检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒。本发明检测试剂盒可以准确、有效的检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性 支气管炎病毒的试剂盒。

背景技术

随着我国养禽业集约化程度的不断提高，各类疾病的发生也呈逐年上升 的趋势。我国禽病防治的总体水平不高，禽病的发生和危害仍然十分严重， 据不完全统计，目前危害我国养禽业生产的疾病达80余种，其中传染病约占 禽病总数的75％，危害严重。同时禽病的发生也出现新的特点，如新的传染 病不断出现；新发生禽病的种类增多；传染病发病的非典型化和病原出现新 的变化；混合感染和复合症使疾病更为复杂等。

鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎这3种病在我国和许 多国家地区广泛流行，受病毒侵袭的鸡群会引起大批死亡，耐过的生长发育 缓慢，淘汰率增高，并干扰其它疫苗的免疫力，使鸡易继发感染其它疾病， 而造成严重的经济损失。这3种病的共同特征都能引起呼吸道症状，而且症 状十分相似，在临床诊断中很难准确判断，也极易与其它呼吸道病如禽流感、 慢性呼吸道病等相混淆。现有的禽病检测或监测技术均存在不可克服的局限， 如对疫病的混合感染、隐性感染及疫苗毒和野毒的区分等，在检测时均存在 一定的困难。同时对于多种疫病的混合感染需要同一种方法或不同方法多次 进行检测，因此有必要加强对动物疫病检测或监测新型技术的研究。

目前，对这3种病的诊断一般采用病原分离鉴定和常规的血清学方法， 但这些方法存在操作繁杂、费时费力、敏感性较差等不足。特别是当鸡群存 在鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎等多种病毒感染时，难 以应用这些传统方法进行快速检测和鉴别诊断，在一定程度上影响了对这些 疫病的有效防制。最近国内外均建立了PCR/RT-PCR检测方法，以及多重 PCR检测方法，但是还不能满足更加快速、准确的检测多种病原混合感染的 要求。因此，有必要建立DNA微阵列检测技术对鸡新城疫、鸡传染性支气 管炎、鸡传染性喉气管炎病毒进行鉴别诊断，建立快速、准确的早期诊断和 检测方法，以便尽快采取有效的针对性防治措施，减少这些疾病对养禽业造 成的损失。用DNA微阵列检测技术对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传 染性喉气管炎病毒进行鉴别诊断的方法是十分必要的，具有重要的现实意义。

分子生物学理论和技术的发展，特别是基因芯片有高通量、多样性、微 型化和自动化的特点，这些特性使它上面的信息能快速准确地被读出，对样 品的量要求很少，节约试剂和成本，处理速度大大加快，在对各种病原体的 检测中，病原体基因的检测和分析是最可信的，而基因芯片技术能对各种病 原体的RNA进行定性和定量的分析，从而帮助临床医生对感染的种类和感 染的程度进行分析。

公开号为1616679和1616678的专利申请分别公开了检测包括鸡新城疫 病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒等10种或9种病毒的 基因芯片，但是该文件中没有芯片的特异性和灵敏度试验，不能说明其可以 特异且灵敏地同时检出鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉 气管炎病毒。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异强、灵敏度高可同时检测检 测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒的新的基 因芯片和试剂盒。

本发明检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎 病毒的试剂盒，其特征在于：它包括鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒 和鸡传染性支气管炎病毒的基因扩增试剂以及检测用基因芯片；

所述扩增鸡传染性喉气管炎病毒的试剂包括SEQ ID NO：7～8和/或SEQ  ID NO：9～10所示引物对；扩增鸡新城疫病毒基因的试剂包括SEQ ID NO： 11～12和/或SEQ ID NO：13～14所示引物对；扩增鸡传染性支气管炎病毒基 因的试剂包括SEQ ID NO：15～16和/或SEQ ID NO：17～18所示引物对；所 述引物对中，上游引物与下游引物的摩尔比是1:1；

所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包 括SEQ ID NO：1或2所示任意一个或者两个基因片段，SEQ ID NO：3或4 所示任意一个或者两个基因片段以及SEQ ID NO：5或6所示任意一个或者 两个基因片段。

优选地，所述扩增试剂还包括荧光染料标记的dNTP。进一步优选地， 所述荧光染料为Cy3荧光染料或者Cy5荧光染料。

优选地，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：20～21所示引物对；所述基因 芯片还包括定位探针，定位探针是SEQ ID NO：19所示的基因片段。

