一种用作光动力药物载体的上转换荧光微米颗粒的制备方法

摘要

本发明公开了一种可用作光动力药物载体的具有上转换荧光性能的铒掺杂磷酸镱(YbPO

说明书

技术领域

本发明涉及一种可以用作光动力药物载体的上转换荧光微米颗粒的合成方法，属微纳米 材料制备及其在生物医学中的应用领域。

背景技术

光动力疗法(photo dynamic therapy，PDT)是一种非侵入性的癌症治疗方法，需要借助 具有特定波长的光线和被称为光敏剂(photosensitizers，PS)的光疗药物，其作用机理基于光 敏剂和环境氧之间所发生的光化学反应。光敏剂是一类本身稳定无毒性，但可以在特定波长 光束照射下生成有毒性的单线态氧和自由基的有机分子。光动力学治疗中，将光敏剂预先注 入机体，由于肿瘤组织高吸收、低代谢，一段时间后会特异性沉积在肿瘤组织。再以特定波 长的光照射激活光敏剂，产生单线态氧和自由基等杀死肿瘤细胞，达到治疗目的。

作为一种入侵性最小的治疗手段，光动力疗法在生物技术领域引发了人们极大的研究兴 趣。但是，目前用于临床的光动力疗法存在一个普遍的问题，即大部分光敏剂仅能吸收波长 位于400-700nm波段的可见光，因此其光化学反应只能被可见光激活，若要实施光动力疗法， 必须用可见光照射注射有光敏剂的生物组织。而生物组织对可见光的吸收很强，导致可见光 在生物组织内的穿透深度很小，仅有几个毫米，无法到达组织内部，只能作用于组织的表皮， 如皮肤、食道、口腔粘膜、肺癌、膀肌等表浅病理组织，因而其临床应用受到了很大的限制， 仅能用于体表恶性肿瘤、食管癌、胃肠道肿瘤、口腔肿瘤、膀胱癌等的治疗。如果能够在组 织穿透力很强的近红外(near-infrared，NIR)光的照射下实施光动力疗法，就可以突破这些 局限，原因是生物组织对近红外光几乎没有吸收，与可见光相比，近红外光的组织穿透深度 更大，而且对健康的生物组织伤害更小。然而，由于大多数光敏剂只能吸收可见光，不能吸 收近红外光，因此，能够在近红外光照射下发射高强度可见光的上转换荧光材料被人们寄予 厚望，它们能够作为光转换器，首先将所吸收的近红外光转化为可见光，然后由可见光激活 光敏剂的光化学反应，从而解决传统PDT所面临的问题，为深层肿瘤的光动力学治疗提供可 能。

2007年，Zhang等人率先报道了利用上转换荧光纳米粒子在癌症光动力学治疗中应用的机 理。他们首先制备了二氧化硅薄层包覆的NaYF₄:Yb,Er(NaYF₄:Yb,Er@SiO₂)上转换荧光纳 米粒子，该纳米材料能够在波长为974nm的近红外光照射下发出波长为537nm和635nm的上 转换荧光，其中537nm的荧光恰好可以被最大光吸收波长为540nm的光敏剂MC540所吸收， 并激活MC540的光化学反应，进一步用NaYF₄:Yb,Er负载光敏剂MC540，所制得的NaYF₄:Yb, Er@SiO₂-MC540复合纳米粒子对癌细胞有明显的光动力疗效(J.Am.Chem.Soc.,2007,129, 4526-4527)。自此，科研工作者们就一直致力于开发新型的上转换荧光材料，并将其作为光 动力药物载体，负载各种光敏剂。

但目前来讲，能够用作光动力药物载体的上转换荧光材料种类仍然很少。其主要原因:一 是上转换材料的发光波长与光敏剂的吸收波长不匹配，无法有效激活光敏剂的光化学反应； 二是上转换荧光材料的颗粒尺寸较大，不能被细胞吞噬，因此无法将所负载的光敏剂运送到 细胞中。

