一种以微卫星为分子标记筛选酿酒酵母乙酸耐受性性状的方法

摘要

本发明公开了一种以微卫星位点为分子标记对酿酒酵母乙酸耐受性性状进行筛选的方法，其特征在于，以微卫星位点ScATT3为分子标记，所述微卫星位点ScATT3与酿酒酵母乙酸耐受性性状成正相关(p<0.05)。与传统方法相比，本发明提供的以微卫星ScAAT3为分子标记对酿酒酵母乙酸耐受性进行筛选的方法，具有丰度高、多态性高、共显性标记、可以鉴别出杂合子和纯合子，实验重复性好，结果可靠，选择中性、可自动化检测分析等特点，具有广阔的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及酿酒酵母乙酸耐受性的筛选，特别是以微卫星ScAAT3为分子标记的筛选， 属于遗传领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一类重要的工业微生物，被广泛应用于食品焙烤、 啤酒、酒精、白酒、黄酒、葡萄酒、清酒的酿造和有机酸的生产等方面。酿酒酵母在进行有 机酸发酵时，发酵醪液pH往往低于3.5，有时甚至达到2.5，这不利于生产菌株的生长及产 物的生成，提高了生产成本。研究发现，酿酒酵母的耐有机酸能力与菌株来源、酸性物质种 类和培养方式等均密切相关。因此筛选耐酸能力强的酿酒酵母生产菌株有利于提高生产效率， 降低生产成本，在工业生产中有着巨大的商业价值。

传统的酿酒酵母遗传性状的筛选方法主要有基因敲除法和大批量诱变筛选法。在基因敲 除后酵母的表型性状会发生改变，因此可通过基因敲除来对酵母遗传性状进行筛选。但由于 表型性状是由基因型与多种因素共同作用的结果，因此通过基因敲除来对酵母遗传性状进行 筛选准确性较低。而通过诱变的方法对酿酒酵母遗传性状进行筛选，效率较低，且需要耗费 大量的人力、物力和财力。目前，遗传标记已成为分子生态学研究的重要手段，被广泛用于 揭示酿酒酵母遗传多样性。DNA标记能直接反应基因组DNA间的差异，如：单核苷酸多态 性标记(SNP)，随机扩增多态性标记(RAPD)，限制性片段长度多态性标记(RFLP)和扩 增片段长度多态性标记(AFLP)等。SNP是检测等位序列上的单个核苷酸存在的差异，因此 SNP是二等位多态性，RPAD标记扩增出来的DNA片段具有随机性和任意性，但一般表现为 显性遗传，不能区分显性纯合和杂合的基因型；RFLP标记需要消耗大量时间且需要使用放 射性标记，效率较低切操作程序复杂。AFLP标记通过选择性扩增基因组DNA酶切片段所产 生的扩增产物的多态性，该技术结合了RFLP的稳定性和PCR的技术，同时克服例如RELP 带型少，信息量小及RAPD技术不稳定的缺点。但同时也更加费时费力，程序复杂，因此有 必要开发一种新的简单快速，可靠的筛选方法。

微卫星DNA序列(SSR)，是一类由几个(多为1-6个)碱基组成的基序串联重复而成的 DNA序列，在众多的遗传标记技术中，它具有不受环境影响，多态性高，特异性强，遗传稳 定，与生物表型相关度高，并能直接反映DNA序列水平的遗传变异等特点。近年来，微卫 星DNA分子标记作为新兴的标记技术，以其多态点丰富、与生物表型相关度高等优点在生 物遗传多样性、等位基因鉴定等研究方面已经取得了较好的结果，也广泛用于酿酒酵母菌株 的分类鉴定、菌株间的亲缘关系分析和酿酒酵母群体遗传多样性分析。

