抑制黄色色素积累同时积累番茄红素和花青素苷在制备花瓣呈红色芸薹属植物中的应用

摘要

本发明公开了抑制黄色色素积累同时积累番茄红素和花青素苷在制备花瓣呈红色芸薹属植物中的应用，具体为干扰LCYB、LCYE、MYB12和MYB111基因表达同时异位表达TT8基因，还公开了干扰LCYB、LCYE、MYB12和MYB111基因表达同时异位表达TT8基因的制备表达载体和载体的制备方法，通过干扰LCYB、LCYE、MYB12和MYB111基因表达抑制黄色色素类胡萝卜素和黄酮醇，而异位表达TT8基因能够促进红色番茄红素和花青素苷积累，从而使花瓣呈红色，成功制备了花瓣显红色的芸薹属植物，丰富了芸薹属植物的花色。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及抑制黄色色素积累同时积累番茄红素和花青素苷在制备花瓣呈红色芸薹属植物中的应用。

背景技术

油菜是重要的油料作物，栽培历史悠久、经济价值高、用途广泛、适应性强，是我国的第一大油料作物，也是世界性的重要油料作物。物种分类学上，油菜由芸薹属的三个物种构成，分别为甘蓝型油菜(Brassica napus，2n＝38，AACC)、白菜型油菜(Brassica rapa ssp.oleiferasyn.B.campestris，2n＝20,AA)、芥菜型油菜(Brassica juncea，2n＝36，AABB)。甘蓝型油菜油菜是由白菜(Brassica rapa)与甘蓝(Brassica oleracea，2n＝18,CC)通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一种复合种，虽然栽培历史仅有几百年，但由于其生长势强，丰产性高，已占世界及我国油菜种植面积90％的以上。白菜型油菜是芸薹属最早被驯化的物种之一，原产于我国西北地区的大白菜演化而来，世界范围内有广泛的分布面积和悠久的栽培历史。芥菜型油菜是由白菜与黑芥(Brassica nigra，2n＝16,BB)天然杂交后再自然加倍形成的双二倍体复合种，中国是其原始起源与分化中心，种植范围遍布世界。

随着经济水平的持续发展和社会现代化程度的不断提升，大众对生活品味的追求也与日俱增，不仅传统的名山大川式的旅游越来越火，田园休闲观光产业的发展也很迅速。油菜大面积生产上形成金黄色花的海洋，是越来越重要的田园生态旅游资源。油菜花观赏的时间为每年的十二月底到来年夏季。每个地方因为种植的时间略有不同，花期会有一点差异。在我国已形成几十个知名油菜花观赏地区，油菜花开时，竞相怒放、流金溢彩、绵延数十里，好似金浪滔滔的海洋。

自然界花卉颜色虽然种类繁多，但除芥蓝(B.oleracea var.alboglabra)的花瓣是乳白色以外，芸薹属植物的花瓣普遍为黄色系列，商业油菜品种全是黄色花瓣，过于单调。随着油菜花色田园生态观光产业的迅猛发展，迫切需要多姿多彩的花色性状，使之还可以开出红色、蓝色等，在不影响油菜菜籽的出油率和其他传统用途之外，增加其赏花价值，助推生态观光旅游。此外，特定的花色还是油菜育种界渴望的选择标记性状，而且花色的非黄色化还有助于减少露尾甲等虫害。因此，需要解析油菜花色性状的分子机理，并开展新花色的分子育种。

萝卜(Raphanus sativus)属于萝卜属，近年来的分子证据表明萝卜与白菜、甘蓝、甘蓝型油菜的距离甚至远小于黑芥与它们的距离，意思是说萝卜与芸薹属核心物种的距离小于芸薹属内部的种间距离。但另一方面，萝卜能开出红色系的花色，而芸薹属和众多近缘属(如白芥属)则只能开出黄色系的花。这是一个奇怪的现象，因此开展芸薹属与萝卜花色性状的比较研究，不仅是这些生物花色性状基础研究的需要，也可为油菜等芸薹属植物花色性状的遗传改良提供指导。

重要观花植物的花色分子机理和分子育种已取得显著进展，为研究其它植物花色机理和开展分子育种提供了重要参考。花色主要由类黄酮(flavonoids)和类胡萝卜素(carotenoids)两大类色素决定。

类黄酮是最见的花色素，贡献黄色、橙色、红色到紫色的一系列色系。类黄酮为水溶性物质，具有一个C15骨架，按结构主要分为9类：查尔酮(chalcones)、橙酮(aurones)、异黄酮(isoflavonoids)、黄酮(flavones)、黄酮醇(flavonols)、黄烷双醇(flavandiols)、花色苷(anthocyanins)、缩合单宁(condensed tannins,即原花青素,proanthocyanins)和鞣酐(phlobaphenes)，它们中对植物着色贡献最大的是花色苷、黄酮醇、查尔酮和橙酮。花色苷是最大的一类类黄酮物质，为花朵或其它组织贡献品红、红色、紫色、蓝色等色调，积累于细胞的液泡或色素细胞中，天竺葵素(pelargonidin)、矢车菊素(cyanidin)、飞燕草素(delphinidin)是最常见的三类花色苷；而黄色色调则由查尔酮、橙酮、黄酮醇、黄酮提供。

