一种用于鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的特异引物组合

摘要

本发明提供了一种用于鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的特异引物组合，包括ZJJU01、ZJJU02、ZJJU03和ZJJU04，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示，本发明同时还提供了根据上述引物组合来鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的方法，步骤如下：首先提取目标植物基因组，然后以基因组为模板，用权利要求1所述的特异引物组合进行PCR检测。本发明根据能鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的ISSR引物扩增序列设计引物，通过PCR扩增，可以快速从其他水稻品种中鉴定三系杂交水稻不育系骏1A。本发明提供的三系杂交水稻不育系骏1A的鉴定方法，可用于上述水稻品种的纯度鉴定，进而在辅助其育种中进行应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种用于检测三系杂交水稻不育系骏1A 的特异引物组合。

背景技术

我国是世界上最大的杂交水稻种子生产国和消费国，具有庞大的杂交水稻种子市 场。目前国内杂交水稻年种植面积约占水稻年种植总面积的59％以上，使水稻产量大幅 度提高，为保障我国的粮食安全做出了重要贡献。获得高纯度的杂交种子是充分发挥杂 种优势增产潜力的基础。机械混杂和生物学混杂是三系杂交水稻亲本杂株的主要来源。 种子纯度是衡量杂交水稻种子质量的主要指标，纯度的下降将导致作物产量和质量的明 显降低。低纯度、真实性差的杂交水稻种子给农业生产带来极大损失，是种子质检部门、 育种研究单位、制种单位和种子公司共同关心的问题。三系杂交水稻不育系的纯度是制 约杂交稻生产的关键因素。

三系杂交水稻不育系“骏1A”为本申请人自主培育的，不育系“骏1A”与恢复系 “R0172”配组育成的三系杂交中稻品种“骏优172”，以及不育系“骏1A”与恢复系“R522” 配组育成的三系杂交早熟中稻品种“骏优522”，均已通过湖北省品种审定，抗稻瘟病， 米质优，是适合湖北省恩施州种植的农作物新品种。

在实现上述研发的过程中，本申请的发明人发现现有技术至少存在以下问题：

没有鉴定三系杂交水稻不育系“骏1A”的特异引物，无法将上述水稻品种与其亲本 区分开，不能对其进行快速的种子纯度分子标记鉴定和相关的分子标记辅助育种等工 作。

发明内容

本发明提供了一种用于鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的特异引物组合，解决了背 景技术中的问题，采用该引物组合能够快速、准确的对三系杂交水稻不育系骏1A进行 鉴定。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种用于鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的特异引物组合，包括ZJJU01、ZJJU02、 ZJJU03和ZJJU04，其中ZJJU01正向引物如序列表中SEQ ID NO.1： GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG；

ZJJU 01反向引物如序列表中SEQ ID NO.2：GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG；

ZJJU 02正向引物如序列表中SEQ ID NO.3：TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA；

ZJJU 02反向引物如序列表中SEQ ID NO.4：CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG；

ZJJU 03正向引物如序列表中SEQ ID NO.5：TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC；

ZJJU 03反向引物如序列表中SEQ ID NO.6：GTACCTCTTTTCGGCCAGGA；

ZJJU 04正向引物如序列表中SEQ ID NO.7：GGATAATCCGCATCAAGAAG；

ZJJU 04反向引物如序列表中SEQ ID NO.8：GGTCACCCGAGAATTGCAT。

本发明同时还提供了根据上述引物组合来鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的方法， 步骤如下：首先提取目标植物基因组，然后以基因组为模板，用权利要求1所述的特异 引物组合进行PCR检测。

所述的PCR反应条件为：95℃5min；95℃变性30s，65℃退火40s，其中每个循 环降低0.7℃，72℃延伸1min30s，15个循环；

94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，25个循环；72℃后延伸10min。

所述的PCR反应体系为：50ng/μl的DNA模板0.8μl，10×PCR缓冲液1μl，2.5mM  dNTPs 0.8μl，10μM正、反向引物各0.2μl，DNA聚合酶0.5U，ddH₂O补足至10μl。