优选地，所述固相载体为氨基化基片。

本发明还提供了SEQ ID NO：7～8和/或SEQ ID NO：9～10所示引物对、 SEQ ID NO：11～12和/或SEQ ID NO：13～14所示引物对与SEQ ID NO：15～16 和/或SEQ ID NO：17～18所示引物对在制备同时扩增鸡新城疫病毒、鸡传 染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的试剂中的用途。

本发明还提供了SEQ ID NO：7～8和/或SEQ ID NO：9～10所示引物对、 SEQ ID NO：11～12和/或SEQ ID NO：13～14所示引物对、SEQ ID NO：15～16 和/或SEQ ID NO：17～18所示引物对与SEQ ID NO：1或2所示任意一个或 者两个基因片段、SEQ ID NO：3或4所示任意一个或者两个基因片段、SEQ  ID NO：5或6所示任意一个或者两个基因片段在制备检测鸡传染性喉气管炎 病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒中的用途；

其中，所述引物对为扩增试剂，上游引物与下游引物的摩尔比是1:1； SEQ ID NO：1～6所示基因片段为检测探针。

优选地，所述扩增试剂还包括荧光染料标记的dNTP。进一步优选地， 所述荧光染料为Cy3荧光染料或者Cy5荧光染料。

优选地，所述检测探针固定在氨基化基片上。

优选地，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：20～21所示引物对以及SEQ ID  NO：19所示的定位探针。

本发明试剂盒可以有效检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡 传染性支气管炎病毒，特异性强、敏感性高、耗时短，检测快速，具有良好 的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的 详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。 凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1DNA微阵列的矩阵排列情况；

图2多重PCR体系1电泳情况。M：100bp Ladder DNA Maeker；1： NDV-F；2：IBV-N；3：ILTV-gB；4：多重PCR；

图3多重PCR体系2电泳情况。M：100bp Ladder DNA Maeker；1： NDV-HN；2：IBV-M；3：ILTV-TK；4：多重PCR；

图4特异性实验结果；

图5灵敏度实验结果；

图6灵敏度实验结果；

图7基因芯片重复检测结果。

具体实施方式

一、实验材料和仪器

材料准备

ILTV标准株、NDV LaSota株、IBV H120株均购自中国兽药监察所，由 本实验室保存。

试剂

氨基基片：氨基载玻片，购自上海百傲生物工程有限公司；醛基 基片：醛基载玻片，购自上海百傲生物工程有限公司；点样缓冲液1： 点样缓冲液，购自上海百傲生物工程有限公司；点样缓冲液2：晶芯 基因芯片点样液，购自北京博奥生物公司；Cy3-dCTP：Lot300989，美国 Amersham公司；杂交缓冲液：杂交缓冲液，购自上海百傲生物工程 有限公司；洗液1：1×SSC/0.1％SDS；洗液2：0.2×SSC/0.1％SDS；洗液3： 0.2×SSC；洗液4：灭菌超纯水。

仪器

超净工作台，SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司；超纯水仪，Milli  Qplus，法国产；梯度PCR仪，P×2，Thermo hybaid，美国产；高速冷冻离 心机3K18型，Sigma，德国产；电泳仪，POWER Pac300，Bio-RAD，意大 利产；分子杂交仪，Thermo hybaid，美国产；核酸蛋白检测仪，SmartSpaee TM 3010，Bio-RAD，意大利产；基因芯片杂交盒，北京博奥生物公司；SmartArrayer 48基因芯片点样仪，Capitalbio Corporation，北京博奥生物公司； LuxScan 10K基因芯片扫描仪，Capitalbio Corporation，北京博奥生物 公司；真空抽干机，SinBo，香港产；恒温摇床，Thermo Forma，美国产。

实施例1本发明试剂盒的制备

1、材料和仪器

同前述实验材料和仪器。

2、实验方法

2.1PCR引物、检测探针的制备

(1)设计病原特异性探针：通过对GenBnak中收录的鸡新城疫病毒、 鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的核酸序列的比对分析，选 定保守区域序列：NDV-F/HN、IBV-IBM/IBN、ILTV-TK/gB。针对保守序列 设计检测多对探针，从中挑选出特异性强的探针序列。

(2)设计探针序列的特异性引物：针对上述保守探针序列，利用生物信 息学软件DNAman、Primer5.0等设计特异性引物。特异性引物由上海生物工 程公司合成。

(3)探针制备：用小量病毒/液体样品DNA/RNA抽提试剂盒提取鸡新 城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒，利用上述特异 性引物对三种病原核酸进行PCR扩增，纯化浓度测定。

反转录体系及条件(参照PrimeScript RT reagent Kit的方法)

