结合有含半胱氨酸残基的基序的修饰抗体,含该修饰抗体的修饰抗体-药物缀合物以及其制造方法

摘要

本发明涉及一种抗体，其中由包括一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸或肽序列组成的基序结合于亲本抗体的末端，特别是亲本抗体的重链末端。并且，本发明涉及一种包括结合于所述抗体的药物的修饰抗体-药物缀合物(mADC)，以及一种用于制造所述抗体或所述修饰抗体-药物缀合物的方法。由于其对抗原的高度特异性，根据本发明的修饰抗体-药物缀合物能够准确地递送药物至靶细胞，因而能够提高药物的治疗效果。并且，其能够提高药物，特别是抗癌药物的可用性，所述抗癌药物尽管具有高功效，但由于其毒性而使用受到限制。而且，本发明涉及用于治疗疾病，特别是癌症的组合物，所述组合物包括修饰抗体-药物缀合物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种修饰抗体，该修饰抗体包括结合于亲本抗体，优选所述 亲本抗体的末端，更优选所述亲本抗体的重链或轻链的末端，最优选所述亲 本抗体的重链或轻链的C末端的含半胱氨酸(Cys)的基序(motif)；一种包括结 合于所述修饰抗体且用于诊断或治疗的药物的修饰抗体-药物缀合物 (mADC)；以及一种用于制造所述修饰抗体或所述修饰抗体-药物缀合物的方 法。

由于包括在缀合物中的亲本抗体的高度抗原特异性，根据本发明的修饰 抗体-药物缀合物能够准确地将药物递送至靶细胞，因而能够提高药物的治疗 效果。而且，其能够提高药物，特别是具有高抗癌功效的抗癌药物的效用， 所述具有高抗癌功效的抗癌药物由于毒性而使用受到限制。

此外，本发明涉及一种治疗疾病(特别是癌症)的组合物，所述组合物 包括所述修饰抗体-药物缀合物，本发明还涉及一种利用所述修饰抗体-药物 缀合物来治疗疾病的方法。

根据本发明的修饰抗体-药物缀合物可含有许多能够用于与药物缀合的 半胱氨酸残基，因为含有一个或多个半胱氨酸残基的基序结合于亲本抗体。 因而，其能够包含大量结合于其上的药物，且该大量的结合药物能够被有效 地递送至靶细胞或靶组织。此外，由于能够容易地控制结合于亲本抗体的半 胱氨酸残基的数量，所以能够将包含在该修饰抗体-药物缀合物(mADC)内的 药物的量容易地控制在所希望的水平。

背景技术

在生物制药当中，对利用抗体的治疗剂被进行了最为积极的研究，该治 疗剂特异性地结合于在特定疾病中特异性地表达的靶标(即抗原)。特别地， 正在积极地进行对在癌细胞表面上表达的肿瘤相关抗原的识别，并且利用结 合于所述抗原以抑制细胞生长或诱导细胞死亡的抗体(即抗癌抗体)来诊断 和治疗肿瘤的方法正在被广泛使用，这些方法的领域也具有非常好的前景。

这种抗癌抗体具有非常高的靶特异性，但它们在癌细胞上的细胞毒性效 应通常低于现有的细胞毒性药物(即抗癌药物或抗癌剂)的细胞毒性效果。 故在许多情况下，这些抗癌抗体被用于与细胞毒性药物或其它细胞增殖抑制 药物的组合治疗。

关于上述组合治疗，对修饰抗体-药物缀合物(mADC)进行了积极的研究， 其中结合的细胞毒性药物的治疗效果提高同时毒性降低。人们认识到，当使 用修饰抗体-药物缀合物时，能够减少药物的全身毒性并且能够增加药物的细 胞毒性，尤其是在其中具有过表达的靶标的细胞中(特别是癌细胞中)，从 而提高药物的治疗效果。

事实上，已经成功地开发出用于治疗非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin  lymphoma)或急性骨髓性白血病的、包含缀合于抗体的细胞毒性药物或放射 性同位素的修饰抗体-药物缀合物，如EVALIN^TM[Witzig等人，J.Clin.Oncol， 2002，20(15):3262-3269]或MYLOTARG^TM[Drugs of the Future，2000， 25(7):686]。此外，已经进行了许多尝试以将高毒性的美坦新(mertansine)(如 莫坎妥单抗美坦新(cantuzumab mertansine)(Immunogen，Inc.[Xie等人，J.of  Pharm.and Exp.Ther.2004，308(3):1073-1082])或曲妥单抗美坦新 (trastuzumab mertansine)(Roche[Isakoff等人，J.Clin.Oncol.2011，29(4): 351-4]))与抗体缀合，或者将其它的细胞毒性药物，例如多拉司他汀(dolastatin) 衍生物，如奥里斯他汀肽(auristatin peptides)、奥里斯他汀E(auristatin E，AE)、 单甲基奥里斯他汀(MMAE)或MMAF与抗体缀合，所述抗体如cBR96(特 异于癌上的Lewis Y)、对血液系统恶性肿瘤上的CD30特异的cAC1O、或 用于治疗表达CD20癌症的抗CD20抗体、或针对免疫失调的Rituxan、用于 治疗结肠癌的抗EphB2R抗体、2H9、抗IL-8或E选择素(E-selectin)抗体 ([Klussman等人，Bioconjugate Chemistry，2004，15(4):765-773]；[Doronina 等人，Nature Biotechnology，2003，21(7):778-784]；[Francisco等人，Blood， 2003，102(4):1458-1465])US2004/0018194A1)WO04/032828A3；[Mao等 人，Cancer Research，2004，64(3):781-788]；[Bhaskar等人，Cancer Res，2003， 63:6387-6394])。

另外，还已经对开发利用道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、 甲氨蝶呤(methotrexate)或长春地辛(vindesine)的修饰抗体-药物缀合物进行了 尝试。已知诸如白喉毒素的细菌毒素、诸如蓖麻毒素的植物毒素或诸如格尔 德霉素([Mandler等人，J.of the Nat.Cancer Inst，2000，92(19):1573-1581]； [Mandler等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters，2000，10:1025-1028]； [Mandler等人，Bioconjugate Chem，2002，13:786-791])，类美坦素(maytansinoid) ([EP1391213A1]；[Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93:8618-8623]) 或卡奇霉素(calicheamicin)([Lode等人，Cancer Res，1998，58:2928]；[Hinman 等人，Cancer Res，1993，53:3336-3342])的小分子可以用作抗体-药物缀合物 中的药物。这些细胞毒性药物通过诸如微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构 酶抑制之类的机制来表现细胞毒性和细胞增殖抑制效果。

当采用用于诱导药物与抗体之间共价键连接的常规工艺来制备如上所述 的抗体-药物缀合物时，药物将结合于抗体中的许多位点，产生非均匀性的混 合物。例如细胞毒性药物很可能通过包含在抗体中的许多赖氨酸残基而结合 于抗体，从而产生非均匀性的抗体-药物缀合物混合物。而且，该非均匀性的 混合物根据反应条件可能具有范围从0到大约8的不同药物结合分布，这意 味着每单位抗体所结合的药物分子的数量有所变化。

而且，对于具有限定数量的药物结合的抗体药物缀合物而言，根据不同 的缀合位点，还可能有另一种潜在的非均匀性。对这种非均匀性的混合物进 行均匀性纯化并不适合用于药物的大规模生产([Hamblett等人，Clin.Cancer  Res，2003，10，7063-7070]，[Wang等人，Protein Sci.2005，14，2436-2446])。

将药物缀合于抗体的另一种方法是通过还原剂来还原抗体中半胱氨酸残 基之间的二硫键，然后将药物缀合于被还原的半胱氨酸残基的游离巯基基团。 这种方法同样具有缺点，即抗体固有的特性可能失去且产生大量的非均匀性 的混合物。具体而言，免疫球蛋白M是一个二硫键连接的五聚体的实例，而 免疫球蛋白G是一个以内部二硫桥将亚基键接在一起的蛋白质的实例。在这 种蛋白质中，用诸如二硫苏糖醇(DTT)或硒醇之类的试剂还原二硫键会生 成反应性游离巯基([Singh等人，Anal.Biochem.2002，304:147-156])。这种 途径可导致抗体三级结构和抗原结合特异性的丧失([Jagath等人，Nature  Biotechnology，2008，26(8):925-32])。

如上所述的常规的抗体-药物缀合方法的代表性缺点在于难以精确地控 制抗体中的药物缀合位点和缀合药物的数量。在一种为克服这一问题并引入 游离巯基基团的尝试中，特定的氨基酸被半胱氨酸所取代，而取代的半胱氨 酸不会损害抗体功能。为此，在预测抗体中每个可能的突变位点中的巯基基 团的反应性之后，开发了针对最佳半胱氨酸突变体的筛选方法(韩国专利公开 第2007-0054682号，“ThioFab technology”)。通过该方法生产的曲妥单抗美 坦新的抗体-药物缀合物在临床试验中用于治疗转移性乳腺癌([Burris III等 人，J.Clin.Oncol，2011，29(4):398-405])。上述ThioFab技术具有这样的优 点，即对亲本抗体中二硫键的破坏能够通过将新的半胱氨酸引入抗体而最小 化，但是关于结构修饰和亲本抗体功能的担心仍然存在，因为亲本抗体中的 一些氨基酸被半胱氨酸突变。

因此，迫切需要开发一种新的抗体-药物缀合物及其制造方法，其中能够 准确地控制缀合于亲本抗体的药物分子的数量和位置，同时保持亲本抗体的 结构和功能特征。

发明内容

为解决上述存在于现有技术中的问题而做出本发明，本发明的一个目标 在于提供一种新抗体(下文中称为“修饰抗体”)，该抗体包括含有一个或多个 结合于亲本抗体的半胱氨酸残基以提供多个药物结合位点的基序。本发明的 另一目标在于提供一种包含结合于所述修饰抗体的药物的修饰抗体-药物缀 合物。

