用于测定食物样品中产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的存在或不存在的方法

摘要

本发明涉及将在短时间段内产生关于食物样品中的致病性STEC(产志贺毒素大肠杆菌)的存在或不存在的可靠结果的方法。该方法包括-使食物样品在允许大肠杆菌生长的培养基中温育，以获得大肠杆菌储液培养基；-执行储液培养基中的大肠杆菌裂解，以获得包含大肠杆菌DNA的样品溶液；和-使用扩增下述大肠杆菌基因或其片段的引物，对样品溶液实施第一系列的聚合酶链反应(PCR)：●分别编码志贺毒素1和志贺毒素2的stx1和/或stx2，●对于待测定的每个STEC血清群，编码紧密粘附素的该血清群的eae基因的亚型，和●对于待测定的每个STEC血清群，对于该血清群特异性的生物标记基因；并且在第一系列的PCR中扩增stx1和/或stx2以及至少一个血清群的eae基因和特异性生物标记基因的情况下：-通过对大肠杆菌储液培养基的浓缩物执行第二系列的PCR，和任选地，对衍生自浓缩物的单一大肠杆菌菌落执行第三系列的PCR，验证STEC的一个或多个特异性血清群的存在。

说明书

发明领域

本发明涉及用于测定食物样品中产志贺毒素大肠杆菌(Escherichia coli)(STEC)的存在或不存在的方法，在此类方法中使用的反应盒，以及容纳反应盒的仪器。 

发明背景 

在STEC的菌株中，已鉴定了与人的严重疾病相关的七个血清群，即O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145。这些血清群在下文中被称为STEC Top7。美国农业部(United States Department of Agriculture)(USDA)已实施可应用于某些生牛肉产品的分析的法规，该法规将除血清群O157之外的如上鉴定的六种其他血清群定义为掺杂物。 

当测定这些STEC菌株的存在或不存在时，通常将食物样品加入允许大肠杆菌生长的培养基中，以提供大肠杆菌储液培养基。 

随后，储液培养基中的大肠杆菌的裂解提供了包含大肠杆菌DNA的样品溶液。 

使用常规方法以可靠方式在样品中对上述血清群的后续检测是耗时操作。 

在ISO13136技术规范(ISO/TS13136:2012)中阐述使用聚合酶链反应(PCR)用于检测主要STEC毒力基因stx1、stx2、eae和血清群特异性基因。PCR阳性样品必须通过培养方法加以证实，因为不同的基因可以属于不同的菌株，导致假阳性结果。 

发明概述 

本发明的目的是提供在更短的时间段内产生关于食物样品中致病性STEC的存在或不存在的可靠结果的方法。 

这个目的通过如权利要求1中所述的方法得到解决。 

令人惊讶的是，由于其特定的工作流程，根据本发明的方法允许假阳性结果率的降低以及菌落分离的优化。由此可以显著简化食物样品中产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的一个或多个特异性血清群的存在或不存在的测定。 

更具体而言，本发明提供了以非常有时间效率的方式用于鉴定和证实食物样品中高致病性STEC的存在或不存在的方法，在所述方法中，通过使食物样品在培养基中温育而获得大肠杆菌储液培养基以及裂解储液培养基中含有的大肠杆菌后，对这种含DNA的样品溶液实施使用特异性引物的第一系列的PCR反应。这可以称为第一筛选步骤。该第一筛选步骤允许同时检测编码志贺毒素的stx1和/或stx2毒力基因、编码与一个或多个血清群特异性相关的紧密粘附素(intimin)的eae亚型、以及每个血清群的生物标记基因。 