PCR扩增体系及条件：

反应条件如下：

4、探针的筛选:将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点 在氨基化玻璃基片上制成DNA微阵列，通过杂交试验进行探针筛选，最终 得到用于制备本发明检测DNA微阵列所需的特异性探针：NDV-F/HN、IBV- IBM/IBN、ILTV-TK/gB。

5、探针基因库的建立：将胶回收纯化的NDV-F/HN、IBV-IBM/IBN、 ILTV-TK/gB用pMD19-T Simple Vector进行连接，连接体系如下

连接反应在16℃下进行16h；将10.0μL探针连接产物加入的200μL 感受态细胞DH5α(氯化钙法制备)中，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热休 克90s后立即放入冰浴中冷却5min，加入800μL LB液体培养基，37℃轻微 振荡培养3h。取200μL培养物涂布于含氨苄的LB琼脂平板培养基，37℃ 培养过夜，挑选阳性克隆进行增菌培养。进行质粒PCR鉴定，并送上海杰李 生物公司测序。

6、探针基因库的保存：将测序正确的质粒进行扩增培养，并用20％脱 脂牛奶作为保护剂进行冻干，置于-80℃保存。

引物和探针的序列如下：

SEQ ID NO：1(NDV-F)

源基因来源：NDV LaSota株

基因大小及序列：440bp

CAAGAAC CCAGCACCTA TGATGCTGAC TATCCGGGTT GCGCTGGTAC

TGAGTTGCATCTGTCCGGCAAACTCCATTGATGGCAGGCCTCTTGCAGC

TGCAGGAATTGTGGTTACAGGAGACAAAGCCGTCAACATATACACCTCA

TCCCAGACAGGATCAATCATAGTTAAGCTCCTCCCGAATCTGCCCAAGG

ATAAGGAGGCATGTGCGAAAGCCCCCTTGGATGCATACAACAGGACAT

TGACCACTTTGCTCACCCCCCTTGGTGACTCTATCCGTAGGATACAAGA

GTCTGTGACTACATCTGGAGGGGGGAGACAGGGGCGCCTTATAGGCGC

CATTATTGGCGGTGTGGCTCTTGGGGTTGCAACTGCCGCACAAATAACA

GCGGCCGCAGCTCTGATACAAGCCAAACAAAATGCTGCCAACATCCTC

CGAC

SEQ ID NO：2(NDV-HN)

源基因来源：NDV LaSota株

基因大小及序列：465bp

CTGGACGGTTTGGTGGGAAACGCATACAGCAGGCTATCTTATCTAT CAAGGTGTCAACATCCTTAGGCGAAGACCCGGTACTGACTGT CCGCCCAAC

ACAGTCACACTCATGGGGGCCGAAGGCAGAATTCTCACAGTAGGGACA

TCTCATTTCTTGTATCAACGAGGGTCATCATACTTCTCTCCCGCGTTATTA

TATCCTATGACAGTCAGCAACAAAACAGCCACTCTTCATAGTCCTTATAC

ATTCAATGCCTTCACTCGGCCAGGTAGTATCCCTTGCCAGGCTTCAGCA

AGATGCCCCAACTCGTGTGTTACTGGAGTCTATACAGATCCATATCCCCT

AATCTTCTATAGAAACCACACCTTGCGAGGGGTATTCGGGACAATGCTT

GATGGTGTACAAGCAAGACTTAACCCTGCGTCTGCAGTATTCGATAGCA

CATC CCGCAGTCGC ATTACTC

SEQ ID NO：3(IBV-M)

源基因来源：IBV H120株

基因大小及序列：368bp

ACACAGGAGGTCTTGTCGCAGCGATAATACTTACTGTGTTTGCGTG TCTTTCTTTTGTAGGTTATTGGATCCAGAGTATTAGACTCTTTAAGCGGT GTAGATCTTGGTGGTCATTTAACCCAGAATCTAACGCCGTAGGTTCAAT ACTCCTAACTAATGGTCAACAATGTAATTTTGCTATAGAGAGTGTGCCGA TG

GTGCTTTCTCCTATTATAAAGAATGGTGTTCTTTATTGTGAGGGTCAGTG

GCTTGCTAAATGTGAACCAGACCACTTGCCTAAAGACATATTTGTATGC

ACACCAGATAGACGTAATATCTATCGTATGGTGCAGAAATACATTGGTGA

CCAAAGCGGAA ATAAGAAAAGG

SEQ ID NO：4(IBV-N)