发明内容

本发明针对可用作光动力药物载体的上转换荧光材料种类较少的问题，提供了一种新型 上转换荧光材料的制备方法，通过该方法制备了铒掺杂磷酸镱(YbPO₄:Er)上转换荧光微米 颗粒，该材料能够负载光敏剂部花青540，并能在近红外光的照射下发出绿色荧光，其发光 波长与光敏剂部花青540的最大光吸收波长非常接近，可有效激活部花青540的光化学反应。 该材料粒径小，生物相容性好，能够被癌细胞吞噬，可以将所负载的光敏剂直接运送到细胞 中，进一步提高了光动力疗法的治疗效果。

为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

本发明所述上转换荧光微米颗粒的制备过程：

将硝酸镱Yb(NO₃)₃、硝酸铒Er(NO₃)₃、磷酸氢二铵(NH₄)₂HPO₄溶解于溶剂中，转移至高 压釜中溶剂热反应12小时后，进行高温烧结制备铒掺杂磷酸镱(YbPO₄:Er)上转换荧光微米 颗粒。

所述的硝酸镱Yb(NO₃)₃与硝酸铒Er(NO₃)₃的物质量之比为100:1～100:5，优选为100:2.5； 硝酸镱Yb(NO₃)₃与硝酸铒Er(NO₃)₃的摩尔数之和与磷酸氢二铵(NH₄)₂HPO₄的摩尔数之比为 1:1。

所述的溶剂为乙二醇和丙三醇的混合溶剂，乙二醇和丙三醇的体积比为1:5～5:1，优选为 3:1。

所述的溶剂热反应温度为100～200℃，优选为180℃。

所述的高温烧结温度为800～1200℃，优选为1200℃。

上述方法制备的YbPO₄:Er微米颗粒为球形颗粒，尺寸约为1微米，能够负载光动力药物 光敏剂部花青540(MC540)。所述的YbPO₄:Er微米颗粒在980nm近红外激光的激发下，能 够发射出主峰位于550nm的上转换荧光，其发光波长与光敏剂部花青540的最大光吸收波长 540nm非常匹配，错配度仅为10nm。

所述YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒用作光动力药物载体的方法如下：

称取一定量的YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒和适量的光动力药物MC540，加入适量超 纯水，于常温条件下搅拌24小时后，将产物离心、洗涤、真空干燥，获得负载有光动力药物 MC540的YbPO₄:Er-MC540复合微米颗粒。

由上述技术方案可知，本发明以硝酸镱、硝酸铒、磷酸氢二铵为主要原料，乙二醇和丙 三醇为溶剂，采用溶剂热并高温烧结法制备了能够发射上转换荧光的YbPO₄:Er微米颗粒，该 微米颗粒可以激活并负载光敏剂MC540，制成具有光动力疗效的YbPO₄:Er-MC540复合微米 颗粒。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的主发光峰位于550nm，与光敏剂MC540的最大光 吸收波长540nm非常接近，错配度仅为10nm，克服了其它上转换材料发光波长与光敏剂吸 收波长不匹配的缺点，因而可有效激活光敏剂MC540的光化学反应。

(2)YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的粒径小，生物相容性好，能够被细胞吞噬，克服 了其它上转换载体材料不能被细胞吞噬、无法将所负载的光敏剂运送到细胞内部的缺点。

(3)本发明所公开的YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒可用于负载光敏剂MC540，在深层 肿瘤的光动力诊疗领域中有很好的应用前景。

附图说明

图1：YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的粉末X射线衍射图谱。

图2：YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的扫描电子显微镜照片。

图3：YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的荧光光谱图(激发波长λ_EX＝980nm)。

图4：(a)光敏剂部花青540(MC540)水溶液；(b)YbPO₄:Er-MC540复合微粒的水分 散液；(c)YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的水分散液的紫外-可见吸收光谱图。

图5：YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的水分散液、光敏剂部花青540(MC540)水溶液、 YbPO₄:Er-MC540复合微粒的水分散液。

图6：不同浓度的YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒与人肝癌细胞(HepG2细胞)共培养24小 时后，细胞的相对增殖率柱状图。