本发明还提供了一种含有上述特异引物组合的检测试剂盒。

上述试剂盒能够在鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的纯度以及辅助其育种中进行应 用。

本发明根据能鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的ISSR引物扩增序列设计引物，通 过PCR扩增，可以快速从其他水稻品种中鉴定三系杂交水稻不育系骏1A。本发明提供 的三系杂交水稻不育系骏1A的鉴定方法，可用于上述水稻品种的纯度鉴定，进而在辅 助其育种中进行应用。

附图说明

图1为本实施例中通过PCR反应在水稻中的扩增结果图A

图2为本实施例中通过PCR反应在水稻中的扩增结果图B。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围 并不局限于以下实施例。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中 所述的条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。所用试剂均为市售商品。

本实施例提供的用于鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的特异引物组合，包括ZJJU01、 ZJJU02、ZJJU03和ZJJU04，其中ZJJU01正向引物如序列表中SEQ ID NO.1： GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG；

ZJJU 01反向引物如序列表中SEQ ID NO.2：GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG；

ZJJU 02正向引物如序列表中SEQ ID NO.3：TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA；

ZJJU 02反向引物如序列表中SEQ ID NO.4：CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG；

ZJJU 03正向引物如序列表中SEQ ID NO.5：TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC；

ZJJU 03反向引物如序列表中SEQ ID NO.6：GTACCTCTTTTCGGCCAGGA；

ZJJU 04正向引物如序列表中SEQ ID NO.7：GGATAATCCGCATCAAGAAG；

ZJJU 04反向引物如序列表中SEQ ID NO.8：GGTCACCCGAGAATTGCAT。

本实施例中采用上述引物组合来鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的方法，步骤如下：

1.实验材料

1.1植物材料

中骏优1及其亲本不育系418A、保持系418B和恢复系R964，中骏优1的相似 来源不育系中九A和保持系中九B；骏优522及其亲本不育系骏1A、保持系骏1B和恢 复系R522，骏优522的的相似来源不育系福伊A和保持系福伊B。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，TAKARA rTaq DNA聚合酶，10×PCR缓冲液，dNTP  Mixture(2.5mM)购自大连宝生物公司。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合 成。

1.3实验仪器

振荡破碎仪(Geno/grinder,USA)；

PCR扩增仪：PTC-100TM(MJ,USA)；

核酸电泳仪：DYYIII型YY0115-94(北京六一仪器厂)；

DNA电泳分析系统：GeneSnap凝胶成像分析系统；

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱 等。

2.实验方法

2.1水稻基因组DNA的提取

水稻单粒种植，取幼嫩叶片作为DNA提取材料，依照参照冷泉港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版、Nina Irwin和Kaaren A.Janssen编著的 《分子克隆》一书提取水稻材料的总DNA。

2.2PCR扩增

根据能鉴定三系杂交水稻不育系骏1A及其组合的ISSR引物扩增序列设计的特异 引物，利用该4对引物组合，以水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增.

PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液1μl，2.5mM dNTPs 0.6μl，10μM正、反 向引物各0.2μl，DNA聚合酶0.5U，50ng/μl DNA模板0.5μl，ddH 2O补足至10μl。

PCR扩增程序：95℃5min；95℃变性30s，65℃退火40s，(其中每个循环降低0.7℃) 72℃延伸1min30s，15个循环；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，25个循 环；72℃后延伸10min。

3.实验结果

扩增均以无菌水为阴性对照，只有当阴性对照扩增无任何带型，则说明PCR结果 可靠。统计被检测材料的扩增带，阴性计为0，阳性计为1。统计结果和聚类分析结果 如下表以及图1和图2所示。结果表明，本发明的4对分子标记组合可以将三系杂交水 稻不育系骏1A与其组合区分开。

4对分子标记引物组合扩增2个三系杂交水稻组合的指纹图谱统计