根据本发明的修饰抗体能够高效地缀合与各种药物，同时保留亲本抗体 的特征，因而其具有高度的靶特异性并且提高了所述缀合药物的治疗效果。

本发明的修饰抗体具有如下优点：其包括含有一个或多个半胱氨酸残基 的基序，因而药物能够缀合于这些半胱氨酸残基并且缀合的药物能够被有效 地递送至靶组织。另外，能够准确地控制能结合药物的半胱氨酸残基的数量， 因而能够控制在修饰抗体-药物缀合物中药物分子的数量或用量。因此，本发 明的修饰抗体-药物缀合物能够用作优异的药物递送系统，该药物递送系统克 服了常规抗体-药物缀合物的问题并能够高效地用于治疗诸如癌症之类的疾 病。

另外，由于根据本发明的修饰抗体-药物缀合物对抗原的高度特异性，从 而能够准确地将药物递送至靶细胞，故其能够提高药物的治疗效果，并且还 改善了药物，特别是抗癌药物的效用，所述抗癌药物尽管具有高抗癌功效， 但由于毒性而使用受到限制。

附图说明

图1是包括含半胱氨酸的曲妥单抗的修饰抗体表达载体的载体图谱。

图2示出在曲妥单抗(右边两道)和含半胱氨酸的曲妥单抗变体 (HR-Cys，左边两道)纯化后的HR-Cys的Western印记图像。

图3示出进行UV-VIS光谱(A)和SDS-PAGE(B)的结果以证实多柔 比星是否缀合于HR-Cys。

图4示出针对Her-M2(Cys)-Alexa488，即Her-M2(Cys)抗体变体与Alexa 488的缀合物，(A)SDS-PAGE凝胶电泳和(B)结合于重链和轻链 每个的Alexa488染料的相对荧光强度分析的结果。

图5示出进行抗增殖MTS测试以检查HR-Cys-DOX与赫赛汀 (Herceptin)、赫赛汀与多柔比星1:2的混合物以及多柔比星相比较在表达 HER2的BT-474细胞中的细胞生长抑制效果的结果。

图6示出进行抗增殖测试以检查HER-M(Cys)-MMAE，即赫赛汀-MMAE 抗体-药物缀合物，与赫赛汀(Herceptin)相比较在表达HER2的SK-BR3细胞 中的细胞生长抑制效果的结果。

图7示出为检查HR-Cys2-MMAE与赫赛汀相比较在表达HER2的 SK-BR-3细胞中的细胞死亡(细胞凋亡)效果，在各种处理浓度下观察半胱 天冬酶(caspase)活性的结果。

图8示出为检查缀合于赫赛汀抗体变体的MMAE与赫赛汀相比较在表 达HER2的SK-BR3细胞中的细胞凋亡效果，在各种处理浓度下观察半胱天 冬酶活性的结果。

具体实施方式

下文将描述本发明的进一步细节。

本发明提供了一种新的修饰抗体，其包括含有一个或多个结合于亲本抗 体的半胱氨酸残基以提供多个抗体药物位点的基序，以及一种包括所述修饰 抗体的修饰抗体-药物缀合物。这种修饰抗体能够缀合于各种药物，同时保留 亲本抗体的特征，因而能够高效地用作修饰抗体-药物缀合物。

如本文所使用，术语“亲本抗体”是指不具有含半胱氨酸的基序的常规“抗 体”。任何对特定抗原具有结合亲和性和特异性的亲本抗体都可无局限性地用 于本发明。可用于本发明的亲本抗体包括单克隆或多克隆抗体，例如来自诸 如小鼠之类的动物的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和利用转基因小鼠或噬菌 体展示技术开发的人抗体。另外，对于本领域技术人员而言显然的是，诸如 双特异性抗体或抗体片段之类的修饰抗体也可用于本发明。

如本文所使用，术语“抗体片段”是指至少保留了对抗原的结合亲和性的 抗体。抗体片段的实例包括单链抗体、双价抗体、三价抗体、四价抗体、Fab 片段、F(ab’)₂片段、Fd、scFv、结构域抗体、微抗体(miniantibodies)、单链 抗体(scAb)、抗体恒定区的衍生物以及基于蛋白支架(protein scaffold)的人工 抗体。

另外，可用于本发明的亲本抗体的实例包括所有类型的免疫球蛋白分子 (例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl和IgA2)。另外，亲本抗体可以是来自任何物种的抗体。

本发明中的亲本抗体具有对以下物质的结合亲和性和特异性：诸如肿瘤 相关抗原(TAAs)的癌症特异性抗原、细胞表面受体蛋白、除受体之外的细 胞表面蛋白和分子、跨膜蛋白、信号蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调 节因子、与组织发育或分化相关(例如已知或怀疑功能上有助)的分子、淋 巴因子、细胞因子、参与细胞周期调节的分子、参与血管发生(vasculogenesis) 的分子和与血管新生(angiogenesis)有关(例如已知或怀疑功能上有助)的分 子。

具体而言，本发明中的亲本抗体能够结合的抗体包括但不限于：

(1)BMPRIB(骨形态发生蛋白受体IB型；Genbank登录号No. NM_001203)；

(2)E16(LAT1，SLC7A5；Genbank登录号No.NM_003486)；

(3)STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原；Genbank登录号No. NM_012449)；

(4)0772P(CA125，MUC16，Genbank登录号No.AF361486)；

(5)MPF(MPF，MSLN，SMR，巨核细胞促进因子，间皮素；Genbank 登录号No.NM_005823)；

(6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质携带物家族34(磷酸 钠)，成员2，II型钠依赖的磷酸盐转运蛋白3b；Genbank登录号No. NM_006424)；

(7)Sema5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG， 壁板蛋白(Semaphorin)5b Hlog，sema结构域，七个血小板反应蛋白 (thrombospondin)重复(类型1和类型1样)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构 域，(壁板蛋白)5B；Genbank登录号No.AB040878)；

(8)PSCA hlg(2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA 2700050C12，RIKEN cDNA2700050C12；Genbank登录号No.AY358628)；

(9)ETBR(内皮素B型受体；Genbank登录号No.AY275463)；

(10)MSG783(RNF124，假定蛋白质FLJ20315，Genbank登录号No. NM_017763)；

(11)STEAP2(HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2， STMP，前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺六次跨膜上皮抗 原2，六次跨膜前列腺蛋白，Genbank登录号No.AF455138)；

(12)TrpM4(BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，瞬时受体电位 阳离子通道，M亚家族，成员4；Genbank登录号No.NM_017636)；

(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎瘤衍生生长 因子；Genbank登录号No.NP_003203or NM_003212)；

(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/Epstein Barr病毒受体) 或Hs.73792；Genbank登录号No.M26004)；

(15)CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相关β)，B29，Genbank 登录号No.NM_000626)；

(16)FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(含SH2结构域磷酸酶锚蛋白1a)， SPAP1B，SPAP1C；Genbank登录号No.NM_030764)；

(17)HER2(Genbank登录号No.M11730)；

(18)NCA(Genbank登录号No.M18728))；

(19)MDP(Genbank登录号No.BC017023)；

(20)IL20Rα(Genbank登录号No.AF184971)；

(21)Brevican(Genbank登录号No.AF229053)；

(22)EphB2R(Genbank登录号No.NM_004442)；

(23)ASLG659(Genbank登录号No.AX092328)；

(24)PSCA(Genbank登录号No.AJ297436)；

(25)GEDA(Genbank登录号No.AY260763)；

(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体，BR3，NP_443177.1)；

(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型；NP-001762.1)；

(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相关α，与Igβ(CD79B)共价 相互作用并在表面上与IgM分子形成复合物的B细胞特异性蛋白，转导参与 B细胞分化的信号；Genbank登录号No.NP_001774.1)；

(29)CXCR5(Burkitt's淋巴瘤受体1，由CXCL13趋化因子活化的G蛋 白偶联受体，在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥功能，在HIV-2感染中起作 用并参与AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发展；Genbank登录No. NP_001707.1)；

(30)HLA-DOB(与肽结合并将肽递呈到CD4+T淋巴细胞的MHC II类 分子的β亚单元(la抗原)；Genbank登录号No.NP_002111.1)；

(31)P2X5(嘌呤能受体(Purinergic receptor)P2X配体门控离子通道5， 由细胞外ATP门控的离子通道，可参与突触传递和神经发生，缺乏可导致特 发性逼尿肌不稳定的病理生理学；Genbank登录号No.NP_002552.2)；

(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2；Genbank登录号No. NP_001773.1)；

(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复(LRR)家族的I型 膜蛋白，调节B细胞活性和细胞凋亡，功能丧失与在系统性红斑狼疮患者中 增加的疾病活性相关；Genbank登录号No.NP_005573.1)；

(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，含类C2型Ig免疫球蛋白Fc结构域和ITAM 结构域的假定受体，可在B淋巴细胞分化中起作用；Genbank登录号No. NP_443170.1)；

(35)IRTA2(免疫球蛋白超级家族受体转运相关蛋白2，在B细胞发育 和淋巴瘤发生中可能起作用的假定免疫受体；通过转运对基因的失调控在一 些B细胞恶性肿瘤中发生；Genbank登录号No.NP_112571.1)；和

(36)TENB2(假定跨膜蛋白聚糖，与生长因子和卵泡抑素的 EGF/heregulin家族有关；Genbank登录号No.AF179274)。另外，抗原的实 例包括可用于治疗和诊断的所有抗原。