随后，假定的阳性标品将必须加以证实。 

eae亚型的检测允许基本上减少假阳性样品的数目。 

在优选实施方案中，对阳性样品实施第二筛选步骤，其中衍生自大肠杆菌储液培养基的免疫浓缩物再一次在PCR分析中进行检查。 

在该第二筛选步骤获得阳性结果的情况下，将免疫浓缩物的部分在显色培养基上铺平板，以将各自STEC菌株分离为菌落。 

衍生自这些分离的菌落的DNA可以进行PCR测试，以证实stx和eae毒力基因以及任选地血清群生物标记基因的存在。 

在阴性样品的情况下，最终结果在从食物样品开始的约12小时内是可获得的。在阳性样品的情况下，最终结果在约2天内是可获得的。 

此外，本发明还涉及设计用于上文概述的本发明方法中的根据权利要求13的反应盒。 

本发明的另一个方面在于权利要求15中限定的仪器。 

发明详述 

优选地，本发明的方法包括验证STEC的一个或多个特异性血清群的存在，其包括 

-使用针对各自血清群的STEC的抗体，对于每个血清群具有温育的食物样品的培养基执行免疫浓缩； 

-从免疫浓缩物中分离DNA；和 

-使用扩增下述大肠杆菌基因或其片段的引物，对DNA实施第二系列的PCR： 

●stx1和/或stx2， 

●各自血清群的eae基因的亚型，和 

●任选地，对于各自血清群特异性的生物标记基因。 

更优选地，在第二系列的PCR中扩增stx1和/或stx2以及eae基因的情况下，STEC的一个或多个特异性血清群的存在的验证进一步包括： 

-在显色培养基上铺平板免疫浓缩物，以允许分离的大肠杆菌菌落的生长； 

-从分离的菌落中分离DNA；和 

-使用扩增下述大肠杆菌基因或其片段的引物，对DNA实施第三系列的PCR： 

●stx1和/或stx2， 

●各自血清群的eae基因的亚型，和 

●任选地，对于各自血清群特异性的生物标记基因。 

优选地，用特异性标记的DNA探针执行系列的PCR，以允许检测扩增的基因或其片段。 

根据本发明，待测定的特异性血清群优选地选自O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145。 

虽然本发明的方法允许鉴定一个或几个特异性血清群，但更优选地，该方法包括在一步中测定所有血清群O157、O26、O45、O103、 O111、O121和O145的存在或不存在。 

此外，优选从下述中选择在系列的PCR中扩增的eae基因的亚型：关于O26的eaeβ，关于O145和O157的eaeγ，关于O45、O103和O121的eaeε，以及关于O111的eaeθ。 

当执行本发明的方法时，优选地特异性生物标记基因选自各自血清群的O-抗原转运蛋白基因。 

虽然本发明的方法可应用于广泛范围的食物样品，但优选地，食物样品选自生肉、生乳制品或生蔬菜制品特别是芽。 

用于温育步骤的培养基优选地选自缓冲蛋白胨水，任选包含吖啶黄素；胰蛋白酶大豆培养汤(TSB)，任选包含新生霉素(novobiocine)；和经修饰的胰蛋白酶大豆培养汤(mTSB)，任选包含新生霉素。 

本发明的方法优选以自动化方式同时执行每个系列的PCR，从而使得用于PCR的装置允许最终结果的自动评估和指示。 

依照本发明方法的优选变体，用于免疫浓缩的抗体选自单克隆抗体或多克隆抗体。 

用于将免疫浓缩物铺平板的显色培养基优选地选自头孢克肟-亚碲酸盐山梨糖醇麦康凯(Cefixime-Tellurite Sorbitol McConkey)(CT-SMAC)；含有新生霉素、头孢克肟三水合物和亚碲酸钾的改良彩虹琼脂(mRBA)；胰蛋白胨胆汁X葡糖苷酸培养基(TBX)；和头孢克肟-亚碲酸盐鼠李糖麦康凯(Cefixime-Tellurite Rhamnose McConkey)(CT-RMAC)。 

本发明还涉及特别适合用于本发明的方法中的反应盒。 

此类反应盒设计用于对含DNA样品溶液执行系列的PCR，并且包括多个反应室和储库。样品溶液可以进料到储库内，并且经由连接每个反应室与储库的导管均匀分布到反应室内。反应室的至少一些预装载有引物和探针，以扩增下述大肠杆菌基因或其片段： 

-stx1和/或stx2， 

-选自O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145的一个或多个血清群的eae基因的亚型，和 

-任选地，对于选自O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145的一个或多个血清群特异性的生物标记基因。 

此外，本发明还涉及自动执行系列的PCR的仪器，其中该仪器适合于容纳上述反应盒。该仪器包括 

-借助于各自探针，用于检测扩增的大肠杆菌基因的检测工具； 

-用于控制PCR执行的控制工具，其中软件储存于控制工具中，所述软件能够根据算法评估检测到的大肠杆菌基因，从而使得对于每个血清群生成最终结果，其取决于关于stx1和/或stx2、该血清群的eae基因的亚型和任选地对于该血清群特异性的生物标记基因的检测结果；和 