图7：YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒与人肝癌细胞(HepG2细胞)共培养12小时后，细胞 的激光共聚焦显微镜照片。

图8：不同浓度的YbPO₄:Er-MC540复合微粒对人肝癌细胞(HepG2细胞)的光照毒性及暗 毒性的柱状图。

具体实施方式

实施例1

1、YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的制备

步骤：

(1)称取0.0718g Yb(NO₃)₃，0.0017g Er(NO₃)₃，0.0542g(NH₄)₂HPO₄，加入30mL乙 二醇和10mL丙三醇，在常温下充分搅拌溶解；

(2)将上述溶解产物转移入50mL反应釜中，180℃下溶剂热反应12h。

(3)待反应结束溶液冷却后，取出样品进行离心，离心沉淀洗涤后进行1200℃高温烧 结。

结果：

由附图1产物的粉末X射线衍射谱图可见，制备得到的产物为纯度很高的YbPO₄，Er 元素由于掺杂浓度较低，无法由粉末X射线衍射谱图获取信息。由附图2产物的扫描电子显 微镜照片可见，制备得到的YbPO₄:Er为微米级别的球形颗粒，尺寸约为1μm。由附图3产 物的荧光光谱图可见，在980nm近红外激光的激发下，制备得到的YbPO₄:Er微米颗粒能够 发射出高强度的上转换荧光，其主发光峰位于550nm附近，与附图4曲线a显示的光敏剂 MC540的最大光吸收波长540nm非常接近。良好的荧光性能也说明Er元素成功掺杂进了 YbPO₄的晶格中。

2、YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒负载光敏剂MC540

步骤：

(1)称取适量实施例1中所制备的YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒，分散于超纯水中， 配成浓度为200μg/mL的水分散液；称取适量光敏剂MC540溶解于超纯水中，获得浓度为 20μm的光敏剂MC540的水溶液。

(2)将上述YbPO₄:Er水分散液和光敏剂MC540的水溶液于常温条件下混合，搅拌24 小时后，将产物离心，以去除未负载的光敏剂MC540，再将离心沉淀重新分散于超纯水中， 获得负载有光动力药物MC540的YbPO₄:Er-MC540复合微粒的水分散液。

结果：

由附图5可见，MC540的水溶液呈紫红色，YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的水分散液接 近于无色溶液，与MC540复合后明显变为紫红色，而且由附图4的曲线b可以看出， YbPO₄:Er-MC540复合微粒的紫外-可见吸收光谱具有明显的归属于MC540的吸收峰，而这一 吸收峰在未负载MC540的YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的紫外-可见吸收光谱中并没有出现 (见附图4曲线c)，说明YbPO₄:Er微米颗粒能够有效负载光敏剂MC540。

3、MTT法评价YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒细胞毒性实验

步骤：

(1)将人肝癌细胞以4000-6000个/孔的密度接种于96孔培养板中，于细胞培养箱中培养 24小时(5％CO₂，37℃)。

(2)称取适量实施例1中所制备的YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒，分散于适量细胞培养 液中，令YbPO₄:Er质量浓度为125～1000μg/mL。

(3)取上述不同浓度的YbPO₄:Er各100μL，注入96孔培养板中，每个浓度6孔，与人肝 癌细胞共培养12小时(5％CO₂，37℃)。

(4)吸除96孔培养板中的YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒，每孔各加入20μL四甲基偶氮 咗盐(MTT)，继续培养4小时(5％CO₂，37℃)。

(5)终止培养，每孔各加入150μL二甲基亚砜，37℃恒温震荡10min，用酶标仪测定各 个孔在490nm的光密度OD值。

(6)以不与YbPO₄:Er共培养的细胞为对照组，用酶标仪测定该组各个孔在490nm的光密 度OD值。

(7)细胞的相对增殖率按如下公式计算：

结果：

由附图6可见，YbPO₄:Er微米颗粒即使在1000μg/mL的高浓度下，细胞的相对增殖率，即 细胞存活率仍达到95％以上，说明所制得的YbPO₄:Er微米颗粒具有很低的细胞毒性，生物相 容性很好。

