用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒

摘要

本发明属于医药及生物工程领域，涉及一种可用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒，该重组慢病毒载体由慢病毒载体lentiCRISPR用BsmBI酶切后，连入带BsmBI粘性末端的CXCR4特异靶序列重组而得，获得的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体能够在艾滋病毒辅助受体CXCR4的4个不同位点突变基因序列，且突变率高，达25%-75%。经过重组慢病毒载体改造后的细胞不能被HIV感染。该方法较RNAi-Knockdown、ZFN和TALEN技术具有更高的抑制艾滋病毒复制的效率，该系统构建快速、简单、廉价且能阻止HIV病毒入侵，适合用于艾滋病基因治疗。

说明书

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，更具体地涉及可用于艾滋病基因治疗的 CRISPR/Cas9重组慢病毒载体系统的构建及应用。

背景技术

由艾滋病毒(HIV)感染引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是全世界 面临的主要健康威胁之一。据2013年11月11日发布的我国卫生部、联合国艾 滋规划署和世界卫生组织联合对我国艾滋病的评估显示：截至2013年08月31 日，中国现存的艾滋病病毒感染者和病人约428,867例，死亡127758例。艾滋 病疫情严峻，而目前仍然没用有效的疫苗。尽管目前治疗艾滋病的药物(如“鸡 尾酒”疗法HAART)能有效地延长患者生存时间，但因长期用药引起的抗药性 及严重的副反应使得该疗法难以继续进行。因此，艾滋病新的治疗方法亟待研 发。

研究表明艾滋病基因治疗是取代药物治疗的可行方式，患者无需依赖于长 期的药物治疗。基于慢病毒载体的艾滋病基因治疗研究，国际上已有方案进入 了临床Ⅰ/Ⅱ期阶段，其中一命名为“OZ1”的艾滋病基因治疗试验在临床Ⅱ期 取得了较大成功(Mitsuyasu,Merigan et al.2009)；2014年，美国宾夕法尼亚大学 佩雷尔曼医学院经过5年的临床实验，将12位HIV患者的造血干细胞中CCR5 基因分别敲除后再进行自体造血干细胞移植，大部分患者检测不到HIV病毒 (Tebas,Stein et al.2014)；已有研究发现利用ZFN技术对CXCR4进行永久敲除 后的CD4+T细胞可以建立稳定的HIV-1抗性且在外周血单核细胞移植后的 NSG小鼠内实现更低的病毒滴度(Yuan,Wang et al.2012)。因此，基因治疗代表 了一种新的、具有潜力的、长期有效的疾病控制方式，而近期基于CRISPR/Cas9 基因治疗技术又为艾滋病治疗开辟了新的途径。

1987年，日本大阪大学(Osaka University)研究人员在对一种细菌编码的 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)基因进行研究时，发现在这个基因编码区域 的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成， 而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列，正是这个特有的序列以后 被证明发挥了DNA的定向识别功能。CRISPR：(clustered regularly interspaced  short palindromic repeats)是一个特殊的DNA重复序列家族，CRISPR位点通常 由短的高度保守的重复序列(repeats)组成，重复序列长度通常21～48bp,重复 序列之间被26～72bp间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列 (space)与靶基因进行识别。这些间隔重复序列首先转录成一个长的RNA前体， 继而在重复序列中剪接加工成小的crRNA，crRNA特异性地识别靶位点。Cas (CRISPR associated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶。它 与folk核酸内切酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体就能发挥作用。Cas 在crRNA的指导下在特定的位点切割双链DNA。此过程还需要一个小的RNA  tracrRNA(trans-activating crRNA)和RNAse III。CRISPR-Cas是很多细菌和大 部分古生菌的获得性免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性识别，利 用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫保护(Wiedenheft,Sternberg et al. 2012)。