在优选的实施方式中，本发明中的亲本抗体对ErbB受体具有结合亲和 性和特异性，所述ErbB受体选自EGFR、HER2、HER3和HER4以及其它 癌症抗原。

特别地，用于本发明的亲本抗体包括选自以下抗体组的一种或多种：曲 妥单抗(商品名：赫赛汀)、利妥昔单抗(rituximab，商品名：美罗华(Rituxan))、 贝伐单抗(bevacizumab，商品名：安维(Avastin))、西妥昔单抗(cetuximab， 商品名：尔必得舒(Erbitux))、cBR96、cAClO、抗CD20抗体、抗EphB2 抗体、抗IL-8、E-选择素抗体、抗MUC16抗体和抗CD30抗体，但本发明 的亲本抗体并不限于此。

HER2是指一种表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员，是涉及乳腺癌细 胞的增殖和存活的一种重要的信号级联放大。已知EGFR家族的受体酪氨酸 激酶是由erb1、erb2/HER2、erb3和erb4组成，并且除了细胞增殖和增殖之 外还涉及细胞的粘附(adhesion)、迁移和分化。

没有与erb家族四个成员中的erb2/HER2相结合的配体，但erb2/HER2 已知是乳腺癌中最可能的癌基因(oncogene)。如果HER2的水平正常，则其涉 及正常乳腺组织的生长和发育，但如果HER2非正常地过表达或扩增，则将 打破正常细胞调控，从而在乳腺组织中将形成侵略性的癌细胞。换而言之， 如果HER2被EGFR家族其他成员的寡聚化而活化，则它将使许多下游分子 磷酸化，这将导致许多信号级联放大的活化。涉及细胞增殖的 SOS-Ras-Raf-MEK-MAPK通路和抑制细胞死亡的PI-3K/Akt通路是与癌细胞 增殖相关的代表性机制。

临床前试验和临床试验的结果表明，HER2的过表达是从癌症发展初始 状态出现的重要生物标记物，并且在癌症生长和进程中起着重要作用。已知 HER2的过表达出现在约20-30％的侵润性乳腺癌中，并且还与具较高侵略性 和恶性的乳腺癌的不良预后相关。

根据本发明，含一个或多个半胱氨酸残基的基序与对生长因子受体具特 异性的亲本抗体结合，所述生长因子受体选自HER2受体或EGF受体。并且 将常规的抗癌药物与基序缀合，以获得本发明的修饰抗体-药物缀合物。当将 修饰抗体-药物缀合物以有效抑制患者中肿瘤细胞生长的量施用于患者时，其 能够通过抑制过表达所述生长因子受体的肿瘤细胞的生长同时诱导细胞死亡 而表现出优异的治疗癌症效果。

另外，本发明中的亲本抗体优选为曲妥单抗。尽管曲妥单抗被制备成基 本上没有C末端赖氨酸(Lys)，但本发明的修饰抗体-药物缀合物能够应用于 含赖氨酸(Lys)的曲妥单抗或在其C末端区域不含赖氨酸(Lys)的曲妥单抗，其 中含半胱氨酸(Cys)的基序可以与其结合。

本发明的氨基酸以其已知的三字母或一字母缩写表示。存在于各种核酸 片段中的核苷酸以本领域通常使用的标准单字母名称来指代。

本发明中的含半胱氨酸的基序具有1-100个氨基酸残基，优选为1-50个 氨基酸残基，更优选为1-30个氨基酸残基，最优选为1-10个氨基酸残基， 并且含有一个或多个半胱氨酸残基。特别地，本发明中的含半胱氨酸的基序 含有1-20个半胱氨酸残基，更优选1-10个半胱氨酸残基，甚至更优选1-5 个半胱氨酸残基。

本发明中的含半胱氨酸的基序可以是不具有特定功能的简单肽基序或者 二级或三级结构，优选为具有特定功能的基序或者二级或三级结构。所述特 定功能优选是能够保持/保护半胱氨酸残基的化学缀合能力的性质，但并不限 于此。特别地，含半胱氨酸的基序由于与特定配体或者肽基序本身的二级或 三级结构结合，通过防止或减速半胱氨酸残基的氧化而能够更加有效地保持 半胱氨酸残基的功能。

本发明中的含半胱氨酸的基序具有下式1所表示的结构：

Xa-[(M_Cys)_n-Xb_n]_n    式(1)

其中(M_Cys)_n表示简单半胱氨酸残基或者含有半胱氨酸残基并具有特定功 能的肽基序或二级或三级结构，Xa和Xb_n各独立地表示包括0到20个除半 胱氨酸以外的氨基酸残基的肽，n是1到20范围的整数。

式(1)中，(M_Cys)_n，即(M_Cys)₁、(M_Cys)₂…(M_Cys)_n，可以彼此相同或不同。 同样，Xb_n，即Xb₁、Xb₂…Xb_n，可以彼此相同或不同。

另外，如果式(1)中的(M_Cys)_n是简单半胱氨酸残基，则根据本发明的含半 胱氨酸的基序具有下式(2)所表示的结构：

式(2)

Xa-(Cys-Xb_n)_n

其中Xa、Xb_n和n的定义与式1中相同。

同样，如果式(1)中的(M_Cys)_n是含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽基 序或二级或三级结构，则(M_Cys)_n可优选为含有半胱氨酸残基的金属离子结合 基序。已知含有半胱氨酸残基的金属离子结合基序能够结合金属离子，以抑 制半胱氨酸残基的氧化，从而有效地保留半胱氨酸残基的烷基化反应性(Van  Horn等人(2003)J.Biol.Inorg.Chem.8:601-610)。

可用于本发明的含有半胱氨酸残基的金属离子结合基序包括但不限于， 用于控制体内金属离子浓度的金属离子螯合剂(Zhang等人(2012)Biochem. Genet.50(7-8):585-599)，作用为将金属离子传递到细胞外或内的特定位置的 分子伴侣(Ansbacher和Shurki，J.Phys.Chem.B(2012)116(15):4425-4432； Allen等人(2012)Biochemistry51(7):1439-48；Click等人(2012)H.Comput. Chem.33(11):1142-51)，根据金属离子浓度调节转录的转录调节因子(Gunther 等人(2012)Biochim.Biophys.Acta.1823(2):476-483；Sitthisak等人(2012) FEMS Microbiol.Lett.327(2):126-133)，广泛地存在于许多蛋白质中并参与蛋 白质与蛋白质相互作用或蛋白质与DNA相互作用的锌指基序(MacPherson等 人(2006)Microbiol.Mol.Bio.Rev.70(3):583-604；Schaeffer等人(2012)Nucleic  Acids Res.40(18):9298-9307)，和来自各种酶的基序(Zielazinski等人(2012) Biochemistry51(40):7891-7900；Zhou等人(2012)FEBS J.279(2):285-298； Cochran等人(2011)Nat.Struct.Mol.Biol.19(1):122-127)。金属离子结合基序 包含半胱氨酸残基作为其必要的结合基团，这种金属离子结合基序可用于生 产本发明的修饰抗体-药物缀合物。

本发明中的金属离子结合基序优选实例包括但不限于，锌指蛋白的C₂H₂组(Cys₂His₂类：Cys-X_2-4-Cys-X₁₂-His-X_3-5-His)，C₄组(C4类： Cys-X₂-Cys-X_n-Cys-X₂-Cys-X_m-Cys-X₂-Cys-X_n-Cys-X₂-Cys)或C₆组(C6类： Cys-X₂-Cys-X₆-Cys-X_5-12-Cys-X₂-Cys-X_6-8-Cys，诸如Cys-X-X-Cys或 Cys-X-Cys的Cys-X_m-Cys基序，频繁地发现于转录调节蛋白中的 C-Q-C-Q-C-A-C基序或Met-X-Cys-X-X-Cys基序，金属螯合蛋白，金属离子 转运蛋白，超氧化物歧化酶或类似物，膜蛋白ATP酶的Ser-Pro-Cys基序等 等。在上述金属结合肽基序中，X表示除Cys之外的氨基酸残基；m是1到 10范围的整数，优选1到5范围的整数；X_m或X_m-q表示除Cys之外的氨基 酸残基，其数量由m或m到q所标明。