源基因来源：IBV H120株

基因大小及序列：292bp

CAATACCCGCTACGATTCTCAGATGGAGGACCTGATGGTAATTTCC GTTGGGACTTCATTCCAATAAATCGTGGTAGGAGTGGAAGATCAACAG CGGCTTCATCAGCAGCATCTAGTAGAGCACCGTCGCGTGATGGCTCGCG TGGACGTAGAAGCGGAGCTGAAGATGATCTTATAGCTCGTGCAGCAAA GATCATTCAGGATCAGCAGAAGAAGGGTTCTCGCATTACTAAAGCTAAG GCCGATGAAATGGCTCATCGCCGGTATTGTAAGCGTACTATCCCACCTG GTT

SEQ ID NO：5(ILTV-TK)

克隆基因的源基因来源：ILTK标准株

基因大小及序列：279bp

TCCTCGTAGATAGGCACCCACTCGCGGCATGTTTGTGTTTCCCTGT TGCACAATATCTAAGCGGAGCGCTCGAATTTGGAGATTTAATAACTTTAT TGTCAGGAATTCCTGACATTCCAACACACTCCAACATTGTTTTAATGGA TTTGGATATTTGCGAACAGGCACGGCGTATAATACAAAGGGGGCGCCCA GGGGAAACGGTCGACTGGACGTATTTGTGTGCATTACGTAACTCGTACA TCTGCCTCATGAATACTACCACCTACCTCCAACGTA

SEQ ID NO：6(ILTV-gB)

源基因来源：ILTV标准株

基因大小及序列：189bp

TGCTGGAATAATAGACCCTCGTGATACAGCCAGCATGGATGTTGGA AAAATCTCTTTCTCCGAAGCCATTGGGTCGGGGGCACCGAAAGAACCC CAGATTAGAAACAGAATTTTTGCGTGCTCATCTCCAACTGGCGCCAGTG TTGCGAGGCTTGCCCAGCCACGACATTGTCACCGACATGCCGATTC

SEQ ID NO：7～8(F-primer)

F 5`-CAAGAACCCAGCACCTATGATG-3`

R 5`-GTCGGAGGATGTTGGCAGC-3`

SEQ ID NO：9～10(HN-primer)

F 5`-CTGGACGGTTTGGTGGGAA-3`

R 5`-GAGTAATGCGACTGCGGGATG-3`

SEQ ID NO：11～12(IM-primer)

F 5`-ACACAGGAGGTCTTGTCGCAG-3'

R 5`–CCTTTTCTTATTTCCGCTTTGG-3`

SEQ ID NO：13～14(IN-primer)

F 5`-CAATACCCGCTACGATTCTCAG-3`

R 5`-AACCAGGTGGGATAGTACGCTTA-3`

SEQ ID NO：15～16(TK-primer)

F 5`-TCCTCGTAGATAGGCACCCACTC-3`

R 5`-TACGTTGGAGGTAGGTGGTAGTATTCA-3`

SEQ ID NO：17～18(gB-primer)

F 5`-TGCTGGAATAATAGACCCTCGT-3`

R 5`-GAATCGGCATGTCGGTGA-3`

SEQ ID NO：19(定位基因)

aaagcgaggc tttttggcct ctgtcgtttc ctttctctgt ttttgtccgt ggaatgaaca atggaagtca

acaaaaagca gctggctgac attttcggtg cgagtatccg taccattcag aactggcagg aacagggaat

gcccgttctg cgaggcggtg gcaagggtaa tgaggtgctt tatgactctg ccgccgtcat aaaatggtat

gccgaaaggg atgctgaaat tgagaacgaa aagctgcgcc gggaggttga agaactgcgg caggccagcg

aggcagatct ccagccagga actattgagt acgaacgcca tcgacttacg cgtgcgcagg ccgacgcaca

ggaactgaag aatgccagag actccgctga agtggtggaa accgcattct gtactttcgt gctgtcgcgg

atcgcaggtg aaattgccag tattctcgac gggctccccc tgtcggtgca gcggcgtttt ccggaactgg

aaaaccgaca

SEQ ID NO：20～21(定位基因互补序列的扩增引物)