CRISPR/Cas9基本机制为：CRISPR序列首先转录并进一步被酶切加工成 crRNA，crRNA指导Cas蛋白在靶位点进行切割。Cas9蛋白作为一个RNA指导 的核酸内切酶，其运用双指导RNA包括crRNA和tracrRNA对靶位点进行识别 和切割。Cas9具有两个不同的酶切活性位点分别切割双链DNA的一条链。Cas9 –RNA首先结合PAM序列(5’-NGG-3’)进而搜索与sgRNA互补的靶位点。 与PAM位点结合后导致靶位点的双链DNA变得不稳定继而解链，sgRNA就与 互补链形成RNA–DNA杂合双链。正确地与靶位点结合后Cas9蛋白双酶切活 性被激活从而在靶位点处引起双链断裂(double-stranded breaks DSB)，断裂的双 链DNA通过非同源末端直接连接(nonhomologous end joining，NHEJ)或者同 源重组(homology-directed repair，HDR)进行修复。修复后的DNA由于碱基 的随机插入或删除引起移码突变从而抑制基因的表达，这就实现了在DNA水平 上对基因进行定向敲除(Cong,Ran et al.2013)。

RNA指导的Cas9基因工程技术已在动物、植物以及微生物中得到广泛应用 (Hsu,Lander et al.2014)。在艾滋病防治方面已有利用CRISPR/Cas9系统对艾滋 病毒的另一辅助受体CCR5进行基因修饰(Cradick,Fine et al.2013,Ye,Wang et al. 2014)，尽管对CD4⁺T细胞或者CD34⁺干细胞的CCR5基因进行修饰后可以在 一定程度上阻止HIV-1病毒入侵，然而由于CCR5和CCR2高度同源性，使得 针对CCR5基因设计的CRISPR/Cas9系统的脱靶率很高，且在病毒感染的急性 期HIV-1病毒主要利用CCR5为辅助受体，一旦建立稳定感染HIV-1病毒转而 利用CXCR4为辅助受体，因此在艾滋病患者体内通常(高达50％)存在既可以 利用CCR5也可以利用CXCR4为辅助受体的双嗜型病毒，因此仅仅局限于敲除 CCR5基因对艾滋病的彻底清除和防治有一定的限制。

参考文献：

1、Cong,L.,F.A.Ran,D.Cox,S.Lin,R.Barretto,N.Habib,P.D.Hsu,X.Wu,W.Jiang,L.A. Marraffini and F.Zhang(2013)."Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems." Science339(6121):819-823.

2、Cradick,T.J.,E.J.Fine,C.J.Antico and G.Bao(2013)."CRISPR/Cas9 systems targeting  beta-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity."Nucleic Acids Res 41(20): 9584-9592.

3、Hsu,P.D.,E.S.Lander and F.Zhang(2014)."Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering."Cell157(6):1262-1278.

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5、Mitsuyasu,R.T.,T.C.Merigan,A.Carr,J.A.Zack,M.A.Winters,C.Workman,M.Bloch,J. Lalezari,S.Becker,L.Thornton,B.Akil,H.Khanlou,R.Finlayson,R.McFarlane,D.E.Smith,R. Garsia,D.Ma,M.Law,J.M.Murray,C.von Kalle,J.A.Ely,S.M.Patino,A.E.Knop,P.Wong,A. V.Todd,M.Haughton,C.Fuery,J.L.Macpherson,G.P.Symonds,L.A.Evans,S.M.Pond and D. A.Cooper(2009)."Phase 2 gene therapy trial of an anti-HIV ribozyme in autologous CD34+cells." Nat Med15(3):285-292.

6、Morner,A.,A.Bjorndal,J.Albert,V.N.Kewalramani,D.R.Littman,R.Inoue,R.Thorstensson, E.M.Fenyo and E.Bjorling(1999)."Primary human immunodeficiency virus type 2(HIV-2) isolates,like HIV-1 isolates,frequently use CCR5 but show promiscuity in coreceptor usage."J  Virol73(3):2343-2349.

7、Tebas,P.,D.Stein,W.W.Tang,I.Frank,S.Q.Wang,G.Lee,S.K.Spratt,R.T.Surosky,M.A. Giedlin,G.Nichol,M.C.Holmes,P.D.Gregory,D.G.Ando,M.Kalos,R.G.Collman,G. Binder-Scholl,G.Plesa,W.T.Hwang,B.L.Levine and C.H.June(2014)."Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV."N Engl J Med370(10):901-910.

8、Wiedenheft,B.,S.H.Sternberg and J.A.Doudna(2012)."RNA-guided genetic silencing  systems in bacteria and archaea."Nature482(7385):331-338.

