鸡抗病新品系的培育方法及与鸡抗病能力相关的SNP标记

摘要

本发明提供了一种鸡抗病新品系的培育方法及与鸡抗病能力相关的SNP标记。所述SNP标记多态性与异嗜性粒细胞/淋巴细胞的比值显著相关，可应用于鸡抗病新品系育种，通过异嗜性粒细胞/淋巴细胞的比值表型选择与SNP标记基因型辅助选择相结合，建立鸡抗病新品系选育技术。

说明书

技术领域

本发明涉及SNP分子标记及家禽育种，具体地说，涉及鸡抗病新 品系的培育方法及与鸡抗病能力相关的SNP标记。

背景技术

禽病每年给家禽养殖业造成的经济损失十分巨大。采用遗传改良 方法从本质上提高鸡对病原的抗性，进行抗病育种，是禽病防治的有 效途径之一。

与鸡抗病性有关的生化指标较多，包括抗体含量、血清介质水平、 淋巴细胞转化率等。有些指标与特定病原有关，代表性较差，有些指 标受环境、品种和营养等因素影响，变异范围大，很难应用于抗病鸡 的新品系选育中。因此，抗病家禽新品系选育始终是育种中的一个难 题。

异嗜性粒细胞在细胞免疫中起到抵抗外间微生物入侵第一道屏 障的作用。淋巴细胞和异嗜性粒细胞在鸡体液免疫、细胞免疫反应中 均起到重要作用。异嗜性粒细胞/淋巴细胞的比值(heterophil /lymphocyte,H/L)已知与家禽抗应激程度相关(Gross和Siegel， 1986)。H/L值越低指示鸡抗应激能力较强。但目前尚未见到在DNA 分子水平上与异嗜性粒细胞/淋巴细胞比率相关的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与鸡 抗病能力相关的SNP标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种与鸡抗病能力相关的 SNP标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，在第1832位有1 个A1832-G1832碱基突变，所述SNP标记的多态性与异嗜性粒细胞/ 淋巴细胞的比值显著相关，并与鸡抗病能力相关。

本发明还提供了用于检测所述SNP标记的引物对，所述引物对含 有正向引物F：5’-TGAACTTCCTGAAATGGGT-3’和反向引物R：5’- GGTGTGTGGCATATCATTG-3’。

本发明还提供了所述SNP标记在选择抗病能力强的鸡品系(种) 中的应用。

进一步地，所述应用包括以下步骤：

(1)提取待测鸡的基因组DNA；

(2)以待测鸡的基因组DNA为模版，利用引物F和R，通过PCR 反应扩增出鸡Toll样受体4基因(TLR4)73bp片段(如SEQ ID No.2所 示)，其中，

F:5’-TGAACTTCCTGAAATGGGT-3’；

R:5’-GGTGTGTGGCATATCATTG-3’；

(3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中43bp处的碱基 为A，则待测鸡属于抗病能力强的个体。

