一种降低紫茎泽兰化感作用的生防菌株及其使用方法

摘要

本发明公开了一种降低紫茎泽兰化感作用的生防菌株及其应用。所述生防菌株为节杆菌(Athrobacter sp.)ZS3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.9283。本发明的节杆菌ZS3在无机盐培养基中5天内能将浓度均为100ug/mL的泽兰二酮和羟基泽兰酮的降解49.8％和56.8％。以4mL/100g土的比例喷施浓度为10

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体是涉及一种能够有效降低外来入侵植物紫茎泽兰化感作用的生防菌株。同时，本发明还涉及所述生防菌株在生物防治中的使用方法。 

背景技术

紫茎泽兰(Ageratina adenophorum)是菊科多年生的恶性外来入侵杂草，原产于中美洲的墨西哥和哥斯达黎加，目前广泛分布在世界热带、亚热带30多个国家和地区。紫茎泽兰入侵对当地生态环境造成了严重的影响，主要表现在排挤本地其他植物的生长，形成单优种群，破坏生物多样性。紫茎泽兰入侵农田、林地、牧场后，与农作物、牧草和林木争夺肥、水、阳光和空间，对农作物和经济植物、草地维护、森林更新有显著的影响。研究发现紫茎泽兰的茎、叶提取液和根分泌物均含有化感物质，能显著抑制当地植物的萌发和生长。杨国庆等(2006)使用色谱分离和生测跟踪相结合的方法，分离和筛选出紫茎泽兰淋溶途径的2种主效化感物质，并采用核磁共振及气质连用技术对其进行了结构鉴定： 

分别命名为Ⅰ:4,7-二甲基-1-(丙烷-2-亚甲基)-1,4,4a,8a-四氢萘-2,6(1H,7H)-二酮(泽兰二酮,DTD)和Ⅱ:6-轻基-5-异丙基-3,8-二甲基-4a,5,6,7,8.,8a-六氢萘-2(1H)-酮(羟基基泽兰酮，HHO)。 

长期以来，对紫茎泽兰的防治多从农业防治和化学防治出发，防治效果不明显，而且造成了一定程度的环境污染。因此，生物防治由于其自身的优点开始受到越来越多的重视。但现有技术在生物防治方面的研究相对较少，且主要是从紫茎泽兰的天敌方面开展的，如泽兰食蝇(Procecidochares utilis Stone)和泽兰尾孢菌(Cercospora eupatorii)等。如果能从降低紫茎泽兰的化感作用、削弱其竞争能力的角度出发，将为有效控制紫茎泽兰入侵提供一种新的途径，但现有技术中尚未见有成功的报道。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能有效降低紫茎泽兰化感作用的生防菌株。 

本发明的目的还在于提供所述的生防菌株在紫茎泽兰生物防治中的使用方法。 

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。 

A.本发明从紫茎泽兰入侵土壤中分离了一株优势微生物ZS3作为试验菌株，对其进行16s rRNA测序及NCBI比对，鉴定结果表明该菌株的16s rDNA序列与节杆菌属相似性达到99％，其分类命名为节杆菌(Arthrobacter sp).ZS3，保藏号为CGMCC No.9283。 

本发明所述的节杆菌ZS3(Arthrobacter sp ZS3)菌株的形态学特征为：细胞呈不规则杆状，长1～3μm，宽为0.4～1μm。常呈V形排列，端圆。杆状断裂成小球，直径0.5～1μm，单个，成对排 列，不规则堆状。存在球杆周期。革兰氏阳性，不生孢，好氧，水解淀粉，氧化酶阴性，接触酶阳性。 

本发明提供了一种节杆菌制剂，该制剂按常规方法制备，即将节杆菌ZS3(Arthrobacter sp ZS3)扩大发酵培养后制成菌剂。 

菌剂的制备方法优选为：将节杆菌ZS3(Arthrobacter sp ZS3)用活化培养基进行活化；将灭菌的扩大培养基定量备用；活化后的菌种分别接种至灭菌处理过的扩大培养基中扩大培养，振荡培养1～5天；将菌液在4000～6000r/min离心10分钟，沉淀用灭菌水稀释成ZS3活菌浓度总数为1×10⁹～1×10¹⁰CFU/ml的菌剂。 

B.本发明还提供了所述节杆菌ZS3(Arthrobacter sp ZS3)在紫茎泽兰生物防治中的使用方法，其具体作法如下：用制备好的ZS3生防菌剂(浓度为10⁹～10¹⁰CFU/ml)以4mL/100g土的量喷施到土壤中。 

