，从而计算液体培养基中生物量的浓度，在实际培养过程中可以利用分光光度 计实时测量液体培养基的OD值，确定微藻的生长时期。当自养培养的藻液的OD₇₀₀达 到1.5时，在室温(20－25℃，以下相同)和离心速度为3000g条件下离心3分钟后收 集小球藻，然后将小球藻用无NaNO₃的无菌BG11缺氮液体培养基洗涤三次后置于500 mL无菌BG11缺氮液体培养基中，继续在温度为25℃，光照强度为70μmol m^-2s^-1条件 下连续光照通气培养；

所述的产油微藻为小球藻、衣藻、杜氏藻、微绿球藻、眼点拟微绿球藻、葡萄藻、 栅藻、菱形藻和三角褐指藻其中的任何一种，尤其适用于小球藻；

2、叶绿素荧光参数Fv/Fm检测：缺氮胁迫培养过程中每24小时取样两份，其中一 份调节OD₇₀₀为1.5，体积为3mL，使用Dual-PAM-100(Walz,Germany)测定叶绿素荧光 参数Fv/Fm；

3、中性脂含量检测：另一份藻样取1mL，12000g离心收集沉淀，氯仿/甲醇萃取的 方法提取藻油，使用薄层层析色谱法分析中性脂积累水平，以10mg/mL三油酸甘油酯 (Sigma)为参照标准品，结合图像分析软件ImageJ(ver1.41,NIH)计算样品中性脂含量与标 准品的比例，计算中性脂含量；

4、产油微藻采收时间的确定：图1为小球藻Chlorella sp.C2叶绿素荧光参数Fv/Fm 随缺氮胁迫时间的变化曲线，发现Fv/Fm随着缺氮胁迫时间的延长逐渐下降。图2为小 球藻Chlorella sp.C2中性脂的薄层层析分析和中性脂含量随缺氮胁迫时间的变化曲线， 发现当缺氮胁迫2天后开始积累中性脂，6天时中性脂开始显著积累。在缺氮胁迫7-8天 时进行微藻的采收，此时Fv/Fm范围为0.588-0.649(图1)，中性脂含量为0.027-0.033g/L (图2)。使用数据分析软件SPSS 13对测定的Fv/Fm和中性脂含量进行相关性分析， 分析结果显示二者存在显著相关(y＝-7.484x+6.094，x为Fv/Fm，y为中性脂含量， R＝-0.972，p<0.01)，Fv/Fm采收范围即为0.588-0.649。此后进行缺氮胁迫条件诱导 Chlorella sp.C2中性脂生产时，藻液Fv/Fm达到0.588-0.649时即可进行微藻的采收。

实施例2：

一种利用叶绿素荧光参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间的方法，以产油小球藻 Chlorella sorokiniana C3(Zhang et al.,2013,PLoS ONE 8(7):e69225)1L培养规模为例，其 步骤是：

1、衣藻、杜氏藻、微绿球藻、眼点拟微绿球藻、葡萄藻、栅藻、菱形藻和三角褐指 藻其中的任何一种自养培养和缺氮胁迫处理：将无菌的BG11液体培养基加入2L无菌三 角烧瓶中，培养基体积为1L。再将实验室保存，进行液体活化的纯化衣藻、杜氏藻、微 绿球藻、眼点拟微绿球藻、葡萄藻、栅藻、菱形藻和三角褐指藻其中的任何一种接种于 BG11液体培养基中，接种密度为OD₇₀₀＝0.05，最后同时在温度为25℃，光照强度为70 μmol m^-2s^-1条件下连续光照通气培养；

以700nm为扫描波长，建立OD值与生物量之间的标准曲线，通过对液体培养基 OD值测量，从而计算液体培养基中生物量的浓度，在实际培养过程中可以利用分光光度 计实时测量液体培养基的OD值，确定微藻的生长时期。当自养培养的藻液的OD₇₀₀达 到1.5时，在室温和离心速度为3000g条件下离心3分钟后收集小球藻，然后将小球藻 用无NaNO₃的无菌BG11缺氮液体培养基洗涤三次后置于1L无菌BG11缺氮液体培养 基中，继续在温度为25℃，光照强度为70μmol m^-2s^-1条件下连续光照通气培养；

2、叶绿素荧光参数Fv/Fm检测：缺氮胁迫培养过程中每24小时取样两份，其中一 份调节OD₇₀₀为1.5，体积为3mL，使用Dual-PAM-100(Walz,Germany)测定叶绿素荧光 参数Fv/Fm；

3、中性脂含量检测：另一份藻样取1mL，12000g离心收集沉淀，氯仿/甲醇萃取的 方法提取藻油，使用薄层层析色谱法分析中性脂积累水平，以10mg/mL三油酸甘油酯 (Sigma)为参照标准品，结合图像分析软件ImageJ(ver1.41,NIH)计算样品中性脂含量与标 准品的比例，计算中性脂含量；