矮牵牛、玉米、金鱼草、拟南芥等植物中的类黄酮生物合成途径已被充分解析。它是公共体丙烷生物合成途径下游的一个重要分支途径，苯丙烷途径通过其它分支途径合成木质素、芪类、香豆素、植保素等多种次生物质。类黄酮途径的第一步是由查酮合酶(CHS)催化1分子p-香豆酰-CoA与3分子丙二酰-CoA缩合形成浅黄色的4,2’,4’,6’-四羟基查尔酮。花色苷配基如天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素等是以查尔酮为底物，经羟化、还原、氧化、侧基修饰等几步酶的催化反应而形成，依次涉及CHI(查尔酮异构酶)、F3H(黄烷酮3-羟化酶)、F3’H(类黄酮3’-羟化酶)、F3’5’H(类黄酮3’,5’-羟化酶)、DFR/FNR(二氢黄酮醇4-还原酶/黄烷酮4-还原酶)、ANS(花青素合成酶)等。由F3’H和F3’5’H决定的花青素(anthocyanidins)的B-环上的羟基越多，则颜色越偏向蓝色。通常情况下，查尔酮和花青素被进一步修饰，如糖基化(糖基转移酶，GT)、甲基化(甲基转移酶，MT)、酰基化(酰基转移酶，AT)，然后转运(谷胱甘肽S-转移酶，GST)到液泡中贮存。在黄色金鱼草花的液泡中，查尔酮4’-O-葡萄糖苷被金鱼草素合成酶(AS)转变成亮黄色的金鱼草素(6-O-葡萄糖苷)。艳桐草等植物的橙色至红色花朵中，黄烷酮经过几步反应而合成3-脱氧花色苷。此外，黄酮和黄酮醇也对花色起一定贡献，它们为无色或浅黄色，可通过所谓共色作用来促进蓝色花色苷的形成和稳定。黄酮和黄酮醇分别是以黄烷酮和二氢黄酮醇为底物，在黄酮合酶(FNS)和黄酮醇合酶(FLS)的催化下合成的。除花青素外，黄酮醇、查尔酮等其它类黄酮物质也可能涉及糖基化等修饰。

模式生物的研究表明，类黄酮途径结构基因的表达是被一个由R2R3-MYB(有PAP、PFG、TT2等)、碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH，有TT8、GL3、EGL3等)和WD40重复(WDR，有TTG1等)形成的转录因子复合物所调控的，该三元复合物调控了观花植物金鱼草、矮牵牛、牵牛花、非洲菊和龙胆花的花瓣中花色苷着色的过程，调控行为受器官、组织等体内信号和光、紫外线等外部信号所影响。拟南芥的研究表明，黄色调的黄酮醇(苷)生物合成途径的表达则由PFG基因特异调控，其中成员MYB11、MYB12、MYB111在器官特异性上发生明显分工。

类胡萝卜素(carotenoids)是脂溶性的红色、橙色和黄色色素，嵌合在叶绿体和有色体的膜中。类胡萝卜素是C40-四萜类化合物，由C5-异戊二烯基础单元合成而来，植物、真菌、藻类和细菌均可合成，动物虽不能合成，但可从食物中摄入并用作色素和维生素A的前体物。类胡萝卜素为许多花色贡献了黄色色系，并单独或与花色苷一道为玫瑰、菊花等一些植物的花瓣贡献了橙/红、黄褐色和褐色色调。迄今，植物类胡萝卜素生物合成途径的几乎全部关键酶基因已被克隆和鉴定，整个途径起始于质体中的C5的异戊二烯焦磷酸(isopentenylpyrophosphate,IPP)单元，据认为该途径的有关酶之间形成复合物并结合于质体膜上，4分子IPP缩合为1分子C20的香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)，在八氢番茄红素合酶(PSY)的催化下2分子GGPP头对头地偶合成C40的无色的八氢番茄红素，它是第一个类胡萝卜素。随后，八氢番茄红素脱饱和酶(PDS)和ζ-胡萝卜素脱饱和酶(ZDS)向分子中顺序引入共轭双链，先后形成无色的六氢番茄红素、浅黄色的ζ-胡萝卜素、橙黄色的链孢红素、红色的番茄红素。随着共轭双链数的增加，吸收波长向长波方向移动。脱饱和过程中产生的一些顺式构象被类胡萝卜素异构酶(CRTISO、Z-ISO)催化转变为全反式构象。番茄红素可被番茄红素β-环化酶(LCYB)或番茄红素ε-环化酶(LCYE)环化，这是该途径的一个分支点。除半结球莴苣等植物外，绝大多数植物中LCYE只能给番茄红素加入ε-环，合成黄色的含有1个β-环和1个ε-环的α-胡萝卜素和其衍生物。β-和α-胡萝卜素可发生进一步的羟化或环氧化修饰，产生许多新结构。胡萝卜素的加氧产物称为叶黄质，β-环和ε-环的羟化过程分别由β-环羟化酶(CHYB)和ε-环羟化酶(CHYE)完成。PSY、GGPS和LCYB存在花特异型和果实特异型，显示存在一条有色体特异的类胡萝卜素合成途径。玉米黄素环氧酶(ZEP)催化玉米黄素发生C5,6和C5’,6’位的环氧化，形成黄色的花药黄质和紫黄质，它又可在新黄质合成酶(NSY)的催化下转变成新黄质。9-顺式-紫黄质和9-顺式-新黄质还可用于合成脱落酸(ABA)。

类胡萝卜素合成途径的调控基因克隆还有待加强，但研究表明该途径的调节主要发生在转录水平上，受体内和环境因素影响，PSY是重要限速酶调控点，光信号通路参与对类萝卜素途径的调控，而且类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD)/NCED(9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶)从分解的角度参与重要调节作用。此外，VDE(紫黄质脱环氧化酶)催化紫黄质和花药黄质转化为玉米黄质。拟南芥AtRAP2.2对特定组织中的类胡萝卜素积累有弱的促进作用，但最近研究表明它的功能主要是调控组织的耐缺氧存活能力。番茄DDB1和DET1通过对光反应信号途径的负调控而抑制类胡萝卜素途径，而甘蓝OR(Orange)和番茄HSP21则是通过调控有色体的形成而促进类胡萝卜素的积累。