本研究首次将SSR分子标记与酿酒酵母乙酸耐受性性状相结合,探索SSR分子与酿酒酵 母乙酸耐受性性状相关性，为利用SSR对酿酒酵母乙酸耐受性性状筛选提供一种较为有效的 方法，并为以SSR为分子标记对微生物遗传性状进行筛选提供借鉴。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种以微卫星位点为分子标记对酿酒酵母乙酸耐受性性状 进行筛选的方法。

所述微卫星位点为ScAAT3，该微卫星位点与酿酒酵母乙酸耐受性成正相关(p<0.05)， 可以作为酿酒酵母乙酸耐受性性状筛选的分子标记。

本发明要解决的另一个技术问题是以微卫星为分子标记，建立酿酒酵母乙酸耐受性与11 个微卫星相关性。

选取酿酒酵母基因组中11个微卫星位点，通过PCR扩增技术对44株酿酒酵母生产菌株 进行准确快速分型，并建立相关的基因型数据库。根据实验菌株的耐酸表型差异，利用SPSS 软件统计分析，建立酿酒酵母微卫星与乙酸耐受性性状之间的相关性。

与传统方法相比，本发明提供的以微卫星ScAAT3为分子标记对酿酒酵母乙酸耐受性进 行筛选的方法，具有丰度高、多态性高、共显性标记、可以鉴别出杂合子和纯合子，实验重 复性好，结果可靠，选择中性、可自动化检测分析等特点，具有广阔的应用价值。

附图说明

图144株菌乙酸耐受性表型鉴定结果

图2酿酒酵母在ScAAT3和AT-X位点处的等位基因多态性

具体实施方式

YPD培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L

醋酸母液：配置5mM的醋酸溶液，用NaOH调节其pH至4.5，现配现用。

YPD醋酸平板：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L、琼脂粉2g，pH4.5， 灭菌后分别添加终浓度为50、70、90和110mM的醋酸母液。

活化培养条件：采用YPD培养基，装液量为20％，采用50mL摇瓶进行培养，培养温 度为30℃，培养时间为24h，转速为200rpm。培养条件：采用YPD培养基，装液量为20％， 采用50mL摇瓶进行培养，培养温度为30℃，培养时间为20h，摇床转速为200rpm。

酿酒酵母乙酸耐受性表型值的确定：

分别测定各个摇瓶中菌液的OD₆₀₀值，然后用无菌水将各菌株菌液稀释到OD₆₀₀值相等， 分别取少量稀释后的菌液点在不同浓度的YPD醋酸平板上，分别以相同OD₆₀₀的菌液稀释 100倍后在无醋酸平板上生长的菌落作为参照，若某浓度乙酸胁迫培养后的菌落与其相当， 则判定该浓度为此菌的乙酸耐受性表型值。

微卫星基因分型：

以酿酒酵母基因组为模板，利用荧光标记的引物进行PCR扩增，取1μL扩增产物加入 9μL上样缓冲液(含有8.7μL甲酰胺，0.3μLGS500分子内标)涡旋混匀，稍稍离心；将 上述样品放置在95℃变性3min，随后立即放入4℃进行冷却，以备上样；利用ABI377DNA 测序仪进行毛细管电泳；GeneScan3.7软件分析荧光信号。

实施例1 酿酒酵母乙酸耐受性表型的鉴定

本实施例以细胞的存活率为指标，考察酿酒酵母菌株的耐乙酸胁迫能力。取少量实验菌 株的甘油菌液分别接种于YPD平板上，30℃培养过夜；随后在YPD平板上挑取单菌落转接 至含有10mLYPD液体培养基的摇瓶中，在30℃摇床中培养24h，摇床转速为200rpm；分 别在上述摇瓶中取少量菌液，转接至含有10mL新鲜YPD液体培养基的摇瓶中，在30℃的 摇床中培养20h，设置摇床转速为200rpm；随后分别测定上述摇瓶中菌液的OD600值，用无 菌水将所有菌液的OD600稀释到1，取上述稀释后的菌悬液5μL点在不同乙酸浓度的YPD平 板上，分别以OD600＝1的菌悬液稀释100倍后在无乙酸YPD平板上生长的菌落作为对照。 若某浓度乙酸胁迫培养后的菌落与其相当，则判定为该浓度为此菌的乙酸表型值，根据上述 实验结果对酿酒酵母乙酸耐受性表型进行鉴定(结果如图1所示)。