9、Ye,L.,J.Wang,A.I.Beyer,F.Teque,T.J.Cradick,Z.Qi,J.C.Chang,G.Bao,M.O.Muench,J. Yu,J.A.Levy and Y.W.Kan(2014)."Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem  cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection."Proc Natl Acad Sci  USA.

10、Yuan,J.,J.Wang,K.Crain,C.Fearns,K.A.Kim,K.L.Hua,P.D.Gregory,M.C.Holmes and  B.E.Torbett(2012)."Zinc-finger nuclease editing of human cxcr4 promotes HIV-1 CD4(+)T cell  resistance and enrichment."Mol Ther20(4):849-859.

发明内容

为了实现对双嗜型以及CXCR4单嗜型HIV-1病毒的抗性，抑制传播性感染， 我们设计出针对艾滋病毒侵入相关的辅助受体CXCR4进行基因修饰的 CRISPR/Cas9系统，阻断其表达，从而抑制病毒入侵，实现细胞内病毒的清除。

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供含有CXCR4基因的特异靶序列的 CRISPR/Cas9重组慢病毒载体；本发明的目的之二在于提供含CRISPR/Cas9重 组慢病毒载体的慢病毒；本发明的目的之三在于提供该CRISPR/Cas9重组慢病 毒载体在制备诱导CXCR4突变试剂中的应用；本发明的目的之四在于提供该 CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备HIV病毒抑制剂中的应用。

1、含有CXCR4的特异靶序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，所述 CRISPR/Cas9重组慢病毒载体由慢病毒载体lentiCRISPR用BsmBI酶切消化去 除1.8Kb的间隔片段后，连入带BsmBI粘性末端的CXCR4特异靶序列重组而 得。

优选的，CXCR4的特异靶序列如SEQ ID NO.1-4任意一项所示。

2、含CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的慢病毒，由辅助质粒psPAX2和 pMD2.G帮助含CXCR4的特异靶序列的重组慢病毒载体lentiCRISPR在细胞中 包装成为慢病毒。

本发明的详细描述：

本发明选择了HIV-1病毒的辅助受体即宿主蛋白CXCR4作为靶标，筛选了 多个人和恒河猴基因保守的靶位点(10个靶位点见表1)，构建了高效率的 CRISPR/Cas9重组慢病毒载体系统。构建方法如下：

1)、选择慢病毒载体lentiCRISPR

本申请选择的慢病毒载体是lentiCRISPR(Feng Zhang，Science，2013)，该 载体含有一个U6启动子用来控制sgRNA的表达，在用BsmBI酶切消化去除 1.8Kb的间隔片段后可以插入含BsmBI粘性末端和20bp sgRNA的片段。BsmBI 位点后有85bp的crRNA序列为sgRNA提供骨架。之后是EFS的启动子位点来 控制人类编码最优的SpCas9的表达。接着是称为P2A的自切割多肽，同时还含 有筛选基因Puromycin的编码序列以便于细胞筛选。

表1、人和恒河猴CXCR4基因的保守靶位点

靶编号 靶序列5’-3’ 1 GAAGAAACTGAGAAGCATGA 2 GAAGCATGACGGACAAGTAC 3 GCCGTGGCAAACTGGTACTT 4 GAAGCTGTTGGCTGAAAAGG 5 GCTGAAAAGGTGGTCTATGT 6 GCTTCTACCCCAATGACTTG 7 GTTCCAGTTTCAGCACATCA 8 CCATCTACTCCATCATCTTC 9 TGTCATCTACACAGTCAACC 10 CTACAGCAGTGTCCTCATCC

2)、敲除CXCR4基因的重组慢病毒载体lentiCRISPR的构建

a、选择10个人与恒河猴的CXCR4基因保守靶位点，化学合成寡核苷酸链， 格式如下：

有义链：5’-G(19N)-NGG3’或者5’-CCN(19N)C-3’