-用于在光学和/或听觉上指示每个血清群的最终结果的指示器工具。 

本发明的上述方面和优点在下文与附图和具体实施例结合更详细地公开。 

附图简述 

在附图中： 

图1显示与现有技术方法(ISO13136技术规范)比较的本发明方法； 

图2显示与其他现有技术方法比较的本发明方法； 

图3显示根据本发明的用于PCR分析的仪器的图示； 

图4显示本发明的PCR反应盒的横断面视图； 

图5显示本发明的PCR反应盒的顶视图；和 

图6显示用于生成作为PCR结果的函数的最终结果的算法的流程图。 

附图和实施例详述 

图1在左侧上显示关于名称为STEC Top7的本发明方法的优选工作流程。在右侧上显示对应于ISO/TS13136:2012的常规工作流程。 

两种方法均以食物样品开始，所述食物样品已在允许大肠杆菌生长的培养基中温育，导致富集的样品(大肠杆菌储液培养基)。 

后续，执行在培养基中生长的大肠杆菌的裂解例如在96管的裂解平板(未示出)中，以便获得包含大肠杆菌DNA的样品溶液。 

迄今为止操作对于本发明方法和常规工作流程是相同的。 

根据本发明工作流程，使用扩增特异性大肠杆菌基因或其片段的引物和探针，对样品溶液实施第一系列的聚合酶链反应(PCR)。优选地，如图1中所示，工作流程在该步骤包括所有STEC Top7的扩增，即关于O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145各自的stx1、stx2、eae变体(亚型)和生物标记基因。在不存在这些血清群中任一个的情况下，本发明工作流程在约12小时或更少的时期内终止(温育和裂解约11小时和PCR约1小时)。 

在报告阳性结果的情况下，使用针对各自的一个或多个血清群的STEC的抗体制备大肠杆菌储液培养基的免疫浓缩物，随后 

-从免疫浓缩物中分离DNA；和 

-使用扩增下述大肠杆菌基因或其片段的引物，对DNA实施第二系列的PCR： 

●stx1和/或stx2， 

●各自血清群的eae基因的亚型，和 

●任选地，对于各自血清群特异性的生物标记基因。 

如果获得阴性结果，则工作流程可以终止。 

在获得阳性结果的情况下，优选地，将免疫浓缩物另外铺平板到显色培养基上，以允许分离的大肠杆菌菌落的生长。在进一步的步骤中，从分离的菌落中分离DNA，并且使用扩增大肠杆菌基因或其片段的引物，实施第三系列的PCR。由此，可以鉴定致病性STEC的血清群。在此类情况下，最终结果在约2天或更少时间内可获得。 

根据常规ISO/TS13136:2012的工作流程不同于本发明方法之处在于第一筛选针对stx和一般的eae基因。在第二筛选步骤中，仅覆盖STEC Top5，而本发明的方法可以覆盖所有Top7血清群。 

在第一阶段仅获得阴性结果的情况下，常规工作流程需要约24小时。在必须证实阳性结果的情况下，工作流程花费约4天。 

图2显示与如由Microbiology Laboratory Guidebook of the US-Department of Agriculture，第3版，1998(MLG5&MLG5B.01)提出的方法(其在仅获得阴性结果的情况下，需要约24小时，并且需要约3天证实阳性结果)相比较的本发明方法。 

图3显示了适合于执行本发明方法的PCR的仪器10的图示。 

仪器10包括优选盘状配置的反应盒12，其具有在其外周上的多个反应室或孔14和在中央位置中的储库16，所述反应室14经由径向延长的管道18与储库连接。 

此类优选反应盒12在下文中也被称为“GeneDisc”，在图4和5中更详细地显示。 

反应盒12的孔14的典型数目为三十六。孔14可以分组为多个扇区19例如六个扇区(被称为GeneDisc扇区)。一组扇区19的孔14可以经由个别通道18与储库16的共同分区22连接。 

此类盒12可以进行修饰，以提供本发明的盒，其中反应室14中的至少一些预装载有引物和探针，以扩增stx1和/或stx2、和选自O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145的一个或多个血清群的eae基因的亚型，或各自基因的片段。优选地，反应器14也预装载有引物和探针以扩增对于这些血清群中的一个或多个特异性的生物标记基因。 

仪器10进一步包括具有四个不同区(其中三个区26、27、28是可见的)的优选环状的加热装置24，其可以加热至四个不同温度。反应盒12置于加热装置24之上。反应盒12的孔14放置接近于加热装置24或与加热装置24接触。 