此外，还存在第3类植物色素，即甜菜素(betalains)，是一类存在于液泡中的水溶性生物碱，可分为红紫色系的甜菜红素(betacyanins)和黄色色系的甜菜黄素(betaxanthins)，但甜菜素只发现于石竹目的10个科的植物和少数高等真菌中，其它植物中还没有发现，而且从未发现甜菜素与花色苷并存于同一种植物中。

由于多数重要观花植物的花色并不全，存在花色上的重要缺陷，因此花色分子育种的代谢工程具有重要应用前景。但是包括油菜在内的整个芸薹属中，未见利用分子育种的代谢工程改造油菜花色的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供干扰芸薹属植物花瓣中β-环化酶基因LCYB、ε-环化酶基因LCYE、MYB12和MYB111基因表达同时异位表达TT8基因在制备花瓣呈红色的芸薹属植物品种中的应用；本发明的目的之二在于提供干扰芸薹属植物花瓣中β-环化酶基因LCYB、ε-环化酶基因LCYE、MYB12和MYB111基因表达同时异位表达TT8基因的植物表达载体；本发明的目的之三在于提供上述植物表达载体的制备方法；本发明的目的之四在于提供利用上述植物表达载体制备花瓣呈红色的芸薹属植物品种的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、干扰芸薹属植物花瓣中β-环化酶基因LCYB、ε-环化酶基因LCYE、MYB12和MYB111基因表达同时异位表达TT8基因在制备花瓣呈红色的芸薹属植物品种中的应用。

优选的，所述干扰芸薹属植物花瓣中β-环化酶基因LCYB、ε-环化酶基因LCYE、MYB12和MYB111基因表达的序列如SEQ ID NO.2所示，所述TT8基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述干扰芸薹属植物花瓣中β-环化酶基因LCYB、ε-环化酶基因LCYE、MYB12和MYB111基因表达的序列由拟南芥花瓣特异启动子PAtAP3介导表达，所述花瓣特异启动子PAtAP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第267位至第1044位所示。

最优选的，所述芸薹属植物为甘蓝型油菜(Brassica napus)。

2、干扰芸薹属植物花瓣中β-环化酶基因LCYB、ε-环化酶基因LCYE、MYB12和MYB111基因表达同时异位表达TT8基因的植物表达载体，所述植物载体包括由花瓣特异启动子介导的表达β-环化酶基因LCYB、ε-环化酶基因LCYE、MYB12和MYB111基因RNA干扰序列的表达框和由组成型启动子介导TT8基因的表达框。

优选的，所述花瓣特异启动子介导表达β-环化酶基因LCYB、ε-环化酶基因LCYE、MYB12和MYB111基因RNA干扰序列的表达框依次由花瓣特异启动子PAtAP3、SEQ ID NO.2所示的序列、间隔序列、SEQ ID NO.2所示的反向互补序列和NOS终止子组成。

更优选的，所述由组成型启动子介导TT8基因的表达框依次由CaMV35S启动子，SEQ IDNO.3所示序列和NOS终止子组成。

3、所述植物表达载体的制备方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO.1所示序列经AscI和SwaI双酶切后连入经同样酶切的pFGC5941M质粒，得pFGC5941CEPE质粒，然后将SEQ IDNO.2所示的序列连入pFGC5941CEPE载体的PAtAP3启动子与间隔序列之间，形成中间载体pFGC5941CEPE-B4RNAia，再将SEQ ID NO.2所示序列反向连入中间载体pFGC5941CEPE-B4RNAia的间隔序列与OCS终止子之间，得pFGC5941CEPE-B4RNAi载体，最后将SEQ ID NO.3所示序列通过NcoI和AscI酶切位点连入经同样酶切的pFGC5941CEPE-B4RNAi载体，得干扰芸薹属植物花瓣中β-环化酶基因LCYB、ε-环化酶基因LCYE、MYB12和MYB111基因表达同时异位表达TT8基因的植物表达载体。

优选的，所述间隔序列为甘蓝型油菜PAP2基因第2内含子。

4、利用所述植物表达载体制备花瓣呈红色的芸薹属植物品种的方法，包括如下步骤：

a.将权利要求5-7任一项所述植物表达载体转化农杆菌，制得工程菌；

b.将步骤a所得工程菌转化芸薹属植物无菌苗的下胚轴，共培养后，在Basta除草剂抗性下诱导分化获得再生苗，筛选阳性苗转基因苗得花瓣呈红色的芸薹属植物品种。

本发明的有益效果在于：本发明提供了油菜等芸薹属核心物种及萝卜花色机理，明确了黄花、白花、红花之间的关键性差异表达基因位点，由此本发明克隆花瓣特异启动子并改造获得一种适合于花色基因工程的新型植物表达平台载体，然后克隆相关基因或基因片段，构建获得一种在花瓣中抑制黄色色素并积累番茄红素和花青素苷的植物表达载体，转化油菜后创造出红色油菜花表型的新型资源材料，这是油菜等芸薹属花色基因工程的首次成功，也是通过类胡萝卜素途径代谢工程修饰植物花色的首次成功。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为芸薹属和萝卜花瓣的显微观察结果(A：甘蓝型油菜(BnY)；B：甘蓝型油菜(BnW)；C：芥菜型油菜(BjY)；D：白菜型油菜(BrY)；E：甘蓝(BoY)；F：芥蓝(BoW)；G：萝卜(RsR))。

图2为DFR、TT19、TT8在芸薹属花瓣与萝卜花瓣间的差异表达(BnYPe：甘蓝型油菜黄花瓣；BnWPe：甘蓝型油菜白花瓣；BjYPe：芥菜型油菜黄花瓣；BrYPe：白菜型油菜黄花瓣；BoYPe：羽衣甘蓝黄花瓣；BoWPe：芥蓝白花瓣；RsRPe：萝卜红紫花瓣)。