PAM      PAM

反义链：与有义链互补，分别在有义链5’端添加CACC，在反义链5’端添 加AAAC以产生BsmBI的粘性末端。(注：19N表示靶位点的19个碱基序列)

b、有义链、反义链退火，形成带BsmBI粘性末端的片段；

c、将以上片段连接至载体lentiCRISPR(由BsmBI进行酶切)；

d、转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞(Stbl3菌株购自ATCC)；

e、筛选阳性克隆，并测序鉴定。

3)、敲除CXCR4基因的重组慢病毒载体lentiCRISPR的有效性验证。

将所构建的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体转染Ghost CD4/CXCR4细胞(购 买自ATCC)，48小时后收取细胞提取其基因组，PCR扩增CXCR4基因，产物 经T7 Endonuclease I(购买自BioLabs)酶切鉴定。结果表明：所设计的针对CXCR4 基因的5个靶位点都有不同程度的突变。申请人进一步将PCR产物连接至T-easy 载体(购买自Promega)后进行测序鉴定，结果证实CXCR4基因的4个靶位点 具有不同程度的基因插入或缺失，甚至移码突变。具体结果如下所示：

CXCR4基因靶点 基因突变率 靶点1 GAAGAAACTGAGAAGCATGA 75％ 靶点2 GAAGCATGACGGACAAGTAC 0 靶点6 GCTTCTACCCCAATGACTTG 25％ 靶点7 GTTCCAGTTTCAGCACATCA 60％ 靶点10 CCATCTACTCCATCATCTTC 50％

4)、敲除CXCR4基因的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体系统阻止HIV入侵 的有效性验证。

为了进一步提高CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的基因敲除效率，方便以后 改造人和恒河猴造血干细胞，利用CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在HEK-293T 细胞中包装成慢病毒。慢病毒包装载体包括：不同靶点的重组lentiCRISPR载体， psPAX2包装质粒(购自Addgene)，pMD2.G包膜质粒(购自Addgene)。

为了检测CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的基因敲除效率，用6号和7号靶 点的lentiCRISPR载体包装的慢病毒建立了基于Ghost CD4/CXCR4细胞系 (Kimata,Gosink et al.1999,Morner,Bjorndal et al.1999)的CXCR4基因缺失稳定 细胞系：Ghost CD4+/CXCR4-细胞系。然后用PE标记的CXCR4抗体(购自 BioLegend公司)对以上稳定细胞系进行了流式检测以测定CXCR4膜蛋白表达 水平。同时检测了改造后的细胞中HIV的感染水平，结果表明CRISPR/Cas9重 组慢病毒载体改造后的细胞中HIV水平显著降低。

3、所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备诱导CXCR4突变试剂中的应 用。

4、所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备HIV病毒抑制剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种含有CXCR4的特异靶序列的 CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒和应用，该CRISPR/Cas9重组慢病毒 载体能够突变艾滋病毒侵入相关的宿主膜蛋白CXCR4的基因序列，且敲除率高 达25％-75％，因此，能用于将来的艾滋病基因治疗，避免或延缓病毒的入侵， 并抑制病毒的感染传播。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附 图：

图1为含有CXCR4的特异靶序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体系统的 构建流程图。

图2为Ghost CD4/CXCR4细胞转染含有CXCR4的特异靶序列的 CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，48小时后收集细胞提取其基因组，PCR扩增 CXCR4基因，产物经T7 Endonuclease I酶切电泳检测结果图；

M为分子量标记，以Con为对照，1-10为所选择的CXCR4的靶点。PCR 产物全长为783bp，T7 Endonuclease I酶在不完全匹配的双链DNA处切割产生 了大小不一的小DNA片段，例如靶点1就产生了613bp和170bp的小片段。