仪器10包括用于旋转反应盒12的工具30，其就加热装置24而言允许在反应室或孔14的温度的循环变化。 

加热装置24的每个区中的温度可以是均一的，或必要时，温度可以沿着梯度改变。 

仪器10进一步包括设置在盒12上方的荧光激发和检测工具32，以便对于每个循环激发并测量反应室14的内容物的荧光。 

此类仪器10详细公开于WO2002/009877A1中，并且可作为GeneDisc Cycler(Pall GeneDisc Technologies)获得。 

通常，每个PCR循环要求其中孔加热至约95℃的温度以使靶DNA变性的第一时期，随后使用约55℃至约65℃的温度用于引物退火的第二时期，和通常在约72℃下进行的用于DNA链延长的第三时期。然而，PCR可以依照本发明方法用简化循环进行，其中退火和延伸在相同温度下进行，从而使得每个循环仅需要两个不同温度。仪器10的加热装置24的单个区设为实现此类温度。 

优选地，对于待扩增的靶序列特异性的引物和探针预分布在反应室或孔14中。储库16或其分区意欲接受由待分析的核酸样品和聚合酶链扩增反应所需的试剂(除了引物和探针之外)组成的流体。 

在优选变化中，能够将来自储库的含有待分析的核酸样品和PCR所需的试剂的流体分布在含有用于待扩增的靶核酸序列的特异性引物和探针的多个反应室中，并且借助于包括所述反应室14和所述加热装置24(具有可以加热至不同温度的四个不同区)的反应盒12的循环相对运动，通过连续多次对室的内容物顺序实施不同温度(即变性、退火和延伸所需的那些)引起扩增过程。 

必要时，反应室14可以含有除上述引物外的实时PCR反应所需的试剂。在仪器的优选实施方案中，除引物之外，反应室14还包含对于待扩增的序列特异性的一种或多种探针。探针在反应室14中的分布还可以是这样的，从而使得某些室包含对于待扩增的序列特异性的探针，并且其他室包含不先验识别待扩增的序列的对照探针。这些探针可以进行标记，并且如果多种探针存在于一个和相同反应室(例如对于待扩增的序列特异性的探针和对照探针)中，则这些探针优选用不同荧光团进行标记。 

优选地，通过仪器10以自动方式进行并评估PCR反应，即在反应盒12已插入仪器10内之后无需用户干预。借助于荧光标记的探针， 扩增的序列可以通过如上所述的检测工具32进行检测，并且待扩增的每个序列的结果可以对用户指示。 

在优选实施方案中，仪器10根据本发明进行修饰，并且进一步包括不仅控制PCR执行，还用于评估由检测工具32检测的扩增序列的控制工具，以给用户提供最终结果。 

当执行本发明方法时，根据算法评估对应于检测到的大肠杆菌基因的来自检测工具32的输入信号，从而使得取决于关于stx1和/或stx2、该血清群的eae基因的亚型和任选地对于该血清群特异性的生物标记基因的检测结果，对于每个血清群通过改良仪器10生成最终结果。 

改良仪器10中实现的优选算法的简化工作流程显示于图6中。在这种情况下，评估关于stx、给定血清群的eae变体(亚型)和生物标记基因的PCR结果。PCR结果可以是“阳性的”、“阴性的”或“不可用的”。在该算法中，编码志贺毒素的stx基因是优先靶，从而使得关于这些基因的阴性PCR结果导致阴性最终结果，不管eae和生物标记基因的PCR结果是什么。最终结果可以是“阳性的”(存在STEC)、“阴性的”(不存在STEC)或“无效的”(在所述情况下，测定法应重复)。阳性最终结果需要关于所有三种靶基因的阳性PCR结果。 

算法通过储存于根据本发明的改良仪器10的控制工具中的软件执行。 

本发明的仪器10进一步包括指示器，例如用于在光学和/或听觉上指示例如显示每个STEC血清群的最终结果的显示工具(未示出)。 

实施例

样品制备 

待检查产志贺毒素大肠杆菌的一个或多个特异性血清群的存在或不存在的食物样品，在41.5±1℃下预加温的常规培养基(例如缓冲蛋白胨水)中温育，以允许大肠杆菌的生长，获得富集的样品(大肠杆菌储液培养基)。将50μL份的富集的样品转移到包含96管的预填充 的裂解平板内，所述管各自预填充有500μL在水中稀释至按重量计20％的Chelex-100。在用铝片封闭管后，将裂解平板在预加热至102±2℃的热块中放置10分钟。当裂解步骤完成时，铝片用尖端刺穿，以收集36μL份的裂解产物，将所述裂解产物转移至6扇区的盘状反应盒中。 