更具体而言，能够用于本发明的锌指蛋白的金属离子结合基序的实例包 括但不限于：

YKCKQCGKAFGCPSNLRRHGRTH(SEQ ID NO:1)，

YQCNICGGKCFSCNSNLHRHQRTH(SEQ ID NO:2)，

YSCGICGKSFSDSSAKRRHCILH(SEQ ID NO:3)，

YTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTH(SEQ ID NO:4)，

YRCKYCDRSFSDSSNLQRHVRNIH(SEQ ID NO:5)，

YKCKECGKAFNHSSNFNKHHRIH(SEQ ID NO:6)，

FKCPVCGKAFRHSSSLVRHQRTH(SEQ ID NO:7)，

YRCKYCCDRSFSISSNLQRHVRNIH(SEQ ID NO:8)，

YECDHCGKAFSIGSNLNVHRRIH(SEQ ID NO:9)，

YGCHLCCKAFSKSSNLRRHEMIH(SEQ ID NO:10)，

YKCKECGQAFRQRAHLIRHHKLH(SEQ ID NO:11)，

YKCHQCGKAFIQSFNLRRHERTH(SEQ ID NO:12)，

FQCNQCGASFTQKGNLNRHIKLH(SEQ ID NO:13)，

YTCSYCGKSFTQSNTLKQHTRIH(SEQ ID NO:14)，

YACHLCGKAFTQSSHRRHEKTH(SEQ ID NO:15)，

YKCGQCGKFYSQVSHLTRHQKIH(SEQ ID NO:16)，

YACHLCGKAFTQCSHLRRHEKTH(SEQ ID NO:17)，

YACHLCAKAFIQCSHLRRHEKTH(SEQ ID NO:18)，

YVCRECGRGFRQHSHLVRHKRTH(SEQ ID NO:19)，

YKCEECEGKAFRQSSHLTTHKIIH(SEQ ID NO:20)，

YECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTH(SEQ ID NO:21)，

YMCSECGRGFSQKSNLTIHQRTH(SEQ ID NO:22)，

YKCEECGKAFTQSSNLTKHKKIH(SEQ ID NO:23)，

FECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:24)，

YVCRECRRGFSQKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:25)，

YECEKCGKAFNQSSNLTRHKKSH(SEQ ID NO:26)，

YECVQCGKSYSQSSNLFRHQRRH(SEQ ID NO:27)，

YECVQCGKGFTQSSNLITHQRVH(SEQ ID NO:28)，

YECNTCRKTFSQKSNLIVHQRTH(SEQ ID NO:29)，

YVCSKCGKAFTQSSNLTVHQKIH(SEQ ID NO:30)，

YKCDECGKNFTQSSNLIVHKRIH(SEQ ID NO:31)，

YECDVCGKTFTQKSNLGVHQRTH(SEQ ID NO:32)，

YKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTH(SEQ ID NO:33)，

YECQDCGRAFNQNSSLGRHKRTH(SEQ ID NO:34)，

YECNECGKFFSQSSSLIRHRRSH(SEQ ID NO:35)，

YKCEECGKAFNQSSTLTRHKIVH(SEQ ID NO:36)，

YECNECGKAFAQNSTLRVHQRIH(SEQ ID NO:37)，

YEVHDCGKSFRQSTHTLTQHRRIH(SEQ ID NO:38)，

YECHDCGKSFRQSTHLTRHRRIH(SEQ ID NO:39)，

HKCLECGKCFSQNTHLTRHQRTH(SEQ ID NO:40)，

YVCDVEGCTWKFARSDELNRHKKRH(SEQ ID NO:41)，

YHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(SEQ ID NO:42)，

YRCSWEGCEWRFARSDELTRHFRKH(SEQ ID NO:43)，

FSCSWKGCERRFARSDELSRHRRTH(SEQ ID NO:44)，

FACSWQDCNKKFARSDELARHYRTH(SEQ ID NO:45)，

YHCNWDGCGWKFARSDELTRHYRKH(SEQ ID NO:46)，

FLCQYCAQRFGRKDHLTRHMKHSH(SEQ ID NO:47)，

CRCNECGKSFSRRDHLVRHQRTH(SEQ ID NO:48)，

FQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTH(SEQ ID NO:49)，

FACEVCGVRFTRNDKLKIHMRKH(SEQ ID NO:50)，

YVCDVEGCTWKFARSDKLNRHKKRH(SEQ ID NO:51)，

YKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIH(SEQ ID NO:52)，

YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH(SEQ ID NO:53)，

YECKECGKAFSSGSNFTRHQRIH(SEQ ID NO:54)，

FHCGYCEKSFSVKDYLTKHIRTH(SEQ ID NO:55)，

YECDHCGKAFSVSSNLNVHRRIH(SEQ ID NO:56)，

YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTH(SEQ ID NO:57)，

YECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIH(SEQ ID NO:58)，

YRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIH(SEQ ID NO:59)，

FACDICGRKFARSDERKRHTKIH(SEQ ID NO:60)，

CPVESCDRRFSRSDELTRHIRIH(SEQ ID NO:61)，

CDICGRKFARSDERKRHTKIH(SEQ ID NO:62)，

等。锌指蛋白的金属离子结合基序可以是选自描述于 http://www.zincfingers.org，http://www.genenames.org/genefamilies/ZF， http://www.scripps.edu/mb/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php， https://zifdb.msi.umn.edu:8444/ZiFDB/，或Macpherson等人(2006)Microbiol. Mol.Biol.Rev.70(3)，583-604中的锌指蛋白的金属离子结合基序的任何一 种，上述文献符合本发明的技术特征。

能够用于本发明的转录调节蛋白、金属螯合蛋白或类似物的金属离子结 合基序的实例包括但不限于以下序列：

CadC蛋白：

CEIFCYDEEKVNRIQGDLQTVDISGVSQILKAIADENRAKITYALCQD EELCVC(SEQ ID NO:63)，

AztR蛋白： DTHLVHLDNVRSSQAQILPTDKAQQMAEIFGVLADTNRIRLLSALASSEL CVC(SEQ ID NO:64)，

ZiaR蛋白：

CDQPLVHLEQVRQVQPEVMSLDQAQQMAEFFSALADPSRLRLMSAL ARQELCVC(SEQ ID NO:65)，

BxmR蛋白：

CDRAHLVDCSRVGDIQTQVLNTAKAQRMAEFFSLLGDANRLRVVSV LAKQELCVC(SEQ ID NO:66)，

ArsR蛋白：

LSDETRLGIVLLLREMGELCVCDLCM(SEQ ID NO:67)， CCTLATGPLSSDESEHYADLFKVLGDPVRLRILSQLAAGGC(SEQ ID  NO:68)，YRAAMPVVRALVAYLTENCCHGTRDC(SEQ ID NO:69)，

CmtR蛋白：

CLRGCGLVVATYEGRQVRYALADSHLARALGELVQVVLAVDTDQPC( SEQ ID NO:70)，

LRDCGLVVTVPDGRRSRYELADERLGHALDDLRAAVVAVDADRTCP DADELECC(SEQ ID NO:71)等。

存在于膜蛋白中的参与细菌信号传导的锌(Zn)结合蛋白具有由一个半胱 氨酸残基和三个组氨酸残基组成的固有金属离子结合基序(Draper等人，J. Bacteriol.2011，193(17)，4338-4345)。这里，金属离子结合基序具有 HXXWFYLX_21-28CXLFMVIGXWFLVIX_18-27HXXH的结构，其中X表示任何 氨基酸，而X_m-q表示除Cys之外的氨基酸残基，其数量由m到q所标明。另 外，迄今为止报道的150个或更多个锌结合蛋白可用作本发明中的金属离子 结合基序。

已知的金属离子转运蛋白包括助阳离子扩散蛋白，Zrt、Irt样蛋白、阳离 子交换蛋白、铜转运蛋白、重金属P型ATP酶、ATP结合盒转运蛋白等 (Hanikenne等人，Plant Physiology2005，137，428-446；Hall和Williams， J.Experimental Botany，2003，54(393)2601-2613)，并且在本发明中可优选使 用以下M-X-C-X-X-C基序，但不限于此：

E.coli ZntA:VSGMDCAACARKVENAVRQLAGVNQVQVLFA(SEQ ID  NO:72)

Tn501MerP:VPGMTCSACPITVKKAISEVEGVSKVDVTFE(SEQ ID  NO:73)

Tn501MerA:ITGMTCDSCAAHVKEALEKVPGVQSALVSY(SEQ ID  NO:74)

S.aureus CadA:VQGFTCANCAGKFEKNVKKIPGVQDAKVNFG(SEQ  ID NO:75)

Human Menkes:VEGMTCNSCVWTIEQQIGKVNGEHHIKVSLE(SEQ  ID NO:76)

Yeast Atx1:VVMTCSGCSGAVNKVLTKLEPDVSKIDIS(SEQ ID NO:77)

Rat Wilsons:GMTCASCVANIERNLRREEGIYSV(SEQ ID NO:78)

Hum Wilsons:YEGMTCQSCVSSIEGKYRKLQGVVRYKVSL(SEQ ID  NO:79)

Rice Cu ATPase:GMSCQGCAGAVRRVLTKMEGVETFDIDME(SEQ  ID NO:80)

H.pylori Cu ATPase:VPSITCSHCVDKIEKFVGEIEGVSFIDANVE(SEQ  ID NO:81)

Ran1:VTGMTCAACSNSVEAALMNVNGVDVGGMTCGGCSASVKKLL ESQPCVASASV(SEQ ID NO:82)

Cpx89:VSGMVCAACSTAVENALLSCSGV(SEQ ID NO:83)

Paa1:DVGGMTCGGCSASVKKILESQP(SEQ ID NO:84)

Cpx1184:DVGGMKCGGCVEHVKKILEEQFGVTSAS(SEQ ID NO:85)。

另外，基于体内发现的野生型金属离子结合基序而人工设计的各种金属 离子结合基序可用于根据本发明的修饰抗体-药物缀合物中。这些金属结合基 序的实例包括但不限于：基于来自锌指蛋白的不含半胱氨酸残基的GGH基 序设计的CGH基序(Van Horn等人，(2003)J.Biol.Inorg.Chem.8:601-610)， 和通过用其他氨基酸残基如苏氨酸、丝氨酸或组氨酸来取代肽基序中的一个 或多个半胱氨酸残基而获得的金属离子结合基序(Jancso等人，(2011) Metallomics3(12):1331-1339)。CGH基序具有以下化学式1表示的结构，且 优选具有在C末端和N末端都有ACGHA的结构：

化学式1

[其中M表示金属离子，R表示除半胱氨酸之外的氨基酸残基，优选为 丙氨酸。]

即使当N末端和C末端的位置颠倒，本发明中的CGH基序仍具有金属 离子结合特性。因而，对本领域技术人员显而易见的是，具有N末端和C末 端颠倒位置的HGC基序落在本发明的CGH基序的范围内。

基于锌指基序人工设计的可用于本发明的金属离子结合基序包括以下金 属结合肽基序(参见Roehm和Berg，J.Am.Chem.Soc.1998，120. 13083-13087)，其通过用甲基半胱氨酸(Me-Cys)取代 PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTH中的半胱氨酸残基或者用半胱氨酸 取代这一序列中的组氨酸残基而获得：

PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTC(SEQ ID NO:86)，

PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTM(SEQ ID NO:87)，

PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHT(Me-C)(SEQ ID NO:88)，

PYK(Me-C)PECGKSFSQKSALVKHQRTHTH(SEQ ID NO:89)，

PYKCPE(Me-C)GKSFSQKSALVKHQRTHTH(SEQ ID NO:90)，和

PYKCPE(Me-C)GKSFSQKSALVKHQR(SEQ ID NO:91)。

在上述金属结合肽基序中，Me-C表示甲基化组氨酸残基。

此外，基于许多迄今为止报道过的金属离子结合蛋白基序人工设计的肽 也可用于本发明中。

基于蛋白质的二级或三级结构的金属离子结合基序包括最频繁存在的β 折叠片、混合的α/β基序和α螺旋结构。α螺旋结构包括具有单链、双链、 三链或四链α螺旋结构的肽。

关于这些多链的α螺旋，例如TRI家族具有G(LKALEEK)₄G结构，其 具有四个LKALEEK肽序列的重复。通过用半胱氨酸取代该TRI家族中的特 定氨基酸而获得的人工设计的金属离子结合肽基序已经被报道(Peakcock等 人，2009.Dalton Trans.7(13).2271-2280)，并且具有以下结构的人工设计的 肽基序可用于本发明中，但不仅限于此：

GLKALEEKCKALEEKLKALEEKLKALEEKG(SEQ ID NO:92)

GLKALEEKLKALEEKLKACEEKLKALEEKG(SEQ ID NO:93)

GLKALEEKCKALEEKLKACEEKLKALEEKG(SEQ ID NO:94)

GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKALEEKG(SEQ ID NO:95)

GLKALEEKLKALEEKLKALEEKCKALEEKG(SEQ ID NO:96)

GLKALEEKLKALEEKLKALEEKLKAAEEKCKALEEKG(SEQ ID  NO:97)

GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKAAEEKCKALEEKG(SEQ ID  NO:98)

ELYALEKELGALEKELACLEKELGALEKELYALEK(SEQ ID NO:99)

KLYALKEKLGALKEKLACLKEKLGALKEKLYALKE(SEQ ID NO:100)

ELYALEKELGALEKELACLKEKLGALKEKLYALKE(SEQ ID NO:101)

KLYALKEKLGALKEKLACLEKELGALEKELYALEK(SEQ ID NO:102)。

另外，许多具有环状结构如环[K1,12](QCGVCGKCIACK)的金属离子结 合肽基序(Nivorozhkin等人2000.Inorg.Chem.39(11)2306-2313)也可用于本 发明。

可用于本发明的修饰抗体中的含组氨酸的金属离子结合基序总结于下表 1中。

表1：可用于本发明的含组氨酸的金属离子结合基序结构

这种含半胱氨酸的基序可以不受限制地结合于亲本抗体的轻链或重链的 N末端或C末端，只要靶药物能够缀合于其上同时保持该亲本抗体的特异性。 基序优选结合于重链或轻链的C末端。特别地，基序结合于重链的C末端， 即亲本抗体的恒定区的末端。如果使用抗体片段，则基序优选结合于片段的 重链的C末端。

然而，只要保持亲本抗体的特异性，本发明中的含半胱氨酸的基序，尤 其是具有金属离子结合功能或某种特定功能的半胱氨酸基序或二级或三级结 构，能够连接到亲本抗体的重链和轻链之外的任何位置，并且可以通过长链 肽接头引入该亲本抗体。众所周知，当通过长链烃接头将药物缀合于抗体的 重链或者轻链(除CDR区外)的位点特异性突变的半胱氨酸或赖氨酸残基 上时，抗体-药物缀合物，其仍然能够保留亲本抗体的结构特征和特异性。因 而，通过长链肽接头连接到亲本抗体的该位置的含半胱氨酸的金属离子结合 肽基序能够提供具有高度均匀性的抗体-药物缀合物同时保留亲本抗体的特 异性。

在根据本发明的修饰抗体中，含半胱氨酸的基序能够通过酰胺键直接与 亲本抗体融合。或者，含半胱氨酸的基序的末端功能基团能够与亲本抗体的 末端功能基团化学结合。或者，所述基序还能够通过使用第一接头而以接头 介导的方式与亲本抗体结合。

药物能够直接缀合于半胱氨酸残基以及结合到亲本抗体上的含半胱氨酸 的基序中的半胱氨酸的硫醇基团(-SH)上，并且也可以通过第二接头连接到半 胱氨酸残基上。

将药物连接到含半胱氨酸的基序的半胱氨酸残基的第二接头的结合可以 通过利用烷基化反应、二硫键交换或硫酯转移反应(transthioesterification)来实 现。第二接头可以是选自如下物质的一种或多种：含卤代乙酰基官能团的烷 基卤化物衍生物，含马来酰亚胺基团的衍生物，环乙亚胺(aziridine)衍生物， 丙烯酰基衍生物(acryloyl)和含氟代苯的芳基卤化物衍生物，等等，但并不限 于此。衍生物可以通过烷基化反应基团、芳基化反应性基团、马来酰亚胺基 团、环乙亚胺基团、丙烯酰基基团、或含吡啶基二硫化物和硫硝基苯甲酸 (thionitrobenzoic acid)的二硫键交换反应基团而结合于所述基序中的半胱氨 酸残基的巯基基团(Bioconjugate techniques，第二版，pp182-192，Gerg  T.Hermanson，ELSVIER)。

例如，使用通常用于连接巯基和接头的马来酰亚胺基团将药物缀合于半 胱氨酸，因为半胱氨酸残基的巯基基团对马来酰亚胺基团的亲核反应性比胺 基或诸如赖氨酸残基之类的其他氨基酸残基的N末端胺基高大约1000倍。 因而在包括马来酰亚胺或碘乙酰胺作为第二接头的修饰抗体-药物缀合物的 情况下，半胱氨酸通过硫醚键结合于药物。一般而言，第二接头具有反应位 点，所述反应位点具有与亲核半胱氨酸反应的亲电子基团。

与本发明的修饰抗体结合的药物可以是具有治疗疾病效果的任何药物。 特别地，优选具有抑制肿瘤细胞增殖效果的治疗癌症药物。

具体而言，可用于本发明的修饰抗体-药物缀合物的药物包括具有细胞毒 性或抑制细胞增殖的效果的任何复合物、分子(moiety)或基团，其实例包括：

(i)能够起到微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或 DNA嵌入剂作用的化学治疗剂；

(ii)能够起到酶作用的蛋白质毒素；

(iii)能够抑制特定癌基因表达的微小RNA(miRNA)、siRNA或shRNA；

(iv)放射性同位素。

这种药物的实例包括但不限于类美坦素、奥里斯他汀、多拉司他汀、单 端孢霉烯(trichothecene)、CC1065(细胞毒性化合物)、卡奇霉素以及其它烯 二炔(enediyne)抗生素、紫杉烷(taxane)、蒽环类(anthracycline)、甲氨蝶呤、 阿霉素(adriamycin)、长春地辛、长春花碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷 (etoposide))、多柔比星、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁 酸氮芥(chlorambucil)、正定霉素(daunorubicin)、道诺霉素(daunomycin)及其立 体异构体、电子等排体(isosteres)、类似物或衍生物，诸如核水解酶(nucleolytic  enzymes)、抗生素之类的其它嵌入剂、酶片段，和诸如细菌、真菌、植物或 动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素之类的毒素，和诸如顺铂(cisplatin)、 CPT-11，多柔比星、紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)之类的各种抗肿 瘤或抗癌剂。

另外，本发明中的药物部分上的亲核基团包括一种或多种选自以下种类 的基团：胺、巯基、羟基、酰肼、肟(oxime)、肼、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、 羧酸肼和芳基酰肼基团，所述基团能够与第二接头部分和第二接头反应剂上 的亲电子基团反应以形成共价键，但所述基团并不限于此。

如上所述，能够通过第二接头部分缀合于抗体的药物分子的数量可以随 着结合于亲本抗体的基序中的半胱氨酸残基数量的增加而增加。

如上所述，根据本发明的修饰抗体能够包括许多半胱氨酸残基，因为含 一个或多个半胱氨酸残基的基序结合于亲本抗体，优选亲本抗体的C末端。 因而，大量药物能够缀合于本发明的修饰抗体，且大量缀合药物能够有效地 递送至靶细胞或靶组织。

并且，因为很容易控制结合于亲本抗体的半胱氨酸残基的数量，所以能 够容易地将修饰抗体-药物缀合物(mADC)中包含的药物的量控制在期望的 水平。这一特征克服了常规修饰抗体-药物缀合物的缺点，并且根据本发明的 新的修饰抗体-药物缀合物能够用作优异的药物递送系统，且能够有效地用于 治疗诸如癌症之类的疾病。

本发明还提供了一种用于制造修饰抗体的方法，所述修饰抗体包括含有 一个或多个结合于亲本抗体的半胱氨酸残基的基序。

亲本抗体能够通过如下方式来制造：构建合适的表达载体，所述合适的 表达载体包含编码亲本抗体的重链或轻链恒定区的核苷酸序列，用所构建的 表达载体转化原核或真核细胞以表达抗体蛋白，分离该抗体蛋白，然后纯化 所分离的抗体蛋白至药物学上可接受的纯度。

本发明中合适的表达载体可包括表达调控元件、例如启动子、起始密码 子、终止密码子、多聚腺苷酸信号和增强子，以及用于膜靶向或分泌的信号 序列。通常存在于原核细胞中的启动子实例包括lac、tac、T3和T7启动子。 存在于真核细胞中的启动子实例包括猿病毒40(SV40)启动子、鼠乳房瘤病毒 (MMTV)启动子、诸如HIV长末端重复(LTR)启动子之类的人免疫缺陷病毒 (HIV)启动子、莫洛尼氏(moloney)病毒启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、 epstein barr病毒(EBV)启动子、rous肉瘤病毒(RSV)启动子以及β-肌动蛋白启 动子，来自人类基因的启动子，例如人、人血红素、人肌肉肌氨酸和人金属 硫蛋白。

表达载体可包括允许选择包含所述载体的宿主细胞的选择性标记物。赋 予选择性表型(例如对药物的抗性、营养需求、对细胞毒素剂的抗性或表面 蛋白的表达)的标记物用作选择性标记物。由于只有表达选择性标记物的细 胞才在用选择试剂处理过的环境中存活，故能够选择出被转化的细胞。并且， 可复制的表达载体可包括具有启动复制的特定核苷酸序列的复制起点。