4、细胞吞噬实验

步骤：

称取1mg实施例1中所制备的YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒，分散于5mL细胞培养液中， 与人肝癌细胞共培养12小时后，吸除培养液，用PBS清洗细胞3次，以去除未被吞噬的YbPO₄:Er 微米颗粒，然后用激光共聚焦显微镜对细胞进行观察。

结果：

由附图7可见，YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒能够被人肝癌细胞所吞噬，吞噬的颗粒大多 位于细胞的细胞质中。细胞吞噬YbPO₄:Er微米颗粒后仍能保持良好的纺锤体形、三角形等形 态，而并非脱壁濒死细胞的球形形态，说明细胞的存活状态良好，仍能够伸出伪足贴附在培 养板表面生长，这进一步表明所制备的YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒具有很好的生物相容性。

5、光动力治疗实验

步骤：

(1)取适量实施例3所制备的YbPO₄:Er-MC540复合微粒，分散于细胞培养液中，其中所 含的YbPO₄:Er的质量浓度为125～1000μg/mL。

(2)将上述不同浓度的YbPO₄:Er-MC540复合微粒与人肝癌细胞共同培养12小时，然后 将细胞在980nm激光(功率密度0.5W/cm²)下辐照3分钟。为了避免980nm激光长时间辐照 可能导致的过热效应，当激光照射1分钟后，间隔1分钟再继续照射，总照射时间为3分钟。

(3)采用MTT法测得细胞相对增殖率，并与未光照组的细胞相对增殖率进行比较。

结果：

从附图8可以看出，随着YbPO₄:Er-MC540复合微粒质量浓度的增加，细胞相对增殖率 呈下降趋势。而且，在各个YbPO₄:Er-MC540质量浓度下，经过光照后的实验组(图8中的 1号组)的细胞相对增殖率相比于未光照组(图8中的2号组)均有显著下降，这充分说明 YbPO₄:Er-MC540复合微粒具有显著的光动力疗效。

实施例2

YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的制备

步骤：

(1)称取0.0718g Yb(NO₃)₃，0.0035g Er(NO₃)₃，0.0277g(NH₄)₂HPO₄，加入20mL乙 二醇和20mL丙三醇，在常温下充分搅拌溶解；

(2)将上述溶解产物转移入50mL反应釜中，150℃下溶剂热反应12h。

(3)待反应结束溶液冷却后，取出样品进行离心，离心沉淀洗涤后进行800℃高温烧结。

实施例3

YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的制备

步骤：

(1)称取0.1077g Yb(NO₃)₃，0.0021g Er(NO₃)₃，0.0404g(NH₄)₂HPO₄，加入10mL乙 二醇和30mL丙三醇，在常温下充分搅拌溶解；

(2)将上述溶解产物转移入容积为50mL的反应釜中，200℃下溶剂热反应12h。

(3)待反应结束溶液冷却后，取出样品进行离心，离心沉淀洗涤后进行1100℃高温烧 结。

实施例4

YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的制备

步骤：

(1)称取0.1436g Yb(NO₃)₃，0.0035g Er(NO₃)₃，0.0541g(NH₄)₂HPO₄，加入25mL乙 二醇和15mL丙三醇，在常温下充分搅拌溶解；

(2)将上述溶解产物转移入容积为50mL的反应釜中，180℃下溶剂热反应12h。

(3)待反应结束溶液冷却后，取出样品进行离心，离心沉淀洗涤后进行1200℃高温烧 结。

实施例5

YbPO₄:Er上转换荧光微米颗粒的制备

步骤：

(1)称取0.0359g Yb(NO₃)₃，0.0014g Er(NO₃)₃，0.0137g(NH₄)₂HPO₄，加入15mL乙 二醇和25mL丙三醇，在常温下充分搅拌溶解；

(2)将上述溶解产物转移入容积为50mL的反应釜中，120℃下溶剂热反应12h。

(3)待反应结束溶液冷却后，取出样品进行离心，离心沉淀洗涤后进行900℃高温烧结。