其中，PCR反应体系以50μl计为：

PCR反应条件为：94℃10min,95℃50s，58℃30s，72℃30s，共 32个循环；72℃10min。

本发明还提供了所述SNP标记在鸡抗病新品系育种中的应用。

进一步地，所述应用包括以下步骤：

(一)采用聚合酶链式反应和测序技术筛选到与鸡异嗜性粒细胞 /淋巴细胞比率相关的SNP标记；

(二)检测待测鸡的SNP标记基因型；

(三)根据基因型进行抗病能力优势品系(种)的选育。

本发明进一步提供一种鸡抗病新品系的培育方法，所述方法为通 过待测鸡血液中异嗜性粒细胞/淋巴细胞的比值(H/L)与所述SNP标 记共同对抗病能力优势个体进行选育。

进一步地，所述培育方法包括以下步骤：

(a)对候选个体采血，测定血液中异嗜性粒细胞/淋巴细胞的比 值，同时采血提取基因组DNA，测定SNP标记1832bp位点的碱基状态；

(b)留种时，首先利用异嗜性粒细胞/淋巴细胞的比值进行优势 双亲个体的选择，其次查看SNP A1832G的多态性，避免选择GG型个 体；

(c)按照每个世代不低于30只公鸡，公母比例不低于1:3的留种 数量组建新的家系和繁种。

进一步地，所述候选个体数量不小于500只，其中公鸡所占比例 不高于1/3，所述优势个体的选择为由低到高选择异嗜性粒细胞/淋巴 细胞的比值较低的个体。

更进一步地，所述培育方法包括以下步骤：

(a)对55-60日龄的候选个体翅下静脉采血，制作血液涂片，测 定异嗜性粒细胞/淋巴细胞的比值；同时取静脉血，制成抗凝血，提 取基因组DNA，测定SNP标记1832bp位点的碱基状态；

(b)留种时，首先利用异嗜性粒细胞/淋巴细胞的比值进行优势 双亲个体的选择；其次查看SNP A1832G的多态性，避免选择GG型个 体；

(c)按照每个世代不低于30只公鸡，公母比例1:3的留种数量组 建新的家系和繁种。

进一步地，所述H/L值的测定方法为：血涂片用改良的瑞氏和吉 姆萨复合染色溶液染色，然后用PBS缓冲液冲洗，晾干，滴一滴松柏 油，盖上盖玻片，在100倍油镜下成“Z”字型轨迹计数，淋巴细胞、异 嗜性粒细胞和单核细胞共计100个，计算H/L比值

所述SNP标记测定方法为：待测鸡的基因组为模板，用正向引物 F：5’-TGAACTTCCTGAAATGGGT-3’和反向引物R：5’- GGTGTGTGGCATATCATTG-3’进行PCR扩增。根据DNA测序结果， 统计SNP A1832G位点SNP多态性。

其中，PCR反应体系以50μl计为：

PCR反应条件为：94℃10min,95℃50s，58℃30s，72℃30s，共 32个循环；72℃10min。

该方法具有操作简便、检测费用低廉、准确的特点，且选出的抗 性品系(种)遗传稳定性良好。

本发明的有益效果在于：

本发明经过多年科技攻关，针对这一异嗜性粒细胞/淋巴细胞的 比值作为抗病指标的应用效果进行评价，并找到了与该异嗜性粒细胞 /淋巴细胞的比值显著相关的SNP分子标记。在抗病鸡育种中，应用分 子标记筛选与H/L表型选择结合，成功建立了鸡抗病新品系选育技术。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 与H/L比值相关SNP位点的获得与鉴定

随机对87只白来航鸡和94只京星黄鸡父系鸡进行SNP A1832G位 点分型。

具体为，对55-60日龄的待测鸡翅下静脉采血，制成抗凝血，提 取基因组DNA，以待测鸡的基因组为模板，用正向引物F：5’- TGAACTTCCTGAAATGGGT-3’和反向引物R：5’- GGTGTGTGGCATATCATTG-3’进行PCR扩增。对扩增得到的鸡Toll 样受体4基因73bp片段进行测序，根据扩增产物序列中43bp处的碱基 为A或G统计SNP A1832G位点SNP多态性，进行基因型分型。

其中，PCR反应体系以50μl计为：

PCR反应条件为：94℃10min,95℃50s，58℃30s，72℃30s，共 32个循环；72℃10min。

统计结果发现，在两个群体中均存在两种等位基因，三种基因型， 其中检测群体中各基因型频率分别为，AA型为20％-26％；AG型为 36％-50％；GG型为36％-30％。进一步与H/L表型值进行关联分析，该 位点与H/L值极显著相关(p<0.01)，各基因型鸡群的表型平均值如表 1所示。可见AA型为优势等位基因，具有该基因型的鸡群H/L值相对 较低，约为0.3；在选育中应避免使用GG型鸡，其H/L值较高，为 0.44-0.47；结合H/L表型值适当选用杂合AG型，H/L值在0.33-0.36左 右。