作为用于表达外源基因的重组表达载体，可以使用各种类型的载体，例 如质粒、病毒或粘粒载体。重组载体的类型没有特别的限制，只要其起到在 诸如原核细胞和真核细胞的各种宿主细胞中表达期望基因并产生期望蛋白质 的功能。然而，优选使用包括表现强活性且能够以高产量产生外源蛋白质的 启动子的载体，所述外源蛋白质保持了同天然存在的蛋白质的相似性。

各种表达宿主/载体组合可用于表达包括含有一个或多个半胱氨酸残基 的基序的亲本抗体或修饰抗体。针对真核宿主的有用的表达载体包括但不限 于：包括来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒 和逆转录病毒的表达控制序列的载体。针对细菌宿主的有用的表达载体包括 细菌质粒，例如来自大肠杆菌(E.coli)的质粒，包括pET、pRSET、pBluescript、 pGEX2T、pUC、col E1、pCR1、pBR322、pMB9以及它们的衍生物，诸如 RP4、噬菌体DNA之类的更广泛的宿主范围质粒，例如λ噬菌体的多种衍生 物，例如λgt10、gt11、NM989，以及其他的DNA噬菌体，如M13和丝状单 链噬菌体。针对酵母细胞的有用的表达载体包括2μm质粒以及其衍生物。针 对昆虫细胞的有用的载体包括pVL941。

另一方面，本发明提供了用上述重组载体转化的宿主细胞。重组载体插 入宿主细胞以形成转化体。待用所述载体转化的合适的宿主细胞可以是原核 细胞，例如E.coli、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌(Streptomyces sp.)、 假单孢菌(Pseudomonas sp.)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌 (Staphylococcus sp.)。并且，宿主细胞可以是真菌细胞，例如曲霉菌(Aspergillus  sp.)，酵母细胞如甲醇酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces sp.)和粗糙脉胞菌(Neurospora  crassa)，低级真核细胞和诸如昆虫细胞之类的高级真核细胞。并且，宿主细 胞可以来自植物和/或哺乳动物。宿主细胞的优选实例包括但不限于PER.C6 细胞、猴肾细胞7(COS7，特别是simian COS细胞)、NSO细胞、SP2/0、 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、W138、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Madin-Darby犬肾 (MDCK)细胞、骨髓瘤细胞系、HuT78细胞、HEK293细胞，以及其它产生 根据本发明的抗体蛋白的哺乳动物宿主细胞。

特别地，为最大化表达效率，本发明中的宿主细胞优选为选自E.coli细 胞、simian COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以及其它产生根据本发明的 抗体蛋白的哺乳动物宿主细胞。更优选地，本发明中的宿主细胞为仓鼠卵巢 细胞CHO-K1。

本发明中，“转化”到宿主细胞中包括用于将核酸引入有机体、细胞、组 织或器官的任何方法，可以如本领域所知那样利用根据宿主细胞的类型所选 择的标准技术来进行。该方法包括但不限于电穿孔、原生质体融合、磷酸钙 (CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、利用碳化硅纤维震荡(agitation)、农杆菌 介导的转化，以及PEG、硫酸葡聚糖、脂质体(lipofectamine)或干燥/抑制所 介导的转化。

如上所述表达的抗体能够从宿主细胞、培养物的上清液或裂解后的细胞 中回收，并利用常规的蛋白质纯化技术纯化，以获得包括含有一个或多个半 胱氨酸残基的基序的修饰抗体。

所述抗体能够通过常规免疫球蛋白纯化步骤，例如琼脂糖凝胶蛋白A法、 烃基磷灰石层析法、凝胶电泳法、透析法或亲和层析法从培养基中分离。

编码含半胱氨酸的基序的核苷酸序列能够与编码亲本抗体的重链恒定区 或轻链恒定区的核苷酸序列融合。利用在亲本抗体中所采用类似的方法，在 原核或真核宿主细胞中转化和表达之后，以这种方式融合的重组载体能够产 生修饰抗体。

另外，通过表达亲本抗体和含一个或多个半胱氨酸残基的基序中的每个， 然后将亲本抗体的末端官能团化学连接到含半胱氨酸的基序的末端官能团， 或者通过第一接头将亲本抗体连接到基序，能够产生本发明的修饰抗体。可 以将药物结合到所产生的具有含半胱氨酸的基序的修饰抗体，从而产生修饰 抗体-药物缀合物(mADC)。

具体而言，能够通过以下方式产生具有多个含半胱氨酸的基序的修饰抗 体-药物缀合物：

(a)将包括含半胱氨酸的基序的亲本抗体与接头反应剂缀合，以形成共 价键结合的抗体-第二接头中间产物，然后向该中间产物加入经活化的药物部 分；或者

(b)将药物部分的亲核基团与第二接头反应剂缀合，以形成共价键结合 的药物-第二接头中间产物，然后将修饰抗体加入含半胱氨酸的基序。

另一方面，本发明提供了一种包括修饰抗体-药物缀合物作为活性成分的 治疗组合物。

在上述组合物中，缀合于修饰抗体-药物缀合物的药物可以是细胞毒性 剂、细胞增殖抑制剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、消炎剂或类似物，但并不 限于此。在癌症治疗中，用于局部递送杀死或抑制肿瘤细胞药物的抗体-药物 缀合物的使用使得通过抗体-抗原相互作用靶向递送药物部分进入肿瘤细胞， 并且药物部分在细胞内积聚。非缀合的药物制剂可能不仅在肿瘤细胞在，也 在正常细胞中引起不可接受水平的毒性。然而，根据本发明的修饰抗体-药物 缀合物由于所述抗体的高度抗原特异性而能够准确地递送药物，提高了药物 的治疗效果。另外，其能够扩大药物特别是抗癌剂的适用性，所述抗癌剂尽 管具有高度的抗癌功效但由于其毒性而使用受到限制。根据本发明，提供了 最大化药物功效同时最小化药物毒性的抗体-药物缀合物。

本发明还提供了一种通过将修饰抗体-药物缀合物作为活性成分而抑制 来自癌症、自体免疫、炎症或传染性疾病的靶细胞增殖的方法。

能够由本发明治疗的癌症可以选自以下癌症中的一种或多种：肝癌、胃 癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头颈部癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、 食道癌、小肠癌、肛门癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、瓣膜 癌、Hodgkin病、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌 和中枢神经系统的癌症。在特定实例中，通过使修饰抗体-药物缀合物与细胞 体外接触，能够抑制HER2-扩增的乳腺癌BT-474细胞的增殖。因而，利用 修饰抗体-药物缀合物作为活性成分抑制靶细胞增殖的本发明方法明显具有 杀死与上述疾病相关的细胞或减少所述细胞的增殖速率的效果。

下文中，将参考实例来更进详细地描述本发明。对本领域普通技术人员 而言显而易见的是，这些实例并不构成对本发明范围的限制，在本发明的技 术理念和范围之内能够做出各种修改和变化。

除非另有定义，如本文所使用的技术或科学术语具有与本发明所属的技 术领域的普通技术人员所理解的相同含义。并且，本文中将省略与现有技术 相同的构造和效果的详细描述。

这种含半胱氨酸的基序可以不受限制地结合于亲本抗体的轻链或重链的 N末端或C末端，只要靶药物能够缀合于其上同时保持该亲本抗体的特异性。 基序优选结合于重链或轻链的C末端。特别地，基序结合于重链的C末端， 即亲本抗体的恒定区的末端。如果使用抗体片段，则基序优选结合于片段的 重链的C末端。

然而，只要保持亲本抗体的特异性，本发明中的含半胱氨酸的基序，尤 其是具有金属离子结合功能或某种特定功能的半胱氨酸基序或二级或三级结 构，能够连接到亲本抗体的重链和轻链之外的任何位置，并且可以通过长链 肽接头引入该亲本抗体。众所周知，当通过长链烃接头将药物缀合于抗体的 重链或者轻链(除CDR区外)的位点特异性突变的半胱氨酸或赖氨酸残基 上时，抗体-药物缀合物，其仍然能够保留亲本抗体的结构特征和特异性。因 而，通过长链肽接头连接到亲本抗体的该位置的含半胱氨酸的金属离子结合 肽基序能够提供具有高度均匀性的抗体-药物缀合物同时保留亲本抗体的特 异性。

在根据本发明的修饰抗体中，含半胱氨酸的基序能够通过酰胺键直接与 亲本抗体融合。或者，含半胱氨酸的基序的末端功能基团能够与亲本抗体的 末端功能基团化学结合。或者，所述基序还能够通过使用第一接头而以接头 介导的方式与亲本抗体结合。

药物能够直接缀合于半胱氨酸残基以及结合到亲本抗体上的含半胱氨酸 的基序中的半胱氨酸的硫醇基团(-SH)上，并且也可以通过第二接头连接到半 胱氨酸残基上。

将药物连接到含半胱氨酸的基序的半胱氨酸残基的第二接头的结合可以 通过利用烷基化反应、二硫键交换或硫酯转移反应(transthioesterification)来实 现。第二接头可以是选自如下物质的一种或多种：含卤代乙酰基官能团的烷 基卤化物衍生物，含马来酰亚胺基团的衍生物，环乙亚胺(aziridine)衍生物， 丙烯酰基衍生物(acryloyl)和含氟代苯的芳基卤化物衍生物，等等，但并不限 于此。衍生物可以通过烷基化反应基团、芳基化反应性基团、马来酰亚胺基 团、环乙亚胺基团、丙烯酰基基团、或含吡啶基二硫化物和硫硝基苯甲酸 (thionitrobenzoic acid)的二硫键交换反应基团而结合于所述基序中的半胱氨 酸残基的巯基基团(Bioconjugate techniques，第二版，pp182-192，Gerg  T.Hermanson，ELSVIER)。