将剩余大肠杆菌储液培养基贮存于5±3℃下用于后续验证步骤。 

GeneDisc PCR测定法 

允许裂解产物在室温下静置5分钟，随后装载到反应盒(即一份样品/扇区)内。该STEC Top7GeneDisc的每个扇区包含6个单独孔，所述孔含有允许检测14种靶基因的脱水的引物和探针(参见表1和2，其中血清群代表各自的生物标记基因)。 

通过使用由下述两种荧光团(报道物)之一标记的探针进行PCR产物的荧光检测：FAM(＝羧基荧光素)和ROX(＝羧基罗丹明)，从而使得每个孔可以用于扩增两种或三种基因。 

表1：STEC Top7GeneDisc扇区的配置。 

孔ID 报道物FAM 报道物ROX 1 O145 抑制对照 2 eaeε stx1&stx2 3 eaeβ eaeγ 4 eaeθ O111 5 O157 O26 6   O45/O103/O121

表2：用于GeneDisc测定法中的引物和探针的序列ID编号。核苷酸序列公开于所附序列表中。 

引物和探针的指名 序列ID编号 抑制对照正向引物 SEQ ID NO：1 抑制对照反向引物 SEQ ID NO：2 抑制对照探针 SEQ ID NO：3 O26正向引物 SEQ ID NO：4 O26反向引物 SEQ ID NO：5 O26探针 SEQ ID NO：6 O45正向引物 SEQ ID NO：7 O45反向引物 SEQ ID NO：8

[0111] 

O45探针 SEQ ID NO：9 O103正向引物 SEQ ID NO：10 O103反向引物 SEQ ID NO：11 O103探针 SEQ ID NO：12 O111正向引物 SEQ ID NO：13 O111反向引物 SEQ ID NO：14 O111探针 SEQ ID NO：15 O121正向引物 SEQ ID NO：16 O121反向引物 SEQ ID NO：17 O121探针 SEQ ID NO：18 O145正向引物 SEQ ID NO：19 O145反向引物 SEQ ID NO：20 O145探针 SEQ ID NO：21 O157正向引物 SEQ ID NO：22 O157反向引物 SEQ ID NO：23 O157探针 SEQ ID NO：24 eaeβ正向引物 SEQ ID NO：25 eaeβ反向引物 SEQ ID NO：26 eaeβ探针 SEQ ID NO：27 eaeγ正向引物 SEQ ID NO：28 eaeγ反向引物 SEQ ID NO：29 eaeγ探针 SEQ ID NO：30 eaeθ正向引物 SEQ ID NO：31 eaeθ反向引物 SEQ ID NO：32 eaeθ探针 SEQ ID NO：33 eaeε正向引物 SEQ ID NO：34 eaeε反向引物1 SEQ ID NO：35 eaeε反向引物2 SEQ ID NO：36 eaeε探针 SEQ ID NO：37 stx1正向引物 SEQ ID NO：38 stx2正向引物 SEQ ID NO：39 stx1反向引物 SEQ ID NO：40 stx2反向引物1 SEQ ID NO：41 stx2反向引物2 SEQ ID NO：42 stx2探针 SEQ ID NO：43 stx1探针 SEQ ID NO：44

对于每份样品，通过荧光检测获得的不同靶基因的PCR结果通过 在GeneDisc Cycler中运行的软件根据算法进行评估。表3显示作为对于给定血清群的PCR结果的函数结果的算法。在该算法中，stx1和stx2是优先靶，从而使得关于这些基因的阴性PCR结果导致阴性最终结果，不管eae和生物标记基因的PCR结果是什么。 

表3：用于评估PCR结果的算法。 

完全自动化的PCR评估允许指示，尤其是显示关于待检测的STEC Top7血清群中每一种的最终结果，从而使得用户无需自身评估单一基因的PCR结果。最终结果优选显示为色码，即关于STEC血清群不存在的绿色，关于STEC血清群存在的红色，和关于无效结果(在所述情况下，测定法应重复)的灰色。 

抑制对照的另外评估可以指示PCR抑制剂存在于样品溶液中，在所述情况下测定法应在1:10稀释后重复。 

免疫浓缩-PCR(IMC-PCR) 

在GeneDisc测定法中的阳性PCR结果的情况下，使100μL-1mL富集的样品与对于假定阳性的STEC Top7之一的特异性抗体一起温育，以制备免疫浓缩物。在1-4个洗涤步骤后，浓缩的细胞(免疫浓缩物)用包含按重量计0.05％Tween20的PBS进行洗脱。一半细胞用于使用STEC Top7GeneDisc平板的PCR分析。在关于靶基因的阳性结果的情况下，细胞的剩余部分在特异性显色琼脂培养基上铺平板。高达6个分离的菌落用STEC Top7GeneDisc进行测试，用于最终证 实。 