图3为OR、CCD1在芸薹属花瓣和萝卜花瓣间的差异表达(BnYPe：甘蓝型油菜黄花瓣；BnWPe：甘蓝型油菜白花瓣；BjYPe：芥菜型油菜黄花瓣；BrYPe：白菜型油菜黄花瓣；BoYPe：羽衣甘蓝黄花瓣；BoWPe：芥蓝白花瓣；RsRPe：萝卜红紫花瓣)。

图4为NOS-PAtAP3、B4RNAi和BnTT8-1PCR扩增结果(A：NOS-PAtAP3；B：B4RNAi；C：BnTT8-1)。

图5pFGC5941CEPE和pBLycoRF2载体构建过程中酶切结果(A：AscI和SwaI双酶切pFGC5941M；B：AscI和SwaI双酶切pMD19-T-NOS-PAtAP3；C：SwaI和AatI双酶切pFGC5941CEPE；D：SwaI和AatII双酶切pMD19-T-B4RNAi；E：BamHI和XbaI双酶切pMD19-T-B4RNAi；F：BamHI和XbaI双酶切pFGC5941CEPE-B4RNAia；G：NcoI和AscI双酶切pFGC5941CEPE-B4RNAi；H：NcoI和AscI双酶切pMD19-T-BnTT8-1)。

图6为pBLycoRF2转化油菜植株的花瓣颜色(A：对照组；B：转基因油菜)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例采用的植物材料：甘蓝型油菜黄花瓣和发育中期种子(中双9号品种)、甘蓝型油菜乳花瓣、白菜型油菜黄花瓣(6Y733品系)、芥菜型油菜黄花瓣(CNG12011品系)、羽衣甘蓝(B.oleracea var.acephala ftricolor，K10-3品系)黄花瓣、芥蓝变种白花瓣(R9057品系)、萝卜红花瓣均取自西南大学重庆市油菜工程技术研究中心歇马基地的常规试验植株。拟南芥(Arabidopsis thaliana，Columbia野生型)种子购自国际拟南芥中心，种植于室内人工气候室。

本发明实施例采用的试剂及试剂盒：PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)、Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)ROX plus、DNALigation Kit、pMD19-T、Taq DNA聚合酶、DNase I(RNase-free)及buffer、RNase Inhibitor、DL-2000及λ-HindIII DNA Marker购自大连宝生物(TaKaRa)生物工程有限公司；RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品；胶回收试剂盒、小量法质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；限制性内切酶购自立陶宛MBI Fermentas公司；MS(Murashige&Skoog medium,including vitamins)培养基为荷兰Duchefa公司产品；DL-2000plus、Easy-Taq酶、dNTPs等试剂购自北京全式金(Transgen)生物技术有限公司；X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid)、利福平(Rif)、链霉素(Str)、卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、琼脂糖、Tris、CTAB、Tris饱和酚(pH＝8.0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、IPTG、CTAB等其它生化与分子生物学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司；植物激素购自上海稼丰园艺用品等公司。

本发明实施例采用的主要仪器：Veriti^TM多重控温PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；CFX96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；以及分子生物学和基因工程的其它设备设施。

优选实施例所用PCR引物合成和测序由上海英骏/英潍捷基公司、上海生工、北京六合华大等公司商业完成。

实施例1、芸薹属和萝卜花瓣显色亚细胞器的显微观察

分别采取新鲜的甘蓝型油菜黄花瓣(BnY)；甘蓝型油菜乳花瓣(BnW)；芥菜型油菜黄花瓣(BjY)；白菜型油菜黄花瓣(BrY)；羽衣甘蓝黄花瓣(BoY)；芥蓝白花瓣(BoW)；萝卜红花瓣(RsR)，放在冰面冷鲜保存运回实验室，然后徒手切片，用低倍镜观察快速筛查，挑选合格切片进行仔细观察与照相，结果如图1所示。结果显示，芸薹属几个物种的黄花瓣中显黄色的物质在一个细胞中呈现为众多小颗粒状，不均匀地分布于细胞内，被液泡挤压到贴壁的位置，说明黄色花瓣中显色细胞器为有色体，其色素为黄色类胡萝卜素。甘蓝型油菜乳花瓣中也有一些细胞拥有浅黄色有色体，但总体数量少且细胞间不一致，芥蓝白花瓣中几乎看不到有色体，说明是有色体的减少或消失导致其黄色变浅或消失。萝卜花瓣中紫红色色素均匀分布于每个细胞的中央位置，越是中央越浓，越偏离中央越淡，说明萝卜花瓣的显色亚细胞器为液泡，显色物质为花青素苷。

实施例2、检测芸薹属和萝卜花瓣色素

在盛花期早晨分别取刚开放的甘蓝型油菜黄花瓣(BnY)；甘蓝型油菜乳花瓣(BnW)；芥菜型油菜黄花瓣(BjY)；白菜型油菜黄花瓣(BrY)；羽衣甘蓝黄花瓣(BoY)；芥蓝白花瓣(BoW)；萝卜红花瓣(RsR)，立即阴凉保鲜运回实验室，50～60℃烘干，研成粉末后过60目筛，避光干燥保存。

1、石油醚、盐酸和氨水测试结果

称取保存的花瓣粉末0.100g，分别放入编有号码的具塞试管中，分别加入石油醚、10％盐酸、30％氨水各约10mL，轻轻混匀，过滤，观察颜色变化，结果如下：

(1)石油醚反应：甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜都表现出亮黄色，表明类胡萝卜含量的含量高；羽衣甘蓝表现出浅黄色，说明其含有少量的类胡萝卜素；而芥蓝和萝卜花表现出无色，表明不含类胡萝卜素。

(2)盐酸测试：只有萝卜红花瓣表现出粉红色，说明含有花青素苷，而甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜花瓣表现出不同程度的黄色，说明含黄酮(醇)而不含花青素。芥蓝白和羽衣甘蓝表现近无色，说明不含有花青素，而且黄酮(醇)也很少。