F：AAAGCGACGCAATGAGGCACT

R：GTTCCACGACCGCAACTGC

2.2标准质粒的构建

2.2.1NDV和IBV基因组的抽提

NDV和IBV的总RNA抽提采用天根的总RNA提取试剂盒，参照说明， 具体操作方法如下：

1)直接取200μL病毒尿囊液于1.5mL离心管中，加入600μL裂解液， 充分振荡混匀；

2)将匀浆样品在15-30℃放置5min；

3)4℃，12000r/min离心5min，把上清液吸到新离心管中；

4)加200μL氯仿，剧烈上下振荡15sec，室温静置3min；

5)4℃，12000r/min离心10min，样品会产生分层，轻轻地将最上层无 色的水相转到新管中；

6)加0.5倍体积无水乙醇，混匀，转移到吸附柱内，4℃，12000r/min 离心30sec；

7)加500μL去蛋白液，4℃，12000r/min离心30sec；

8)加600μL漂洗液，静置2min，4℃，12000r/min离心30sec；重复 一次

9)4℃，12000r/min离心2min，弃掉残余液体；

10)将吸附柱转到RNase-Free离心管中，加50μL RNase-Free超纯水， 室温静置2min，4℃，12000r/min离心2min。离心液即得到的病毒RNA， 于-20℃下保存备用或直接进行反转录。

2.2.2ILTV基因组的抽提

ILTV的DNA抽提采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，参 照说明，具体操作方法如下：

1)取-20℃保存的尿囊膜10mg，研磨处理为细胞悬液，然后12000r/min 离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮；

2)加20μL Proteinase K溶液，混匀后放置于56℃至尿囊膜溶解，。

3)加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。

4)加200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec。

5)将混合物都加吸附柱中，12000r/min离心30sec。

6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30sec。

7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30sec，重复 一次。

8)12000r/min空离2min，室温下放置5分钟晾干。

9)将柱子放到干净的离心管上，加50μL洗脱液TE，放置2min，12000 r/min离心2min。收集的离心液即病毒DNA，或直接PCR扩增或于-20℃下 保存备用。

2.2.3探针基因的RT-PCR及PCR扩增

以抽提的NDV和IBV的RNA为模板，以Random 6primers为引物合成 cDNA，反应体系如下：

RT Enzyme Mix 0.5μL Random 6primers 0.5μL 5×PrimeScript RT Buffer 2.0μL RNA 2.0μL RNase-Free超纯水 5.0μL Total 10.0μL

将上述体系混匀后按下面程序进行cDNA合成：反应程序为37℃， 15min；85℃，5sec；4℃，保存。

以反转录合成的NDV、IBV的cDNA和ILTV的DNA为模板，进行PCR 反应，反应体系如下：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μL cDNA/DNA 2.0μL 上游特异性引物(25.0μmol/L) 0.5μL 下游特异性引物(25.0μmol/L) 0.5μL 超纯水 9.5μL Total 25.0μL

反应条件如下：

PCR完毕后，分别取7μL扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳分析。

2.2.4探针基因的胶回收

探针基因的胶回收，采用OMEGA小量胶回收试剂盒，参照说明进行 回收操作，步骤如下：

1)取20μLPCR产物进行电泳，6V/cm，25min，紫外灯下切胶，称重。 按照试剂盒说明进行胶回收；

2)按1:1的比例加入Binding Buffer(XP2)，55℃-60℃水浴直到胶全部 融化，期间每隔2-3min上下颠倒离心管；

3)将液体加入吸附柱中，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

4)加入300Binding Buffer(XP2)，室温12000r/min离心1min，倒掉 滤液；

5)加入700mL漂洗液SPW，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

6)室温12000r/min空离2min，倒掉滤液；

7)将吸附柱放于新离心管中，加入30mL洗脱缓冲液，室温静置1min；

8)室温12000r/min离心2min，取7μL回收产物进行电泳，验证回收 效果，其余回收产物于-20℃保存备用。

2.2.5探针基因的连接重组

采用pMD19-T Simple Vector克隆试剂盒，进行探针基因的连接重组，具 体步骤按说明进行。连接体系如下：

pMD19-T Simple载体 0.5μL 胶回收PCR产物 5.0μL Solution I 4.5μL Total 10.0μL

4℃连接过夜，连接产物用于转化DH5α感受态细胞。

2.2.6感受态细胞的制备及保存

参考《分子克隆实验指南》氯化钙法^[56]制备DH5α感受态细胞，制备好 的感受态细胞分装为100μL/管，直接用于转化或于-70℃保存。

2.2.7连接产物的转化

将100μL感受细胞放在冰上，向其中加10μL连接产物，冰浴30min；42℃ 水浴热休克90s，快速冰浴冷却5min；立即加入600μL 37℃预热的LB液体 培养基(无需冰上操作)，37℃，150r/min振荡培养1h，使受体菌恢复正常 生长状态；取150μL培养物均匀涂布于LB平板(含100mg/mL Amp)，晾干， 于37℃培养约12h，挑取菌落进行鉴定。