表1 白来航鸡和京星黄鸡父系鸡各基因型群体的H/L值情况

品系/基因型 AA AG GG 京星黄鸡父系鸡 0.29±0.01 0.33±0.02 0.44±0.01 白来航鸡 0.30±0.01 0.36±0.02 0.47±0.01

注：数据的表示方式为：平均值±标准误。数据均为H/L比值，即异嗜性粒细胞 和淋巴细胞的比值。

实施例2 白来航鸡各世代H/L选择效果

试验鸡群为来航蛋鸡B系，饲养于中国农科院北京畜牧兽医研究 所昌平养殖基地。基础群来自150只公鸡和450只母鸡，组群的方法 是每个世代在56日龄测定所有个体的H/L值，然后由低到高选择H/L 比值较低的个体；其次检测并查看SNP A1832G的多态性，避免选 择GG型个体。

建立30只公鸡家系，每个家系中公母比例为1:3只繁殖下一世 代。每个世代执行同样的选择方法，在繁种家系建立过程中避免近交。 随机选取其中部分鸡群进行选择效果分析，结果如表2所示，可以看 出，每个世代的H/L比率逐渐降低，选择效果良好。

表2 来航鸡的H/L比值选择进展检测

注：数据的表示方式为：平均值±标准误。H/L表示异嗜性粒细胞和淋巴细胞的

比值。H表示异嗜性粒细胞个数，L表示淋巴细胞数。

实施例3 京星黄鸡各世代H/L选择效果

试验鸡群为京星黄鸡父系鸡，饲养于中国农科院北京畜牧兽医研 究所昌平养殖基地。基础群来自200只公鸡和500只母鸡，组群的方 法是：每个世代在60日龄测定所有个体的H/L值，然后由低到高选 择H/L比值较低的个体。其次查看SNP A1832G的多态性，避免选 择GG型个体。

最终选择30-45只公鸡组建家系，每个家系中公母比例为1:3-4 只繁殖下一世代。同时每一代均设有对照组，对照组采用混合输精繁 殖下一代。每个世代执行同样的选择方法，在繁种家系建立过程中避 免近交。

选择效果分析如表3所示，每个世代的H/L比值在选择系中逐渐 降低，选择效果良好。

表3 京星黄鸡每个世代的H/L测定结果和选择进展

注：数据的表示方式为：平均值±标准误.。H/L表示异嗜性粒细胞和淋巴细胞的 比值。H表示异嗜性粒细胞数，L表示淋巴细胞数。

实施例4 低H/L选择使京星黄羽肉鸡父系免疫力和生产性能提高

将实施例3中的群体，经过3个世代的H/L单向选择，对G3代 选择系鸡和对照系鸡的群免疫性状和生产性能进行检测和比较。结果 如表4所示。H/L比值、淋巴细胞数、免疫球蛋白IgG和60日龄的 体重在选择系中显著(P<0.05)的高于对照系，异嗜性粒细胞数显著 (P<0.05)低于对照组。SRBC和AI抗体滴度在选择系中的值高于 对照系。免疫球蛋白IgG和SRBC抗体滴度的提高，指示经选择后的 鸡群的一般抗病水平提高、AI滴度的升高代表抗禽流感水平有所增 强。因此，说明利用H/L比值这一指标，结合SNP位点基因型进行 抗病育种选择，可以选择出抗病力较强的鸡的新品系。也同时证明， H/L比值可作为鸡抗病能力的评价指标之一。

表4 选择3个世代后与对照组免疫、生长指标的比较

注：数据的表示方式是平均值±标准误，同列中不同字母上标表示差异显著达到 P<0.05水平，H/L表示异嗜性粒细胞和淋巴细胞的比值。H表示异嗜性粒细胞 数，L表示淋巴细胞数，AI，表示禽流感的抗体滴度，IgG表示免疫球蛋白G， 单位是毫克每毫升(mg/ml)，体重表示是60日龄时的鸡的活重。n表示样本量。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。