(3)氨水测试：芸薹属各材料均表现出不同程度的黄色，说明其含有或多或少的黄酮(醇)，而萝卜花表现出的黄绿色，该颜色是由花色苷呈现的蓝色和类黄酮呈现的黄色混合而成，但所有材料均不表现橙红色或红色，说明不含橙酮。

2、类黄酮的显色反应

取保存的花瓣粉末0.100g，用甲醇提取24h，过滤，定容至50mL，各取2mL提取液，然后进行下列颜色反应，观察颜色变化。

(1)浓盐酸-镁粉反应：加入少量镁粉，再后加入浓盐酸5滴，轻轻摇匀，静置1h。结果显示，甘蓝型油菜、芥蓝显示无色，可能含有查尔酮、橙酮；甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜显示极淡紫红和微紫红，说明不含查尔酮、橙酮和儿茶素，可能含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮醇、二氢黄酮；萝卜花显现出粉红色，说明含有花青素。

(2)浓盐酸-锌粉反应：加入少量锌粉，再加入浓盐酸10滴，轻轻摇匀，静置1h。结果显示，萝卜花呈现粉红色，说明含有花青素苷。其余均无色或者黄色，说明不含花青素苷。

(3)醋酸铅反应：加1.0％醋酸铅2mL，轻轻摇匀，静置2h。结果显示，所有芸薹属材料均出现不同程度的黄色沉淀，说明类黄酮具备酚羟基而且不含查耳酮和橙酮，可能具有邻二酚羟基或者兼有4-酮基、3-OH或者4-酮基、5-OH结构；萝卜花出现绿色沉淀，说明含有花青素苷。

(4)三氯化铁反应：加5.0％三氯化铁2ml，轻轻摇匀。结果显示，所有材料都出现黄色，说明色素分子中不含酚羟基。

(5)三氯化铝反应：加1.0％三氯化铝甲醇溶液lml。结果显示，所有材料都呈现程度不同的黄色，说明含类黄酮物质。

(6)浓硫酸反应：加1.5mL浓H₂SO₄，轻轻摇匀，再置沸水浴5min。所有芸薹属材料均呈现不同程度的黄色，说明含黄酮(醇)，沸水中5min颜色不改变，说明不含查尔酮、橙酮，可能不含二氢黄酮，可能含异黄酮和二氢异黄酮。萝卜花出现橙黄色，说明含有花青素。

(7)四氢硼钠反应：加四氢硼钠8mg，再加1.0％盐酸2mL，轻轻摇匀，静置2h。所有芸薹属材料均呈现程度不同的黄色，说明不含二氢黄酮和二氢黄酮醇。萝卜花呈现极淡粉红色，说明含有二氢黄酮和/或二氢黄酮醇。

(8)碱性试剂反应：加5％Na₂CO₃3ml，轻轻摇匀，密闭静置30min，通空气10min。所有材料均呈现程度不同的黄色，通空气后颜色不变，说明不含二氢黄酮醇。

(9)氨性氯化铯反应：取甲醇10ml，加氨水定容至25ml，成为被氨水饱和的甲醇溶液。向样品液中加入0.01mol/L氯化锶甲醇液10滴，再加被氨水饱和的甲醇液10滴，用手轻轻摇匀，静置lh。萝卜花呈现出沉淀，说明有3’,4’-二羟基取代。

(10)硼酸反应：加1.0％硼酸10滴，再加2.0％H₃BO₃3ml，芥蓝白花瓣呈现出无色，说明芥蓝白花瓣类黄酮可能不含C₅-OH。

3、花瓣色素成分的紫外-可见光谱分析

(1)叶绿素：称取保存的花瓣0.100g，迅速用液氮研磨至粉末，采用体积分数为90％的丙酮:乙醇(4:l，V/V)提取24h，过滤，定容至25ml，采用紫外-可见分光光度计在200～700nm范围内扫描。结果表明，所有样品在662nm和644nm处均无吸收峰，说明均不含叶绿素。

(2)类胡萝卜素：称取保存的花瓣0.100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入石油醚:丙酮(1:1，V/V)提取24h，过滤，定容至25ml，采用紫外-可见分光光度计在200～700nm范围内扫描。结果表明，甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘蓝在440和470nm左右都有吸收峰，说明含有类胡萝卜素，定量分析测定的含量分别为6.824、6.712、5.548、1.248mg/g。而芥蓝和萝卜花瓣则没有特征吸收峰，说明不含有类胡萝卜素。

(3)类黄酮：称取保存的花瓣0.100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入盐酸化甲醇(pH＝3)2ml置于4℃冰箱中提取24h，过滤，定容至25ml，用紫外-可见分光光度计在220～600nm范围内扫描。结果表明，甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘蓝、芥蓝、萝卜花瓣的提取液在330和270nm均有吸收峰，说明他们都含有类黄酮化合物，定量分析测定的含量分别为7.483、7.651、7.001、1.391、1.003、8.373mg/g。

(4)花青素苷：称取保存的花瓣0.100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入甲醇提取24h，过滤，定容至50ml，用紫外-可见分光光度计在200～700nm范围内扫描。结果表明，萝卜花瓣色素在532nm左右有较明显的花色苷特征吸收峰，是花色苷带I吸收峰，在260-270nm区域内以一个不太强带II的峰，定量分析测定的含量为237.27mg/100g。所有芸薹属样本均无花色苷吸收峰，即不含花色苷。