实施例2 微卫星基因型数据库的构建

根据挑选的微卫星位点的上下游保守序列设计引物，为实现微卫星多态性的半自动精确 检测，分别在各引物的上游5’端修饰不同的荧光标记，提取44株菌的基因组作为PCR扩增 的模板，利用PCR进行扩增，PCR扩增条件如下：95℃5min,(94℃30s,53℃30s,72℃30 s，此过程重复30个循环)，72℃7min，12℃10min(不同的微卫星位点退火温度不同)。

PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，初步对扩增产物的质量、浓度和片段大小进 行评估，以便选择合适的扩增产物进行下一步的检测分析。经过初步的检测结果，选取扩增 效果较好的产物进行多态性检测。取1ul扩增产物加入10μL上样缓冲液(含有8.7ul甲酰胺， 0.3ulGS500分子内标)，95℃变性3分钟，立即放到4℃冷却，利用ABI377DNA测序仪进 行毛细管电泳，GeneScan3.7软件根据每条泳道的分子量内标，将泳道内的所有条带解读为不 同的长度，最后根据酿酒酵母在各个微卫星位点的扩增条带在琼脂糖凝胶电泳中的目的片段 的大小进行判读并获取数据，获得完整的基因型数据库。

通过计算等位基因的频率可以评估菌种的遗传多样性，统计酿酒酵母在11个微卫星位点 的等位基因数目和等位基因频率(如表1)。44株酿酒酵母在11个微卫星位点共得到207个 等位基因，提供较为丰富的遗传信息。各个微卫星位点的等位基因数目在9-37之间变化，平 均每个位点上的等位基因为18.82个。其中，在微卫星位点C4上检测到的等位基因最多，为 34个；在微卫星位点AT-X上检测到的等位基因最少，为9个。C4、C5和ScYOR267c位点 在47株菌种检测出的等位基因分别是19、22和23个，而本实施例中44株菌中这三个位点 的等位基因数分别是37、20及25个。ScAAT1、C5、ScYOR267C、YPL009C和C4具有 较多的等位基因数，多态性较高，说明本实施例所选取的菌株具有较高的遗传多样性，各菌 株之间的遗传差异较大。11个微卫星中，ScAAT3位点的杂合率最低，275bp、254bp、245bp 片段只存在于耐酸菌株中(如图2)。

表1 酿酒酵母在ScAAT3和AT-X位点处的等位基因多态性分析

实施例3 与酿酒酵母乙酸耐受性性状相关的微卫星筛选

分别将44株菌株的乙酸耐受性的表型值和微卫星基因型数据库导入到SPSS11.5软件中， 相关性分析后发现微卫星ScAAT3与酵母乙酸耐受性性状成正相关性(如表2)。通过微卫星 之间的相关性的分析(如表3)，发现多数微卫星之间具有显著的相关性，对于ScAAT3位点， ScAAT3仅仅与C4成显著的负相关性.。微卫星ScAAT3位于编码链上SSY1和YDR161W基 因之间的基因间隔区，ScAAT3位点没有直接影响蛋白质结构，但可能对基因的转录有影响。 很多简单重复序列能够与部分未配对的DNA链形成二级结构并与蛋白质结合。其中一种可 能是ScAAT3位点是个潜在的转录因子结合位点，对乙酸耐受性相关基因的表达起调控作用。 不同的重复序列有着不同的结合特性。结合能力不仅依赖于重复序列，也与重复片段的最小 长度有关。另一种可能性是，三核苷酸重复片段可以形成稳定的发卡结构，影响mRNA的转 录和信mRNA的半衰期。

表2 微卫星与乙酸耐受性性状的相关性分析

表3 微卫星之间的相关性的分析