2.2.8探针质粒菌的鉴定及保存

2.2.8.1探针质粒菌的DNA抽提

将阳性质粒菌接种于5mL LB(含100mg/mL Amp)液体培养基中，37℃ 振荡培养12h；按Omega小量质粒提取试剂盒说明方法提取质粒。具体步骤 如下：

1)吸1mL菌液到离心管中，室温12000r/min离心1min，吸弃上清；

2)加入250μL Solution I(4℃储存)，振荡使菌体悬浮；

3)加入250μL Solution II，轻轻地颠倒混匀，静置2min；

4)加入350μL Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀物，室温 12000r/min，离心10min；

5)将上一步的液体转入吸附柱中，室温12000r/min离心1min，倒掉滤 液；

6)向其加500μL Buffer HB，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

7)向其加700μL Buffer Wash Buffer，室温12000r/min离心1min，倒 掉滤液；重复一次；

8)室温12000r/min空离2min，将柱子装于一个干净的离心管中，向其 加30μL Elution Buffer，静置2min，12000r/min离心1min，收集的离心液 即为提取的质粒DNA。

2.3.8.2探针质粒菌的PCR鉴定

对提取的探针质粒菌分别进行PCR鉴定，同时以pMD19-T Simple空白 载体作阴性对照，反应体系如下：

2×Taq PCR MasterMix 7.5μL 上游特异性引物(25.0μmol/L) 0.5μL 下游特异性引物(25.0μmol/L) 0.5μL 质粒(50倍稀释) 2.0μL 超纯水 4.5μL Total 15.0μL

反应程序同上。反应完毕，分别取5μL于2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳 分析。

2.2.9探针质粒菌的序列测定和分析

采用Sanger双脱氧末端终止法对经过PCR鉴定为阳性的探针质粒菌进 行序列测定，序列测定工作交由上海杰李生物技术有限公司完成。

得测序正确的质粒菌T/F、T/HN、T/M、T/N、T/TK、T/gB，分别含有 如下基因片段：SEQ ID NO：1(NDV-F)、SEQ ID NO：2(NDV-HN)、SEQ  ID NO：3(IBV-M)、SEQ ID NO：4(IBV-N)、SEQ ID NO：5(ILTV-TK)、 SEQ ID NO：6(ILTV-gB)。

2.2.10探针质粒菌的保存

把序列测定正确的探针质粒菌菌扩大培养，然后以20％脱脂奶粉作为保 护剂冻干，-70℃保存。

2.3芯片制备

(1)芯片矩阵的设计：如图1所示，每张芯片分为四个区，四个区为四 个重复阵列，用杂交围栏隔开，以便同时进行三个不同样品的杂交反应。每 个阵列参数为：每排探针基因和定位基因均为12个样点，各样点中心间距 650μm，样点直径为220μm。

(2)检测DNA微阵列的点制：

点样缓冲液配制成点样液，将包括新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、 鸡传染性喉气管炎病毒探针、定位基因定量至使用浓度即为200ng/μL，加 热至95℃保持5min，然后置于冰上冷却10min。

按芯片设计要求在96(384)孔载样板孔内加入稀释变性好的包括鸡新 城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒探针、定位基因 以及空白质控缓冲液，封住孔板，用基因芯片点样系统(Microarray Printing  System，SpotArrayTM 24)在氨基化基片上接触式点样。点样环境相对湿度 为55％-65％，温度15-30℃。

点制好的芯片静置充分干燥过夜(＞6h)，然后用60-80℃水合处理10s， 立即于加热至80℃原位PCR仪上烘干，紫外线交联30min后，以0.2％SDS 液洗涤5min，再以蒸馏水快速洗涤后离心干燥，密封、室温保存备用。

实施例2本发明检测方法

1、核酸抽提

病毒RNA的抽提：采用试剂盒方法抽提病毒RNA，试验使用小量病毒/ 液体样品RNA抽提试剂盒。按该试剂盒说明抽提RNA，方法如下：

a)取待检样品300μL置于离心管中，加入500μL RV液后剧烈振荡2 min后室温静置5min。

b)加入750μL异丙醇，轻轻摇匀。

c)移取800μL至吸附柱中，4℃下12000rpm离心30s。

d)弃收集管中液体，将剩余的裂解物移入吸附柱中，4℃下12000r离心 30s。

e)弃收集液后加入500μL RP液，4℃下12000rpm离心30s去除蛋白 质。

f)加入500μL W3液，静置lmin后，4℃下12000rpm离心15s。

g)重复步骤f。

h)将吸附柱转移到另一干净的离心管中，在吸附膜中央加入30μL超纯 水，室温静置2min。

i)12000rpm离心2min，离心液为提取的RNA，-70℃保存备用。

病毒RNA的反转录：NDV、IBV反转录体系10.0μL体系：

反转录反应程序如下：42℃，反转录30min；85℃，30s灭活反转录酶； 4℃保持。

病毒DNA的抽提：采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒抽提病 毒DNA，方法如下

a)动物组织(组织用量应少10mg)应先打碎处理为细胞悬液，然后10000 rpm离心1min，倒尽上清，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