实施例3、芸薹属和萝卜花瓣色素生物合成途径的分子鉴定

(1)芸薹属和萝卜花瓣类黄酮途径基因的表达特征

为研究芸薹属和萝卜花瓣色素出现差异的分子机理，设计芸薹属和萝卜类黄酮途径基因的RT-PCR检测引物，并以5SrRNA作为内参，具体如表1所示：

表1、类黄酮途径RT-PCR检测引物

在盛花期早晨分别取刚开放的甘蓝型油菜黄花瓣(BnY)；甘蓝型油菜乳花瓣(BnW)；芥菜型油菜黄花瓣(BjY)；白菜型油菜黄花瓣(BrY)；羽衣甘蓝黄花瓣(BoY)；芥蓝白花瓣(BoW)；萝卜红花瓣(RsR)，液氮冷冻运输，-80℃冰箱保存备用。然后用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒抽提总RNA，经电泳分析和分光光度法检测合格后，用RNase-freeDNase I除去总RNA中的DNA杂质，用RT Reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行进一步去基因组DNA(gDNA)并进行反转录，得到总cDNA第一链。用CHS基因家族的一对保守区引物进行PCR扩增，靶区间跨内含子，电泳显示所有样品仅扩出与预测大小一致的cDNA条带而没有gDNA条带，进一步用内标基因25SrRNA进行检测，各样品间的扩增条带特异且亮度差异不大，说明反转录前已彻底去除了总RNA中的gDNA，所有样品反转录成功且总cDNA浓度相差不大，可以用于基因表达定量PCR等实验。

然后采用Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)kit在CFX96^TM Real-Time System上进行荧光实时定量PCR，根据说明书的方法执行PCR程序。反应体系为20μL体系定量RT-PCR含有反转录产物0.1μL、SYBR Premix Ex Taq^TMII(2×)10μL、各引物(10μM)0.4μL，其余体积用ddH₂O补齐。PCR循环参数为：95℃预变性3min；50个扩增循环(95℃变性10s、对应温度退火30s、72℃延伸30s)；65℃5s；95℃5s。实验设置了2个RNA提取-反转录重复(生物学重复)，每个反转录重复2次PCR(检测重复)，4次结果取平均值。并且通过熔化曲线分析验证反应的特异性，相对表达量根据2^-ΔCt计算，结果如图2所示。

结果显示，CHS、CHI、F3H、TTG1、PAP基因家族在所有材料中均旺盛或中等程度表达，材料间差异不大。F3’H、F3H、FLS、PFG(MYB12、MYBL2)在各材料中均有表达，仅仅只材料间有高低差异而已。DFR、ANS、TT19、TT8、EGL3在芸薹属各材料中均没有明显的表达或表达极低，但在萝卜中表达量却很高。GL3在芸薹属和萝卜材料中都未检测到其表达。说明黄酮醇的合成在芸薹属和萝卜花瓣中均处于旺盛或较旺盛的工作状态，花青素苷的合成仅在萝卜花瓣中旺盛工作却在芸薹属花瓣中处于关闭状态。

(2)芸薹属和萝卜花瓣类胡萝卜素途径的表达特征

为进一步研究芸薹属和萝卜花瓣色素出现差异的分子机理，设计芸薹属和萝卜类胡萝卜素途径17个功能位点基因家族的RT-PCR引物，并以25SrRNA作为内参，具体引物如表2所示。

表2 本发明所用的类胡萝卜素途径RT-PCR检测引物

然后利用与上述相同的方法进行RT-PCR，并通过熔化曲线分析验证反应的特异性，相对表达量根据2^-ΔCt计算，结果如图3所示。

结果显示，类胡萝卜素途径的所有检测基因位点在7个物种材料的花瓣中均表达，但也存在一些差异，一是芸薹属白/乳花瓣中CCD1表达水平明显比黄花瓣中高，二是萝卜花瓣中OR呈关闭状态而不表达，芸薹属二倍体基本种中OR表达水平也没有四倍体复合种中高。说明萝卜花瓣中类胡萝卜素的缺失是因为OR关闭而不能形成有色体，芸薹属白/乳花瓣中类胡萝卜素的减少是因为类胡萝卜素的分解过强。

实施例4、植物表达平台载体pFGC5941CEPE的构建

根据芸薹属和萝卜花瓣类胡萝卜素和类黄酮合成途径上基因表达差异，设计克隆差异表达基因和构建表达载体的引物，具体引物如表3所示。

表3 本发明中基因克隆、载体构建与检测所用引物

(1)NOS-PAtAP3片段的获得

以pCAMBIA2301质粒为PCR模板，用引物组合FTNOS和RTNOS扩增并回收286bp的片段，得含NOS终止子的片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第1-286位所示。采用CTAB法提取拟南芥叶片的基因组总DNA为PCR模板，用引物组合FPAtAP3和RPAtAP3扩增并回收778bp的含花瓣特异启动子PAtAP3片段(GenBank accession number:U30729)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第267-1044位所示。然后将两种回收产物混合后作为PCR模板，用引物组合FTNOS和RPAtAP3扩增，获得片段大小为1044bp的融合片段NOS-PAtAP3，结果如图4中A所示。然后切胶回收，与pMD19-T连接的pMD19-T-NOS-PAtAP3重组载体，将获得的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对Amp抗性LB平板筛选的转化子单克隆采用引物组合FTNOS和RPAtAP3进行PCR检测，测序结果显示，融合片段NOS-PAtAP3序列如SEQ ID No.1所示。

(2)pFGC5941CEPE的构建

抽提pMD19-T-NOS-PAtAP3重组质粒，然后用AscI和SwaI进行双酶切，回收NOS-PAtAP3片段，见图5中B；同时抽提pFGC5941M质粒，经AscI和SwaI双酶切后回收载体骨架，如图5中A所示。将NOS-PAtAP3片段和pFGC5941M质粒连接后获得11241bp的适合于花色基因工程的植物表达载体pFGC5941CEPE，将pFGC5941CEPE转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含Kan浓度为50mg/L的LB平板上筛选单克隆转化子，将筛选获得的单克隆转化子用引物组合FTNOS和RPAtAP3与F35S3N和ROCST5N进行PCR检测，筛选阳性克隆子测序，选取序列无突变的克隆子备用。其获得的pFGC5941CEPE重组质粒中，在T-DNA区间含有Bar基因表达盒(提供对除草剂Basta的抗性)和2个可用于插入外源基因的表达盒，外源基因表达盒1含组成性启动子CaMV35S和NOS终止子，可用于目的基因的正义或反义表达；外源基因表达盒2含花瓣特异启动子PAtAP3、间隔子BnPAP2I2(甘蓝型油菜(Brassicanapus)PAP2基因第2内含子)和OCS PolyA终止子，可用于目的基因的RNA干扰、正义或反义表达。