例如，使用通常用于连接巯基和接头的马来酰亚胺基团将药物缀合于半 胱氨酸，因为半胱氨酸残基的巯基基团对马来酰亚胺基团的亲核反应性比胺 基或诸如赖氨酸残基之类的其他氨基酸残基的N末端胺基高大约1000倍。 因而在包括马来酰亚胺或碘乙酰胺作为第二接头的修饰抗体-药物缀合物的 情况下，半胱氨酸通过硫醚键结合于药物。一般而言，第二接头具有反应位 点，所述反应位点具有与亲核半胱氨酸反应的亲电子基团。

与本发明的修饰抗体结合的药物可以是具有治疗疾病效果的任何药物。 特别地，优选具有抑制肿瘤细胞增殖效果的治疗癌症药物。

具体而言，可用于本发明的修饰抗体-药物缀合物的药物包括具有细胞毒 性或抑制细胞增殖的效果的任何复合物、分子(moiety)或基团，其实例包括：

(i)能够起到微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或 DNA嵌入剂作用的化学治疗剂；

(ii)能够起到酶作用的蛋白质毒素；

(iii)能够抑制特定癌基因表达的微小RNA(miRNA)、siRNA或shRNA；

(iv)放射性同位素。

这种药物的实例包括但不限于类美坦素、奥里斯他汀、多拉司他汀、单 端孢霉烯(trichothecene)、CC1065(细胞毒性化合物)、卡奇霉素以及其它烯 二炔(enediyne)抗生素、紫杉烷(taxane)、蒽环类(anthracycline)、甲氨蝶呤、 阿霉素(adriamycin)、长春地辛、长春花碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷 (etoposide))、多柔比星、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁 酸氮芥(chlorambucil)、正定霉素(daunorubicin)、道诺霉素(daunomycin)及其立 体异构体、电子等排体(isosteres)、类似物或衍生物，诸如核水解酶(nucleolytic  enzymes)、抗生素之类的其它嵌入剂、酶片段，和诸如细菌、真菌、植物或 动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素之类的毒素，和诸如顺铂(cisplatin)、 CPT-11，多柔比星、紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)之类的各种抗肿 瘤或抗癌剂。

另外，本发明中的药物部分上的亲核基团包括一种或多种选自以下种类 的基团：胺、巯基、羟基、酰肼、肟(oxime)、肼、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、 羧酸肼和芳基酰肼基团，所述基团能够与第二接头部分和第二接头反应剂上 的亲电子基团反应以形成共价键，但所述基团并不限于此。

如上所述，能够通过第二接头部分缀合于抗体的药物分子的数量可以随 着结合于亲本抗体的基序中的半胱氨酸残基数量的增加而增加。

如上所述，根据本发明的修饰抗体能够包括许多半胱氨酸残基，因为含 一个或多个半胱氨酸残基的基序结合于亲本抗体，优选亲本抗体的C末端。 因而，大量药物能够缀合于本发明的修饰抗体，且大量缀合药物能够有效地 递送至靶细胞或靶组织。

并且，因为很容易控制结合于亲本抗体的半胱氨酸残基的数量，所以能 够容易地将修饰抗体-药物缀合物(mADC)中包含的药物的量控制在期望的 水平。这一特征克服了常规修饰抗体-药物缀合物的缺点，并且根据本发明的 新的修饰抗体-药物缀合物能够用作优异的药物递送系统，且能够有效地用于 治疗诸如癌症之类的疾病。

本发明还提供了一种用于制造修饰抗体的方法，所述修饰抗体包括含有 一个或多个结合于亲本抗体的半胱氨酸残基的基序。

亲本抗体能够通过如下方式来制造：构建合适的表达载体，所述合适的 表达载体包含编码亲本抗体的重链或轻链恒定区的核苷酸序列，用所构建的 表达载体转化原核或真核细胞以表达抗体蛋白，分离该抗体蛋白，然后纯化 所分离的抗体蛋白至药物学上可接受的纯度。

本发明中合适的表达载体可包括表达调控元件、例如启动子、起始密码 子、终止密码子、多聚腺苷酸信号和增强子，以及用于膜靶向或分泌的信号 序列。通常存在于原核细胞中的启动子实例包括lac、tac、T3和T7启动子。 存在于真核细胞中的启动子实例包括猿病毒40(SV40)启动子、鼠乳房瘤病毒 (MMTV)启动子、诸如HIV长末端重复(LTR)启动子之类的人免疫缺陷病毒 (HIV)启动子、莫洛尼氏(moloney)病毒启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、 epstein barr病毒(EBV)启动子、rous肉瘤病毒(RSV)启动子以及β-肌动蛋白启 动子，来自人类基因的启动子，例如人、人血红素、人肌肉肌氨酸和人金属 硫蛋白。

表达载体可包括允许选择包含所述载体的宿主细胞的选择性标记物。赋 予选择性表型(例如对药物的抗性、营养需求、对细胞毒素剂的抗性或表面 蛋白的表达)的标记物用作选择性标记物。由于只有表达选择性标记物的细 胞才在用选择试剂处理过的环境中存活，故能够选择出被转化的细胞。并且， 可复制的表达载体可包括具有启动复制的特定核苷酸序列的复制起点。

作为用于表达外源基因的重组表达载体，可以使用各种类型的载体，例 如质粒、病毒或粘粒载体。重组载体的类型没有特别的限制，只要其起到在 诸如原核细胞和真核细胞的各种宿主细胞中表达期望基因并产生期望蛋白质 的功能。然而，优选使用包括表现强活性且能够以高产量产生外源蛋白质的 启动子的载体，所述外源蛋白质保持了同天然存在的蛋白质的相似性。

各种表达宿主/载体组合可用于表达包括含有一个或多个半胱氨酸残基 的基序的亲本抗体或修饰抗体。针对真核宿主的有用的表达载体包括但不限 于：包括来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒 和逆转录病毒的表达控制序列的载体。针对细菌宿主的有用的表达载体包括 细菌质粒，例如来自大肠杆菌(E.coli)的质粒，包括pET、pRSET、pBluescript、 pGEX2T、pUC、col E1、pCR1、pBR322、pMB9以及它们的衍生物，诸如 RP4、噬菌体DNA之类的更广泛的宿主范围质粒，例如λ噬菌体的多种衍生 物，例如λgt10、gt11、NM989，以及其他的DNA噬菌体，如M13和丝状单 链噬菌体。针对酵母细胞的有用的表达载体包括2μm质粒以及其衍生物。针 对昆虫细胞的有用的载体包括pVL 941。

另一方面，本发明提供了用上述重组载体转化的宿主细胞。重组载体插 入宿主细胞以形成转化体。待用所述载体转化的合适的宿主细胞可以是原核 细胞，例如E.coli、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌(Streptomyces sp.)、 假单孢菌(Pseudomonas sp.)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌 (Staphylococcus sp.)。并且，宿主细胞可以是真菌细胞，例如曲霉菌(Aspergillus  sp.)，酵母细胞如甲醇酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces sp.)和粗糙脉胞菌(Neurospora  crassa)，低级真核细胞和诸如昆虫细胞之类的高级真核细胞。并且，宿主细 胞可以来自植物和/或哺乳动物。宿主细胞的优选实例包括但不限于PER.C6 细胞、猴肾细胞7(COS7，特别是simian COS细胞)、NSO细胞、SP2/0、 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、W138、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Madin-Darby犬肾 (MDCK)细胞、骨髓瘤细胞系、HuT78细胞、HEK293细胞，以及其它产生 根据本发明的抗体蛋白的哺乳动物宿主细胞。

特别地，为最大化表达效率，本发明中的宿主细胞优选为选自E.coli细 胞、simian COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以及其它产生根据本发明的 抗体蛋白的哺乳动物宿主细胞。更优选地，本发明中的宿主细胞为仓鼠卵巢 细胞CHO-K1。

本发明中，“转化”到宿主细胞中包括用于将核酸引入有机体、细胞、组 织或器官的任何方法，可以如本领域所知那样利用根据宿主细胞的类型所选 择的标准技术来进行。该方法包括但不限于电穿孔、原生质体融合、磷酸钙 (CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、利用碳化硅纤维震荡(agitation)、农杆菌 介导的转化，以及PEG、硫酸葡聚糖、脂质体(lipofectamine)或干燥/抑制所 介导的转化。

如上所述表达的抗体能够从宿主细胞、培养物的上清液或裂解后的细胞 中回收，并利用常规的蛋白质纯化技术纯化，以获得包括含有一个或多个半 胱氨酸残基的基序的修饰抗体。

所述抗体能够通过常规免疫球蛋白纯化步骤，例如琼脂糖凝胶蛋白A法、 烃基磷灰石层析法、凝胶电泳法、透析法或亲和层析法从培养基中分离。

编码含半胱氨酸的基序的核苷酸序列能够与编码亲本抗体的重链恒定区 或轻链恒定区的核苷酸序列融合。利用在亲本抗体中所采用类似的方法，在 原核或真核宿主细胞中转化和表达之后，以这种方式融合的重组载体能够产 生修饰抗体。

另外，通过表达亲本抗体和含一个或多个半胱氨酸残基的基序中的每个， 然后将亲本抗体的末端官能团化学连接到含半胱氨酸的基序的末端官能团， 或者通过第一接头将亲本抗体连接到基序，能够产生本发明的修饰抗体。可 以将药物结合到所产生的具有含半胱氨酸的基序的修饰抗体，从而产生修饰 抗体-药物缀合物(mADC)。