b)加入20μl Proteinase K溶液，混匀，在56℃放置，直至组织溶解， 简短离心以去除管盖内壁的水珠。

c)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变 清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

d)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉 淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

e)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入 收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

f)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉 废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

g)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒 掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

h)重复操作步骤g。

i)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将 吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

j)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴 加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min， 离心2min，离心液为提取的DNA，-70℃保存备用。

2、cDNA/DNA的PCR扩增标记

试验中Cy3-dCTP荧光素使用终浓度为2.5umol/L，加入荧光素时及以后 操作均在暗室中进行。上下引物的浓度都是25umol/L。

反应条件如下：

3.cDNA的多重PCR扩增标记

按照如下体系和条件分别进行单重对称PCR和多重对称PCR，分为两 组分别扩增，两组引物分别为，体系1：ILTV-gB、NDV-F、IBV-N；体系2： ILTV-TK、NDV-HN、IBV-M。

多重PCR标记体系：

上下引物的浓度都是25umol/L。

试验中Cy3-dCTP荧光素使用终浓度为2.5umol/L，加入荧光素时及以后 操作均在暗室中进行。反应条件如下：

扩增完成后，取10μL产物，以2％琼脂糖凝胶电泳分析，评价引物之间 是否会相互影响。

结果如图2～3所示，多重RT-PCR可以有效扩增，其产物的亮度与相应 的单重RT-PCR无明显差异。实验结果说明，本发明扩增三种病毒的引物之间不会相互干扰，可以同时有效扩增3种病毒的基因。

4、检测

(1)芯片的预杂交：取实施例1制备基因芯片，95-100℃双蒸水中变性 1-2min.其间上下抽提以免在玻片表面形成气泡，立即置预冷的95％乙醇中 快速冷却后离心干燥，将基因芯片置于杂交舱中，于微阵列检测区加入预杂 交液25μL，将盖玻片轻放其上，以免形成气泡，使预杂交液均匀覆盖微阵列 检测区，将芯片置于密封的湿盒内于42℃下预杂交l h。

(2)芯片的杂交：吸除预杂交液，将利用单重PCR的标记好的核酸样 品和多重PCR标记的核酸样品分别于95℃变性3min后，立即置冰中冷却5 min，再与一定量预冷的杂交缓冲液混匀，取该混合液20-40μL加到微阵列 检测区，以盖玻片轻放其上，将微阵列放入杂交舱内于一湿盒内避光杂交， 于48℃杂交温度下杂交6h时间。

(3)DNA微阵列的洗涤干操：杂交完毕，洗液各洗涤3min，离心干燥 后用于扫描分析。洗涤在暗室中完成。杂交完毕后，轻轻移去微阵列检测区 的盖玻片，将微阵列放置在玻片架上，立即用温热的洗液1、洗液2、洗液3 分别洗涤3min，然后再用双蒸水漂洗，离心干燥后扫读分析。

(4)扫描分析离心干燥的DNA微阵列用基因芯片扫描仪 扫描检测。扫描参数为Laserpower 95％，PMGT 75％，分辨 率20um，扫描结果以16位TIFF和BMP格式保存图像。

3、检测

1基因芯片的预杂交

取出基因芯片转移至沸腾的超纯水中2min(上下抽提防止表面产生气 泡)，然后将其取出迅速浸入95％的乙醇中冷却1min，离心干燥。将基因芯 片放于杂交盒中，向每个阵列加入40μL预杂交液(组分见下)，轻轻盖上盖 玻片(不要产生气泡)，将基因芯片置于密闭的湿盒中44℃预杂交1h，预杂 交完毕后，蒸馏水轻轻冲洗30sec、离心干燥。处理后的基因芯片应立即杂 交，如果干燥时间超过1h，杂交效率会迅速降低。

2基因芯片的杂交

杂交反应中，标记的靶分子与固定探针通过序列互补进行反应，选择的 杂交条件必须保证非特异性杂交的最小化和特异性信号的最大化，参考文献 [67]选取合适的条件。将Cy3标记的靶核酸和杂交液以1:1的比例混合，然 后将混合液于95℃变性3min，30℃冷却30sec(加热可有效降低背景，不推 荐将溶液放置在冰上，因SDS会产生沉淀)。取该混合液40μL加到阵列上， 小心盖上盖玻片，将基因芯片放入杂交盒内，置于密闭的湿盒中48℃避光杂 交6h。从此步开始，以下均为避光操作。