(3)串联四价RNA干扰片段B4RNAi的克隆

采用上述反转录得到的甘蓝型油菜花瓣总cDNA第一链为模板，采用引物组合FBLCYBi和RBLCYBi扩增LCYB基因家族的RNA干扰片段(387bp，加酶切位点和接头后为411bp)，用引物组合FBLCYEi和RBLCYEi扩增LCYE基因家族的RNA干扰片段(480bp，加接头后为504bp)，用引物组合FBMYB12i和RBMYB12i扩增MYB12基因家族的RNA干扰片段(417bp，加接头后为441bp)，用引物组合FBMYB111i和RBMYB111i扩增MYB111基因家族的RNA干扰片段(524bp，加酶切位点和接头后为550bp)，分别回收。然后将4种PCR的回收产物等量混合后作为模版，用引物组合FBLCYBi和RBMYB111i扩增成1808bp片段，该片段串联CYBi、CYE、MYB12和MYB111四个基因的RNA干扰片段，命名为B4RNAia，结果如图4中B所示(加酶切位点后为1834bp)。然后回收B4RNAia，与pMD19-T连接得pMD19-T-B4RNAi，pMD19-T-B4RNAi转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对Amp抗性LB平板筛选的转化子单克隆采用引物组合FBLCYBi+RBMYB111i进行PCR检测，送阳性克隆进行测序，测序结果如SEQ ID No.2所示。

(4)构建植物表达载体pFGC5941CEPE-B4RNAi

抽提pMD19-T-B4RNAi质粒，用SwaI和AatII双酶切(SwaI先切，再加AatII)，回收B4RNAi片段，见图5中D所示；同时抽提pFGC5941CEPE质粒，用SwaI和AatII双酶切后，回收载体骨架，见图5中C所示。将回收的B4RNAi片段连入pFGC5941CEPE植物表达载体的PAtAP3启动子与间隔子BnPAP2I2之间，形成中间载体pFGC5941CEPE-B4RNAia，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用Kan抗性LB平板筛选的单克隆转化子，然后分别采用引物组合FPAtAP3和FBLCYBi与RBnMYB111i和RBnPAPI2进行PCR检测，PCR阳性克隆子备用。

抽提pMD19-T-B4RNAi质粒，用BamHI和XbaI双酶切，回收B4RNAi的正义片段B4RNAi，见图5中E所示。同时抽提pFGC5941CEPE-B4RNAia质粒，用BamHI和XbaI双酶切，回收载体骨架，见图5中F所示。将B4RNAi连入pFGC5941CEPE-B4RNAia质粒(间隔子BnPAP2I2与OCS终止子之间)，形成植物表达载体pFGC5941CEPE-B4RNAi，将植物表达载体pFGC5941CEPE-B4RNAi转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用Kan抗性LB平板筛选单克隆转化子，再用FPAtAP3和FBLCYBi、FBLCYBi和ROCST5N、RBnMYB111i和RBnPAPI2、FBnPAPI2和RBnMYB111i4对引物组合进行PCR鉴定，阳性克隆子测序，选取序列无突变的克隆子备用。

(5)甘蓝型油菜TT8-1(BnTT8-1)基因的cDNA编码区的克隆

我们从前的研究表明，甘蓝型油菜TT8-1(BnTT8-1)基因主要在种皮中表达，激活类黄酮-原花青素的合成，也在衰老转红的茎叶中表达，激活类黄酮-花青素苷的合成。因此，本发明从甘蓝型油菜发育的种子中克隆BnTT8-1的cDNA编码区，然后用于构建正义载体并转化油菜以后在花瓣中异位表达。提取甘蓝型油菜发育中期种子的总RNA，如前法去gDNA后反转录得第一链cDNA，然后以第一链cDNA为模板，采用FBnTT8-1和RBnTT8-1引物组合扩增BnTT8-1基因，获得BnTT8-1基因1566bp的编码区(加酶切位点后为1576bp)，电泳结果如4中C所示，将其胶回收，与pMD19-T连接成pMD19-T-BnTT8-1，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对Amp抗性LB平板筛选的转化子单克隆采用引物组合FBnTT8-1和RBnTT8-1进行PCR检测，送多个阳性克隆子测序，测序结果显示BnTT8-1序列如SEQ ID No.3所示，选取序列无突变的克隆子备用。

(6)构建植物表达载体pBLycoRF2

抽提pMD19-T-BnTT8-1质粒，用NcoI和AscI双酶切(AscI先切，再加NcoI)，回收BnTT8基因片段，见图5中H所示；同时抽提pFGC5941CEPE-B4RNAi质粒，用NcoI和AscI双酶切，回收载体骨架，见图5中G所示。将回收的BnTT8基因片段和pFGC5941CEPE-B4RNAi载体骨架连接，形成串联四价RNAi和一价异位表达的五价植物表达载体，命名为pFGC5941CEPE-B4RNAi-BnTT8-1ox，简称为pBLycoRF2。然后将pBLycoRF2转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对Kan抗性LB平板筛选的转化子单克隆分别用FPAtAP3和FBLCYBi、FBLCYBi和ROCST5N、RBnMYB111i和RBnPAPI2、FBnPAPI2和RBnMYB111i、F35S3N和RTT8-1、FTT8-1和RTNOS6对引物组合分别载体是否构建成功，然后将阳性克隆子提取质粒后采用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404，然后用含Kan、Str和Rif的抗性LB平板筛选的单克隆转化子，并用上述6对引物组合进行PCR检测，筛选阳性克隆子作为工程菌株保存，用于植物转化。