图3为针对CXCR4基因所设计的1、2、6、7、10靶点的PCR产物T克隆 测序结果图；

括号中“，”前面的-和+分别代表突变的位置在PAM位点的上下游，数字 表示具体的位置；括号中“，”后面的-和+表示碱基缺失或插入，数字代表缺失 或插入的碱基数，分数代表野生型或突变型的比例)。举例：靶点1#sgRNA能 够介导Cas9在1#PAM区上游第4个碱基前切割CXCR4基因，同时插入一个 碱基(A)引起移码突变，即(-4，+1)；1#sgRNA也能够介导Cas9在1#PAM 区前面切割CXCR4基因，缺失3个碱基，即(0，-3)；1#sgRNA还能够介导 Cas9在1#PAM区下游第23位碱基前切割CXCR4基因，缺失18个碱基，即(+23， -18)。2#sgRNA介导Cas9切割效率较低，测序分析全为野生型CXCR4基因。 6#sgRNA能够介导Cas9在6#PAM区上游第6个碱基前切割CXCR4基因，缺 失110个碱基，即(-6，-110)。7#sgRNA能够介导Cas9在7#PAM区上游第8、 11和18位进行突变，即(-8/-11/-18,mut)；7#sgRNA也能够介导Cas9在7#PAM 区下游第1位和上游第15位前面分别进行切割，并分别缺失15个和3个碱基， 即(+1/-15/,-15/-3)；7#sgRNA能够介导Cas9在7#PAM区上游第3个碱基前 切割CXCR4基因，通过非同源末端连接的方式插入一个碱基(A)，即(-3，+1)。 10#sgRNA能够介导Cas9在10#PAM区上游第17个碱基前切割CXCR4基因， 同时插入一个碱基(T或者A)，即(-17，+1)；10#sgRNA也能够介导Cas9在 10#PAM区上游第20个碱基突变，即(-20，mut)；10#sgRNA还能够介导Cas9 在10#PAM区上游第17个碱基前切割CXCR4基因，缺失261个碱基，即(-17， -261)。

图4为含有CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的慢病毒改造Ghost CD4/CXCR4 细胞后用流式细胞仪检测改造效果图；Con为对照。

图5为免疫印迹实验检测Ghost CD4+/CXCR4^-稳定细胞系的CXCR4膜蛋白 表达图；Con为对照。

图6为流式细胞仪检测Ghost CD4+/CXCR4^-稳定细胞系中PE-CXCR4阴性 细胞率结果图。

图7为用HIV NL4-3病毒感染Ghost CD4/CXCR4细胞和改造成功的Ghost  CD4+/CXCR4-细胞系，3天后流式细胞仪检测GFP阳性细胞结果图；

GFP代表HIV在细胞中的表达水平，(1)是阴性对照，(2)是未改造Ghost  CD4/CXCR4细胞作为阳性对照，(3)和(4)分别是6号和7号靶点改造成功 的Ghost CD4+/CXCR4-细胞系。

图8为用HIV NL4-3病毒感染Ghost CD4/CXCR4细胞和改造成功的Ghost  CD4+/CXCR4-细胞系1天、2天、3天、4天、5天，分别取样，用ELISA法检 测病毒P24的表达结果图；Con为对照。

图9为用HIV NL4-3病毒感染Ghost CD4/CXCR4细胞和改造成功的Ghost CD4+/CXCR4-细胞系1天、2天、3天、4天，收取细胞提取基因组定量检测gag 基因的表达结果图；Con为对照。

具体实施方式

本发明的技术方案可以通过以下实施例加以说明，但不能以此限制本发明。 具体实施例如下：

【实施例1】构建含有CXCR4的特异靶序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体

1、靶向HIV辅助受体CXCR4基因的靶点序列保守性分析

为了明确申请人所选择的CXCR4靶点序列在人和猴中的保守性，申请人应 用National Center For Biotechnology Information Database中的BLAST软件对人 和恒河猴CXCR4基因的序列保守性进行了分析。在保守的外显子区域选择符合 CRISPR-Cas9结合基因组的特征[5’-G(19N)-NGG3’或者5’-CCN(19N)C-3’]靶序 列。我们设计了10个靶位点(表1)，所有靶点序列在人和猴中完全一致(100％)。

2、重组lenti-CRISPR构建和基因编辑效果鉴定

被改造的慢病毒载体是pLentiCRISPR(Addgene plasmid ID:52961)，该载体 含有一个U6启动子用来控制sgRNA的表达，同时还含有一个EFs启动子用来 控制hCas9的表达。

a、化学合成寡核苷酸链，根据CRISPR-Cas9识别靶位点的原理，设计如下 靶序列合成引物，格式如下(源于Addgene数据库)：

有义链：5’-G(19N)-NGG3’或者5’-CCN(19N)C-3’