4、产油微藻采收时间的确定：图3为小球藻Chlorella sorokiniana C3叶绿素荧光参 数Fv/Fm随缺氮胁迫时间的变化曲线，发现Fv/Fm随着缺氮胁迫时间的延长逐渐下降。 图4为小球藻Chlorella sorokiniana C3中性脂的薄层层析分析和中性脂含量随缺氮胁迫 时间的变化曲线，发现当缺氮培养胁迫2天后开始积累中性脂，6天时中性脂开始显著积 累。在缺氮胁迫7-8天时进行微藻的采收，此时Fv/Fm范围为0.288-0.407(图3)，中 性脂含量为0.025-0.039g/L(图4)。使用数据分析软件SPSS 13对测定的Fv/Fm和中性 脂含量进行相关性分析，分析结果显示二者存在显著相关(y＝-3.565x+2.749，x为 Fv/Fm，y为中性脂含量，R＝-0.923，p<0.01)，Fv/Fm采收范围即为0.288-0.407。此后 进行缺氮胁迫条件诱导Chlorella sorokiniana C3中性脂生产时，藻液Fv/Fm达到 0.288-0.407时即可进行微藻的采收。

实施例3：

为验证该方法及进一步突出该方法的优越性，申请人以产油小球藻Chlorella sp.C2  1L培养规模为例，以实施例1中确定的Fv/Fm采收范围0.588-0.649，利用叶绿素荧光 参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间，同时与以提取油脂后薄层层析分析结合图像分析软 件确定产油微藻收获时间的方法作为对比，一种利用叶绿素荧光参数Fv/Fm确定产油微 藻收获时间的方法，其步骤是：

1、小球藻自养培养和缺氮胁迫处理：将无菌的BG11液体培养基加入2L无菌三角 烧瓶中，培养基体积为1L。再将实验室保存，进行液体活化的纯化小球藻Chlorella sp.C2 接种于BG11液体培养基中，接种密度为OD₇₀₀＝0.05，最后同时在温度为25℃，光照强 度为70μmol m^-2s^-1条件下连续光照通气培养；

以700nm为扫描波长，建立OD值与生物量之间的标准曲线，通过对液体培养基 OD值测量，从而计算液体培养基中生物量的浓度，在实际培养过程中可以利用分光光度 计实时测量液体培养基的OD值，确定微藻的生长时期。当自养培养的藻液的OD₇₀₀达 到1.5时，在室温和离心速度为3000g条件下离心3分钟后收集小球藻，然后将小球藻 用无NaNO₃的无菌BG11缺氮液体培养基洗涤三次后置于1L无菌BG11缺氮液体培养 基中，继续在温度为25℃，光照强度为70μmol m^-2s^-1条件下连续光照通气培养；

2、利用叶绿素荧光参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间：缺氮胁迫培养过程中每24 小时取样，调节OD₇₀₀为1.5，体积为3mL，使用Dual-PAM-100(Walz,Germany)测定叶 绿素荧光参数Fv/Fm，当测定Fv/Fm处于0.588-0.649范围时进行微藻采收；

3、提取油脂后薄层层析分析结合图像分析软件确定产油微藻收获时间：以步骤1中 的方法进行第二份小球藻自养培养和缺氮胁迫处理，缺氮胁迫培养过程中每24小时取样 1mL，12000g离心收集沉淀，氯仿/甲醇萃取的方法提取藻油，使用薄层层析色谱法分 析中性脂积累水平，以10mg/mL三油酸甘油酯(Sigma)为参照标准品，结合图像分析软 件ImageJ(ver1.41,NIH)计算样品中性脂含量与标准品的比例，计算中性脂含量，当中性 脂开始显著积累后第2天进行微藻采收；

4、两种方法的对比：图5为小球藻Chlorella sp.C2叶绿素荧光参数Fv/Fm随缺氮胁 迫时间的变化曲线，缺氮第8天Fv/Fm为0.598，处于采收范围，进行微藻的采收，取1 mL采收微藻，氯仿/甲醇萃取的方法提取藻油，使用薄层层析色谱法分析结合图像分析 软件ImageJ(ver1.41,NIH)计算中性脂含量为0.030g/L，与实施例1中采收藻样中性脂 含量近似。图6为小球藻Chlorella sp.C2中性脂含量随缺氮胁迫时间的变化曲线，发现 缺氮胁迫6天时中性脂开始显著积累，在缺氮胁迫8天时进行微藻的采收，此时中性脂 含量为0.032g/L，与实施例1及本实施例步骤2采收藻样中性脂含量均近似。

综上所述，实施例1和2中两株小球藻在缺氮诱导中性脂积累的过程中，叶绿素荧 光参数Fv/Fm和中性脂含量均显著相关，故在此过程中检测Fv/Fm即可反映细胞内中性 脂含量的积累水平；实施例3中利用两种方法均可确定产油微藻的收获时间，从而表明 在缺氮诱导产油小球藻中性脂积累的生产过程中只需要检测Fv/Fm变化即可确定微藻的 采收时间。Fv/Fm的检测过程操作简单，1分钟内即可完成，耗时短，同时避免了细胞破 碎、油脂提取和中性脂定量方法中繁琐的操作及大量有机试剂的使用。由此可见，利用 叶绿素荧光参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间的方法，避免了细胞破碎和油脂提取步骤， 检测过程中不额外添加任何试剂，检测后细胞可继续进行中性脂诱导生产，几乎无损耗， 有利于生产成本的控制，且叶绿素荧光参数Fv/Fm检测操作简单、快速，干扰因素少， 准确稳定，应用范围较广，具有较好的应用前景。