实施例5、pBLycoRF2转化油菜

所有组织培养操作均在标准的植物组织培养条件下进行，超净工作台、培养间、驯化间的洁净级别分别为100级、10000级和100000级，相应试剂、材料、器皿均按规程进行无菌处理。甘蓝型油菜典型黄花品种中双10号的种子用75％乙醇表面消毒1min后用无菌水冲洗3次，然后用5％次氯酸钠浸泡20min，无菌水冲洗干净后接种于MS固体培养基中(MS粉4.41g/L+Phytagel2.6g/L+蔗糖30.0g/L，pH5.8，灭菌锅湿热灭菌；不加Phytagel即为液体培养基)，于25℃、2000Lux光照、16h/d光周期培养(后面的组培间培养条件除特别注明者外，均与此相同)。切取苗龄8d左右无菌苗的下胚轴切成长约0.5～1.0cm的小段，接种到预培培养基MSp上(MS培养基+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D)预培养3d。

将-80℃保存的含有pBLycoRF2的LBA4404工程菌株在加有100mg/L Kan、20mg/L Str和40mg/L Rif的LB液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养1～2d，使农杆菌生长至对数期，转接培养一次。然后在5000rpm、10min室温离心收集菌体，用浸染培养基MSm(MS液体培养基+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+100μmol/L AS)调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.5左右，即为浸染液。

将预培养后的下胚轴段浸入浸染液中5～10min，间歇性轻轻摇荡，然后将下胚轴段在灭菌纸上吸干多余菌液，接种到共培培养基MSc(MS固体培养基+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)中，于23.5℃暗培养48h。暗培养后用杀菌液体培养基MSk(MS液体培养基+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+500mg/L Cef)浸泡洗涤外植体3次，每次10min，然后用灭菌纸吸干表面液体，转接到诱导筛选培养基MSi(MS固体培养基+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta+6mg/L AgNO₃)培养，每2周继代1次，至长出肉眼可见的抗性愈伤，再转接到分化培养基MSd(MS固体培养基+4.0mg/L6-BA+2.0mg/L ZT+5.0mg/L AgNO₃+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta)中培养14d以上，诱导愈伤组织分化出小芽，再转接到茎分化培养基MSs(MS固体培养基+3.0mg/L6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta)培养至长出小茎，再转接到长茎培养基MSe(MS固体培养基+0.05mg/L6-BA+500mg/L Cef+12.5mg/L Basta)中培养至长完整无根小苗，再转接到生根培养基MSr(MS固体培养基+2mg/L NAA)培养至长出发达根系，生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩、蛭石、草炭土混合物(质量比为1:1:1)的盆钵中，按温室盆栽进行管理。

最终，pBLycoRF2转化甘蓝型油菜中双10号后获得22株再生植株；对再生植株叶片滴加200mg/L Basta溶液检测抗性，并提取叶片基因组总DNA分别采用引物组合F35S3N和RBnTT8-1、FBLCYBi和ROCST5N进行PCR检测，结果表明获得13株双阳性转基因植株。

对转基因阳性植株进行全面的生物学和农学观察，结果如图6所示。结果显示，获得的转基因植株生长发育和背景性状没有明显改变，但花瓣均变成了红色，花瓣细胞显微观察表明红色物质既有来源于有色体的，也有来源于液泡的，生化成分检测也表明新产生的红色物质既有番茄红素，也有花青素苷。表明可以通过本发明的方法，抑制黄色色素并积累番茄红素和花青素苷可以创造红色油菜花。

对转基因当代植株进行自交繁殖，采用与转基因当代植株一样的叶片滴加Basta抗性检测，筛选鉴定出转基因油菜纯合优株系，其花瓣颜色比转基因当代植株更红，说明转基因性状可以稳定遗传且纯合后代株系比当代(杂合)单株的转基因性状更好。

其它说明

最后说明的是，以上实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，但并非限制于此。尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。这里特别申明，应用形式上的如下改变也都必然属于本发明的精神和范围所覆盖：

1、本发明中的TT8-1、LCYB、LCYE、MYB12、MYB111基因/基因片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，还包括来自于亲本物种白菜或甘蓝中的对应基因序列，也包括来自于这些物种中同一功能位点基因家族其它成员的序列，尽管它们与序列表中所列的核苷酸序列可能有小的差异。

2、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括与它们在连续80bp及以上有98.00％以上一致性的任意核苷酸序列。

3、本发明中LCYB、LCYE、MYB12、MYB111位点的RNA干扰片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括来自于同一基因其它位置的片段。

4、本发明中对LCYB、LCYE、MYB12、MYB111位点表达的抑制，除了优选实施例中所举的RNA干扰技术以外，还可以采用反义RNA、基因组编辑(ZFN、TALEN、CRISPR-Cas)等技术来达到相同或相似的目的。

5、本发明中的基因和其片段，除了象优先实施例中所举的采用pFGC5941的改造载体进行构建以外，还可以采用其它载体来进行植物表达载体构建，包括采用其它启动子和终止子，来达到相同或相似的目的；本发明中的载体构建物，除了象优先实施例中所举的采用根癌农杆菌菌株LBA4404介导的改良叶盘法进行遗传转化以外，也可以采用其它方法进行植物遗传转化。

6、本发明中的基因、基因片段和载体构建物，除了象优先实施例中所举的用于甘蓝型油菜以外，还可以应用于其亲本物种白菜、甘蓝以及芸薹属的其它近缘种，来达到相同或相似的目的。