PAM      PAM

反义链：与有义链互补；

分别在有义链5’端添加CACC，在反义链5’端添加AAAC以产生BsmBI 的粘性末端，注：19N表示靶位点的19个碱基序列。

b、有义链、反义链退火，形成带BsmBI粘性末端的片段；

退火体系：

退火程序：95℃ 5min，90℃ 5min，85℃ 5min，80℃ 5min，72℃ 10min，65 ℃ 5min，60℃ 5min，55℃ 5min，50℃ 5min，45℃ 5min，40℃ 5min，35℃ 5min，30℃ 5min，4℃保存。

c、将以上退火片段连接至由BsmBI进行酶切后的载体lentiCRISPR(参见 图1)；

d、转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞(购自ATCC)；

e、筛选阳性克隆并测序鉴定；

转化12小时后挑单菌落做菌落PCR初步鉴定出阳性克隆，5'端引物为U6 启动子正向引物(hU6-F:5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3')，3'端引物为不同 靶点的反义链。

PCR体系如下：

挑初步鉴定的阳性克隆进一步做测序分析。

f、将所构建的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体转染Ghost CD4/CXCR4细胞 (购买自ATCC)，48小时后收集细胞提取其基因组，PCR扩增CXCR4基因， CXCR4基因的5’引物为：TGGGCTCAGGGGACTATGACTCCATGAAGG；3’ 引物为CAAACTCACACCCTTGCTTGATGATTTCCA。

PCR体系如下：

PCR程序：95℃ 5min，95℃ 30s→56℃ 30s→68℃ 1min共进行30个循 环，最后68℃ 10min，4℃保存。所有循环结束后，暂停反应，在反应体系中 加0.5μl taq酶，72℃ 40min给PCR片段加A尾。

将上述PCR片段使用胶回收试剂盒回收(购买自OMEGA)，回收的10个PCR片 段经T7 Endonuclease I(购买自BioLabs)酶切鉴定。

酶切体系：

55℃反应30min，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

结果表明(参见图2)：针对CXCR4基因的各个靶位点都有不同程度的突变， 其中1、2、6、7、10号靶点具有一定的效果，6、7号效果最为明显，选取这五 个靶点进行T克隆测序。

将PCR产物连接至T-easy载体(购买自Promega)并测序鉴定

T克隆连接体系：

将上述连接产物转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞，筛选阳性克隆并测序鉴定。

结果显示(图3)1、6、7、10号靶点都有碱基的插入或缺失，1号效果最为 明显，综合T7 Endonuclease I酶切实验和T克隆测序选取6、7号靶点做进一步 研究。

【实施例2】CRISPR/Cas9慢病毒系统的包装

为了进一步提高CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的基因敲除效率，利用 CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在HEK-293T细胞中包装成慢病毒。

慢病毒包装载体为：

不同靶点的lentiCRISPR载体

psPAX2慢病毒辅助包装质粒(购自Addgene)

pMD2.G慢病毒辅助包膜质粒(购自Addgene)

具体过程如下：

1)转染前24小时铺HEK-293T细胞(购自CCTCC)于一个直径10cm的细胞 培养皿中。

2)转染时细胞汇合度以80～90％为宜，以标准的Lipofectamine2000转染试剂将 上述质粒共转染细胞，转染后6小时换液。

转染体系：

先将三种不同量的质粒DNA加入500μl Opti-MEM中，再将Lipofectamine2000 加入500μl Opti-MEM中，然后将稀释后的DNA加入到稀释后的转染试剂中，混 匀静止放置5min后，加入到培养皿里，培养6小时后换液。

转染后60小时收集病毒上清(即细胞培养基)过滤分装，-80℃保存。

病毒滴度检测：将病毒上清以10倍梯度稀释，利用病毒计数仪(virocyt^TM 2100)直接进行病毒滴度的测定，如病毒滴度为1.5x10⁷。为了检测活病毒含量， 将病毒稀释150倍后(1.0x10⁴)，感染293T细胞(1.0x10⁴)，即m.o.i.＝1.0,48 小时之后加入puromycin药物(终浓度2μg/ml)检测活细胞比率(没有病毒感 染的细胞因不能表达puromycin抗性基因被药物杀死)，根据活细胞数量计算 出病毒滴度。如活细胞数量为N，则病毒滴度为(N/1.0x10⁴)x1.5x10⁷。