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点： 

实验证明，节杆菌ZS3(Arthrobacter sp ZS3)在无机盐培养基中5天内能将DDT和HHO(浓度均为10mg/L)降解49.8％和56.8％。萌发实验表明，将ZS3菌株喷施生土后能降低紫茎泽兰化感作用46.8％。该菌株能有效降解紫茎泽兰化感物质DDT和HHO，减小紫茎泽兰的化感作用，在一定程度上削弱了其竞争力，给与之竞争的本地植物的生长提供更多的机会，促进干扰生境的生物多样性。由于是生物制剂，完全没有使用除草剂所带来的一系列问题。该菌株在防治紫茎泽兰方面具有广阔的应用前景。 

保藏生物材料的说明 

本发明的菌株，已于2014年06月09日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；该中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株分类命名为节杆菌(Arthrobacter sp).ZS3；保藏号为CGMCC No.9283。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

实施例Ⅰ、DDT和HHO降解菌ZS3菌株的分离与鉴定 

一、降解菌ZS3菌株的分离 

菌株筛选步骤:分别将1g紫茎泽兰根土投入含有泽兰二酮和羟基泽兰酮的60ml无机盐培养基，摇床培养1天后，分别取100μL涂布于含两个化感物质无机盐培养平板上，倒置于恒温培养箱，30℃培养。待菌长出后，用接种环在两种培养基上挑取不同形态特征的菌落，然后，在营养固体培养基上多次划线、分离、纯化。然后将筛选出的菌株转接到在含两种化感物质无机盐固体培养基上划线，分离得到对两种化感物质有良好耐受性及降解性能的菌株。通过上述方法从紫茎泽兰根土筛选到10株菌。为确保菌株降解性能的稳定，进一步筛选。将10株菌在营养培养基扩大培养2天，分别取1菌环菌液接入40mL含泽兰二酮和羟基泽兰酮各400μL的无机盐培养液中，摇床培养4天后，分别取100μL涂布于相应化感物质无机盐固体培养基上，观察是否有菌长出。选择在化感物质无机盐固体培养基上长出的菌。将驯化得到的菌接入营养培养基扩大培养2天，取1mL菌液(采用平板计数法确定数量)接入10mL含泽兰二酮和羟基泽兰酮各100μL的无机盐培养液中，摇床培养5天，取样测定其中2个化感物质的含量。通过这些试验，我们发现菌株ZS3对紫茎泽兰的化感物 质有较稳定的降解作用。因此选择将菌株ZS3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9283。 

所用的营养培养基：葡萄糖5g；蛋白胨2g；酵母提取物1g；水1L；琼脂15-20g；pH＝7.5。 

无机盐培养基：硝酸铵3g；磷酸二氢钾0.5g；磷酸氢二钾0.5g；微量元素储备液2mL；水1L；琼脂15～20g；pH＝7.5。其中微量元素储备液包含：硫酸镁4g，硫酸铜1g，硫酸锰1g，硫酸铁1g，氯化钙1g，水1L。灭菌后放置4oC中保存备用。 

化感物质储备液:称取泽兰二酮和羟基泽兰酮10mg，溶于10mL丙酮中，即得1g/L(1mg/mL)的储备液。 

化感物质无机盐培养基:取一定量化感物质储备液于上述无机盐培养基中，使终浓度为1mg/L。 

化感物质无机盐固体培养基:在已制备好的无机盐固体培养基上，涂布100uL化感物质储备液。 

二、紫茎泽兰化感物质降解菌ZS3的鉴定 

从以下几个方面，鉴定用上述方法分离纯化得到的降解紫茎泽兰化感物质DDT和HHO的菌株ZS3。 

形态学鉴定：将处于对数生长期，且菌落大小稳定的降解菌ZS3进行单菌落形态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)；对于处于对数生长期的降解菌株ZS3，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。 

生理生化特征分析：参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.2011.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社)和《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.1999.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社)测定上述ZS3菌株的生理生化特征。 

结果：ZS3菌株细胞不规则杆状，长1～3μm，宽为0.4～1μm。常呈V形排列，端圆。杆状断裂成小球，直径0.5～1μm，单个，成对排列，不规则堆状。存在球杆周期。革兰氏阳性，不生孢，好氧，水解淀粉，氧化酶阴性，接触酶阳性。通过16s rDNA测序，及NCBI比对，我们发现菌株ZS3的16s rDNA序列与节杆菌属相似性达到99％。该菌株ZS3已于2014年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9283。 