本发明方法(在下文中也称为“GeneDisc STEC Top7方法”)对生牛肉(25g和375g)和生乳制品(25g)进行测试。 

实施例1：生牛肉(25g) 

GeneDisc STEC Top7方法对在法国92个百货公司(departments)的超市中收集的2,476份新鲜碎牛肉样品进行评估。将25g每份样品与225mL缓冲蛋白胨水混合，随后在37℃下温育18小时至24小时。在PCR筛选后，根据ISO13136技术规范推荐，从PCR阳性样品执行通过直接铺平板的细菌分离。该研究的目的是比较ISO13136技术规范中所述的筛选方法(stx、eae和血清群)与包括eae变体(亚型)代替一般的eae基因的STEC Top7筛选方法。结果在表4中报告。 

表4：整个GeneDisc STEC Top7方法对于2,476份天然污染的新鲜碎牛肉样品的评估。 

该实施例证实与血清群编码基因相关的eae变体基因和stx基因的第一筛选允许使PCR阳性样品数目从84显著降低到29。事实上，关于ISO13136方法和GeneDisc STEC Top7方法的PCR阳性样品率分别为3.4和1.2％。 

实施例2：生乳制品(25g) 

GeneDisc STEC Top7方法对包括1,072生乳样品和376份生乳酪的1,448份生乳制品进行评估。将25g每份样品在补充有新生霉素(10mg/L)的225mL缓冲蛋白胨水中进行稀释。样品在37℃下温育18小时±2小时。该实施例的目的是比较ISO13136技术规范中所述的筛选方法(stx、eae和血清群)与包括eae变体代替一般的eae基因的STEC Top7筛选方法。结果在表5中报告。 

表5：整个GeneDisc STEC Top7方法对于1,448份天然污染的生乳样品的评估。 

结果再次显示在第一筛选中eae变体基因的检测允许使生乳样品和生乳酪中的PCR阳性样品率分别降低33.6％和35.0％。基于IMC-PCR的STEC Top7方法的第二筛选步骤诱导在生乳样品和生乳干酪中的假定阳性样品分别75.7％和65.3％的显著降低，指示在大多数样品中，不同大肠杆菌菌株应该携带不同的靶向基因。 

实施例3：生牛肉(375g) 

整个方法的评估还对375g生牛肉样品实现，所述生牛肉样品包括在跨越美国的4个设施中加工的400份绞牛肉样品和150份牛肉修剪(beef trim)样品。本发明的GeneDisc方法与USDA-FSIS MLG5B.01方法相比较。将375g每份样品在1.5L mTSB或975mL含新生霉素的mTSB(mTSBn)中进行稀释。样品在42℃下进行温育。温育时间取决于富集肉汤：对于mTSB12小时，对于mTSBn15小时。假定的阳性样品根据参考方法(USDA-FSIS MLG5&5B.01)加以证实。结果在表6中报告。 

表6：整个GeneDisc STEC Top7方法对于550份天然污染的生牛肉样品的评估。 

在400份绞牛肉样品中，GeneDisc STEC Top7方法仅给出1份来自mTSBn富集的假定阳性样品。该假定结果通过培养方法得到证实。USDA-FSIS方法检测到9份潜在阳性样品。仅1份通过培养方法得到证实。天然由STEC O157污染的样品通过两种方法被检测出来并且通过培养得到证实。 

在150份牛肉修剪样品中，GeneDisc方法检测到在mTSB或mTSBn中富集的1份潜在阳性样品，其通过培养方法得到证实。USDA-FSIS MLG5B.01方法检测到在mTSBn中富集的另外1份潜在阳性样品，其未得到证实。更有趣的是，通过培养得到证实的由GeneDisc方法的假定阳性样品通过USDA-FSIS MLG5B.01方法的PCR筛选未检测到。 

GeneDisc STEC Top7方法和参考方法分别给出2和10份假定阳性样品。所有样品的培养证实获得3个Top7STEC分离物，其中2个由GeneDisc方法作为假定阳性样品给出(O157和O26)。通过参考方法获得的假定阳性样品中的仅1份得到证实(O157)。GeneDisc和USDA-FSIS方法的普遍率分别为0.36％和1.82％。 

表7证实了本发明方法和ISO/TS13136:2012方法的重要差异概括。 

表7