【实施例3】利用CRISPR/Cas9重组慢病毒建立稳定敲除CXCR4基因的细胞系

1)用实施例2中包装的慢病毒以m.o.i.为100(1ml病毒上清加到含4ml DMEM 细胞中)感染Ghost CD4/CXCR4细胞，48小时后流式检测CXCR4阳性细胞比 率，未经改造的Con细胞其PE-CXCR4阳性细胞率为87.1％，而经lentiCRISPR6# 和7#改造的细胞其PE-CXCR4阳性细胞率分别为23.5％和29.5％。相比于对照 分别下调了73.02％和66.1％(图4)。

2)收集一小部分细胞进行Westernblot实验检测CXCR4的表达水平(图5)；

3)将其余的细胞用PE-CXCR4抗体进行流式分选，分选之后检测稳定细胞系的 纯度，结果见图6，传代培养分选的细胞至适宜细胞数量。

【实施例4】CRISPR/Cas9重组慢病毒载体改造的细胞系Ghost CD4⁺/CXCR4- 对HIV-1感染的抑制水平检测

利用NL4-3质粒在HEK-293T细胞中包装成HIV-1型病毒，

1)转染前24小时铺HEK-293T细胞(购自CCTCC)于一个直径10cm的细胞 培养皿中；

2)转染时细胞汇合度以80～90％为宜，先将NL4-3质粒加入500μl Opti-MEM 中，再将PEI转染试剂加入到500μl Opti-MEM中，然后将稀释后的DNA加入到 稀释后的转染试剂中，混匀静止放置5min后将混合物加入到细胞中，培养6小 时后换液。转染后48小时收集病毒上清(即细胞培养基)过滤分装，-80℃ 保存备用。

转染体系：

3)病毒滴度检测：将病毒上清以10倍梯度稀释，利用病毒计数仪进行病毒滴 度的初步测定。用滴度测定的病毒感染Ghost CD4/CXCR4细胞，48小时之后流 式检测GFP阳性细胞比率，并以比率在0.1-10％之间的稀释度进一步精确计算 出病毒滴度。

4)用上述包装的HIV-1病毒以m.o.i.为1感染Ghost CD4/CXCR4细胞和改造 成功的Ghost CD4⁺/CXCR4^-细胞系。利用流式检测GFP阳性实验(图7)以证实 HIV病毒的入侵，3天后流式检测GFP阳性细胞，与con相比，6、7靶点修饰 后的细胞(6#、7#)的感染率大大降低，GFP代表HIV在细胞中的表达水平；HIV-1 病毒感染细胞1天、2天、3天、4天、5天分别取样检测病毒P24的表达量， P24 ELISA实验表明，和con相比，改造后细胞中的病毒P24表达量在3天后显 著降低(图8)；HIV-1病毒感染细胞1天、2天、3天、4天后收取细胞提取基 因组，定量检测GAG基因的表达量，观察HIV-1病毒基因组复制水平，结果表 明和con相比，经过改造的细胞中(6#、7#)GAG基因的相对表达量显著下调 了(图9)。

以上实施例证实该发明方法能够成功地改造细胞，阻止HIV感染。今后可 用于改造胚胎干细胞、造血干细胞等进行艾滋病的临床基因治疗。

序列表

<110>  武汉大学

<120>  用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒

<130> 

<160>  7 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<223>  CXCR4靶点1核苷酸序列

<400>  1

gaagaaactg agaagcatga  20

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<223>  CXCR4靶点6核苷酸序列

<400>  2

gcttctaccc caatgacttg  20

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<223>  CXCR4靶点7核苷酸序列

<400>  3

gttccagttt cagcacatca  20

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<223>  CXCR4靶点10核苷酸序列

<400>  4

ccatctactc catcatcttc  20

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<223>  U6启动子正向引物

<400>  5

gagggcctat ttcccatgat t  21

 

<210>  6

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<223>  CXCR4基因的5’引物

<400>  6

tgggctcagg ggactatgac tccatgaagg  30

 

<210>  7

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<223>  CXCR4基因的3’引物

<400>  7

caaactcaca cccttgcttg atgatttcca  30