3基因芯片杂交后的清洗

基因芯片清洗的同时，打开扫描仪进行预热。拆卸杂交盒，从中取出基 因芯片，立即浸入到温热的清洗液1中，直到盖玻片分离。盖玻片除去后， 依次用温热的清洗液1、清洗液2、清洗液3、清洗液4依次洗涤3min，低 速离心干燥后进行扫描。杂交完成的基因芯片应在当天进行扫描，因为时间 的延长会使信号降低。

4基因芯片的扫描与结果判定

离心干燥的基因芯片用芯片扫描仪进行单通道扫描，采集靶核酸与基因 芯片杂交后的数据。扫描参数设置为Laser power(激光功率)65％，PMT(光 电倍增管)调节范围在650-750之间，绿色532nm单通道荧光，分辨率为 20um，扫描结果以JPG图像的格式保存。

扫描的结果用基因芯片扫描仪随机自带的数据分析软件LuxScan3.0进 行分析，获取信息，分析结果以*.LSR文件格式保存。针对样点信号的不同 处理方式进行了比较选择。软件数据输出模式主要有样点信号中位值和样点 信号平均值两种。样点信号阈值概念SNR(Singal-to-Noise Ratio，信噪比)， 是样点信号值与背景信号值的比值。据此本研究引入SNRL(样点信号值的 以1.5为底的对数与背景信号值对数的比值)，来判定每个样点的杂交结果。

实施例3特异性试验

一、试验方法

用实施例2的方法，检测用NDV、IBV、ILTV、IBDV、AIV五种病原 体，以检测其特异性。

二、结果

实验结果如图4所示，本发明试剂盒可以有效检出本发明NDV、IBV、 ILTV，而不会检出其他病毒，如，IBDV、AIV，表明本发明方法的特异性强， 不会扩增其他病毒。

实施例4灵敏度试验

一、试验方法

将实施例1构建的6种质粒DNA用核酸蛋白仪定量后，稀释后浓度分 别为10pg/μL、20pg/μL、50pg/μL、100pg/μL、1000pg/μL，按照实施例2的 方法进行检测。

二、结果

结果如图5～6所示，在探针浓度大于或等于20pg/μL时，NDV、IBV、 ILTV均有较为明显的杂交斑点，而且SNRL大于1.0，阳性对照斑点明显而 阴性对照斑点不明显。

采用本发明试剂盒进行检测时，各病毒样品的最低检测浓度为 20pg/μL，说明本发明基因芯片和试剂盒的灵敏度高。

实施例5稳定性试验

一、试验方法

从两批不同时间制备的微阵列中随机抽出3张，针对相同靶核酸 (NDV-F、NDV-HN)标记并进行杂交反应，其中靶核酸的使用量、杂交条 件与标准流程完全一致。

二、结果

实验结果如表1和图6所示：

表1基因芯片重复检测结果(1、2为同批次制备)

由表1和图7可以看出，对于同一批次生产的基因芯片和不同批次生产 的基因芯片，其检测结果符合预期，无大幅波动，阳性对照斑点明显而阴性 对照斑点不明显，稳定性和可重复性良好。

实施例6采用本发明基因芯片检测病料

一、检测方法

1、病料的采取与预处理：

1)病料的采取：收集四川重庆12个市县(成都崇州、成都大邑、重庆 梁平、绵阳、南充、眉山洪雅、眉山峨眉、眉山丹棱、内江威远、雅安雨城、 雅安石棉、宜宾长宁)20份表现呼吸道症状的鸡、鸽样品，包括气管和肺部 组织。

2)病料的预处理：将采集的病料用灭菌PBS研磨，37℃下作用30分钟， 反复冻融3次并用超声波处理，离心，上清液-20℃保存。

2、检测

采用实施例2的PCR体系和条件进行单一PCR分别检测NDV、IBV和 ILTV，同时采用实施例1的基因芯片，按照实施例2的方法检测。

二、检测结果

根据结果判定样品的阴阳性。结果发现DNA微阵列检测与试验室PCR 检测符合率很高。

临床样品检测结果

实验结果说明，本发明试剂盒可以准确、有效地检出鸡新城疫病毒、鸡 传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒。

综上，本发明试剂盒可以有效检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病 毒、鸡传染性喉气管炎病毒，特异性强、敏感性高、耗时短，检测快速，具 有良好的应用前景。