实施例Ⅱ、节杆菌(Arthrobacter sp.)ZS3降解DDT和HHO能力定量测定 

一、化感物质DDT和HHO的标准曲线制作 

用HPLC级甲醇配置浓度分别为5、20、80、120、200μg/mL的DDT和HHO标准溶液。每个浓度进样3次，结果取平均值，以峰面积对浓度作图，绘制标准曲线。 

二、ZS3菌株降解DDT和HHO能力测定 

将菌株ZS3接入40mL营养培养基扩大培养2天，4000r/min离心5分钟，沉淀用1mL无菌水悬浮，采用平板计数法测定菌悬液浓度。取l00uL菌液接入10mL各含DDT和HHO 200ug的无机盐培养液中，摇床培养5天，取样测定两个化感物质的含量。 

DDT和HHO的萃取方法:DDT和HHO在水中的溶解度很低，实验采用的浓度远远大于其溶解度，因此在溶液中是以不均匀的晶体状态分布的，其浓度的测定必须整瓶样品全部萃取。选择正己烷为萃取剂，具体步骤如下:将培养液转移到50mL分液漏斗，用1/2培养液体积的正己烷洗涤三角瓶，洗液也转移至分液漏斗中，水平振荡5min，静置分层。将下层液(有机相)通过无水硫酸钠脱水(在一个小漏斗底部塞少许棉花，上面放约2g无水硫酸钠)后收集于鸡心瓶内；上层液(水相)再用1/2培养液体积的正己烷依前法再萃取一次，同样将下层 液脱水，收集于鸡心瓶内。鸡心瓶内的液体用旋转蒸发器40℃减压蒸发、浓缩至2mL，过-0.45μm的微孔滤膜，取1mL至色谱进样瓶。用超高效液相色谱仪测定。菌株的降解率用加有ZS3菌株处理中化感物质含量相对于对照处理中化感物质含量的减少百分比来表示，即(V _对照-V_ZS3)/V_对照×100。 

结果：化感物质DDT和HHO的初始浓度为100μg/mL时，5天后节杆菌ZS3对DDT和HHO的降解率分别为49.8％和56.6％。 

表1节杆菌ZS3降解化感物质DDT和HHO的效果 

化感物质 实验处理 初始含量(μg/mL) 5天残留量(μg/mL) 降解率％ DDT ZS3 100 48.4±84.3 49.8±8.6   空白对照 100 96.5±2.7   HHO ZS3 100 28.9±3.6 56.6±5.5   空白对照 100 66.6±3.2  

实施例Ⅲ、ZS3生防菌剂制备 

将生防菌株ZS3，用活化培养基进行活化；将灭菌的扩大培养基定量备用；活化后的菌种分别接种至灭菌处理过的扩大培养基中扩大培养，振荡培养1～5天；将菌液在4000～6000r/min离心10分钟，沉淀用灭菌水稀释成ZS3活菌总浓度为1×10⁹～1×10¹⁰CFU/ml的菌剂。 

菌剂制备中所使用的培养基： 

活化培养基：硝酸铵3g；磷酸二氢钾0.5g；磷酸氢二钾0.5g；微量元素储备液2ml；酵母提取物1g；水1L；DTD 1g；HHO1g；pH 7.0左右。微量元素储备液包含：硫酸镁4g，硫酸铜1g，硫酸锰1g，硫酸铁1g，氯化钙1g，水1L。 

扩大培养基：蛋白胨5g，酵母提取物1g，NaCl 2g；DTD 2g； HHO 2g；pH 7.0。 

实施例Ⅳ、应用实验 

用制备好的ZS3生防菌剂(浓度为10⁹～10¹⁰CFU/ml)以4mL/100g土的量喷施到50g生土中，然后在土壤上播种受体植物白菜种子。同时，设置不加生防菌剂的对照处理。每个处理8个重复，每个重复播种30粒白菜种子。24h后浇上10％的紫茎泽兰叶片淋溶液20mL，以及浇上同体积的水为空白对照。5天后，记录白菜的萌发数。化感作用以紫茎泽兰淋溶液处理后白菜种子萌发率相对于加水对照降低的百分比来表示，即E＝(V_水-V_淋溶液)/V_水×100。 

结果表明，喷施ZS3菌剂后紫茎泽兰的化感作用降低了46.8％。ZS3菌株对化感效应的影响通过接种生防菌土壤相对于未接种土壤的减少百分比来表示，即(E_对照-E_ZS3)/E_对照×100。 

表2添加和未添加节杆菌ZS3处理下紫茎泽兰对白菜的化感效应 

处理 化感效应(发芽率降低百分比％) ZS3 34.7±8.2 空白对照 65.3±8.2 化感效应减少百分比(％) 46.8