具体而言，能够通过以下方式产生具有多个含半胱氨酸的基序的修饰抗 体-药物缀合物：

(a)将包括含半胱氨酸的基序的亲本抗体与接头反应剂缀合，以形成共 价键结合的抗体-第二接头中间产物，然后向该中间产物加入经活化的药物部 分；或者

(b)将药物部分的亲核基团与第二接头反应剂缀合，以形成共价键结合 的药物-第二接头中间产物，然后将修饰抗体加入含半胱氨酸的基序。

另一方面，本发明提供了一种包括修饰抗体-药物缀合物作为活性成分的 治疗组合物。

在上述组合物中，缀合于修饰抗体-药物缀合物的药物可以是细胞毒性 剂、细胞增殖抑制剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、消炎剂或类似物，但并不 限于此。在癌症治疗中，用于局部递送杀死或抑制肿瘤细胞药物的抗体-药物 缀合物的使用使得通过抗体-抗原相互作用靶向递送药物部分进入肿瘤细胞， 并且药物部分在细胞内积聚。非缀合的药物制剂可能不仅在肿瘤细胞在，也 在正常细胞中引起不可接受水平的毒性。然而，根据本发明的修饰抗体-药物 缀合物由于所述抗体的高度抗原特异性而能够准确地递送药物，提高了药物 的治疗效果。另外，其能够扩大药物特别是抗癌剂的适用性，所述抗癌剂尽 管具有高度的抗癌功效但由于其毒性而使用受到限制。根据本发明，提供了 最大化药物功效同时最小化药物毒性的抗体-药物缀合物。

本发明还提供了一种通过将修饰抗体-药物缀合物作为活性成分而抑制 来自癌症、自体免疫、炎症或传染性疾病的靶细胞增殖的方法。

能够由本发明治疗的癌症可以选自以下癌症中的一种或多种：肝癌、胃 癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头颈部癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、 食道癌、小肠癌、肛门癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、瓣膜 癌、Hodgkin病、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌 和中枢神经系统的癌症。在特定实例中，通过使修饰抗体-药物缀合物与细胞 体外接触，能够抑制HER2-扩增的乳腺癌BT-474细胞的增殖。因而，利用 修饰抗体-药物缀合物作为活性成分抑制靶细胞增殖的本发明方法明显具有 杀死与上述疾病相关的细胞或减少所述细胞的增殖速率的效果。

下文中，将参考实例来更进详细地描述本发明。对本领域普通技术人员 而言显而易见的是，这些实例并不构成对本发明范围的限制，在本发明的技 术理念和范围之内能够做出各种修改和变化。

除非另有定义，如本文所使用的技术或科学术语具有与本发明所属的技 术领域的普通技术人员所理解的相同含义。并且，本文中将省略与现有技术 相同的构造和效果的详细描述。

1.分析方法

1.1：UV-VIS分光光度法

在本发明中，使用以接头附接到抗癌剂多柔比星(6-马来酰亚氨基己酰基) 腙((6-maleimidocaproyl)hydrazone)的药物(DOX-EMCH)制造抗体-药物缀合 物。当注入人体时，DOX-EMCH与血清蛋白中存在的半胱氨酸的巯基基团 结合，形成血清蛋白-药物缀合物[Willner等人，Bioconjugate Chem.1993 (4):521-7]，并能够容易地应用于描述本发明。

为了检查药物在缀合和纯化步骤之后是否仍然结合于蛋白质，通常采用 UV-VIS吸收光谱法。蛋白质在280nm波长(UV波长范围)处表现出最大 吸光度，而本发明中使用的多柔比星在495nm(可见波长范围)处具有最大 吸光度。蛋白质和多柔比星在特定波长区域都分别具有特征吸光度系数。因 而当测得在280nm和495nm的吸光度时，就确定了蛋白质的每分子药物结 合当量(美国专利第7,528,234B2号)。

1.2：体外细胞增值抑制测试

通过将具有受体蛋白的哺乳动物细胞，如SK-BR-3或BT-474细胞，暴 露于细胞培养基中的修饰抗体-药物缀合物(mADC)，来确定所述修饰抗体- 药物缀合物(mADC)的细胞毒性或细胞增殖抑制活性。培养经mADC处理过 的细胞大约6小时-5天，测量其活力(viability)。

1.3：体外半胱天冬酶3/7活性测定

赫赛汀(Herceptin)不直接诱导癌细胞死亡，但确实通过ADCC(抗体依 赖性细胞的细胞毒性)而诱导Her2-阳性癌细胞死亡。然而，药物治疗直接 诱导细胞凋亡性细胞死亡，从而当测定半胱天冬酶活性时，其能够确定修饰 抗体-药物缀合物(mADC)是否诱导半胱天冬酶介导的细胞凋亡(Bayascas等 人(2002)，Cell Death and Differentiation.9:1078-1089；Preaudat等人(2002)， Journal of Biomolecular Screening.7:267-274；Phillips等人(2008)，Cancer  Research68(22):9280-9290)。

在本发明中，为了检查经由修饰抗体-药物缀合物(mADC)的细胞凋亡机 制，测定了半胱天冬酶3/7的活性。一般而言，通过将具有受体蛋白的哺乳 动物细胞，如SK-BR-3或BT-474细胞，暴露于修饰抗体-药物缀合物(mADC)， 来确定经由修饰抗体-药物缀合物(mADC)的细胞凋亡。将经mADC处理的细 胞在培养基中培养～2天，测定其半胱天冬酶活性。

2.实例

实例1.表达载体pAV4的制备

通过使用pAV4载体来进行本发明中所需的表达载体的克隆，以便用于 工业领域的抗体生产，所述pAV4载体构建自亲本载体pSGHV0(GenBank 登录号No.AF285183)并修饰。尽管人类蛋白质能够在诸如E.coli的细菌细 胞中过表达，但难以获得作为活性物质的人类蛋白质。因而，制造所述亲本 载体以在动物细胞中体外高浓度地表达生理活性的蛋白质，同时具有容易的 纯化步骤。虽然其具有由该亲本载体高蛋白表达水平的最大优点，但在工业 领域其使用具有限制。因而，pAV4载体由其亲本载体修饰而来，以适应于 工业领域。另外，pAV4载体经充分修饰以用于表达抗体的重链区和轻链区 二者的目的。

实例2.用于生产曲妥单抗和半胱氨酸修饰的曲妥单抗的载体的构建

为构建曲妥单抗(HHL002)载体，将曲妥单抗的重链和轻链的cDNA合成 为密码子优化的序列，使得其在CHO细胞中的表达最大化。将基因分别克 隆到pAV4载体的XhoI/NotI和ApaI/SmaI限制性位点，从而制备曲妥单抗载 体(pHHL002)。

2.1：用于经修饰的曲妥单抗抗体HR-Cys和HR-Cys-Gly-Cys的载体的构建

为了构建用于经修饰的曲妥单抗抗体的载体，所述经修饰的曲妥单抗抗 体为一种取代C末端处的末端赖氨酸的单个半胱氨酸突变体 HR-Cys(HHL002)，和另一种C末端肽由Cys-Gly-Cys(CGC)组成的曲妥单抗 突变体HR-Cys-Gly-Cys(HHL002C2)，使用所构建的曲妥单抗载体(pHHL002) 作为模板进行PCR扩增。具体而言，使用曲妥单抗作为模板，正向引物为 XhoHH(5′-GGG GGG CTC GAG ACC ATG GGT TGG AGC TGT-3′)，针对 HHL002C反向引物为HHNot(5′-GCG GCC GGC CGC TCA ACA ACC CGG  AGA CAG-3′)，或者针对HHL002C2反向引物为HHNot(5′-GCG GCC GGC  CGC TCA ACA GCC ACA ACC CGG AGA CAG-3′)，进行PCR扩增。用限制 性酶XhoI和NotI切割经扩增的核苷酸序列并与具有XhoI/NotI切割位点的 表达载体pHHL002连接，从而构建半胱氨酸修饰的曲妥单抗抗体载体 (pHHL002C；pHHL002C2)。图1是所述载体的示意图。该实例中制造的含 半胱氨酸的变体抗体为含半胱氨酸的曲妥单抗抗体，其包含C末端赖氨酸缺 失以及单个半胱氨酸或半胱氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的短肽的加入。

2.2：用于经修饰的曲妥单抗抗体HR-M2(Cys)的载体的构建

为构建编码具有两个金属离子结合基序(CGH)的经修饰的曲妥单抗抗体 HR-M2(Cys)(HR-ACHGAACGHA；HHL002M2)的载体，使用曲妥单抗载体 (pHHL002)作为模板，XhoHH正向引物(5′-GGG GGG CTC GAG ACC ATG  GGT TGG AGC TGT-3′)和M2反向引物(5’CCCCGC GGC CGC CTA GGC  ATG GCC ACA AGC AGC ATG GCC ACA GGC GCC GGG AGA CAG AGA  3’)，进行PCR扩增。用限制性酶XhoI和NotI切割经扩增的核苷酸序列并与 具有XhoI/NotI切割位点的表达载体pHHL002连接，从而构建半胱氨酸修饰 的曲妥单抗抗体载体(pHHL002M2)。

2.3：经修饰的曲妥单抗抗体HR-M(Cys)的生产

为构建编码具有单个金属离子结合基序(CGH)的经修饰的曲妥单抗抗体 HR-M(Cys)(HR-GGGACGHA；HHL002M)的载体，使用EzChange定点突变 试剂盒(Enzynomics，Ez004S)进行PCR扩增。上面生产的经修饰的曲妥单抗 抗体HR-M2(Cys)用作模板，正向引物为(5’-GGT GGA GGT GCT TGT GGC  CAT TAA GC)，反向引物为(3’-GCC GGG AGA CAG AGA CAG TG)。从 HR-M2(Cys)中的两个金属离子结合基序中去除来自C末端的一个金属离子 结合基序，且在剩余基序与亲本抗体之间添加甘氨酸接头(GGG)。经 EzChange PCR扩增之后，用限制酶DpnI切割原始模板HR-M2(Cys)，通过 连接酶将得到的5-M(Cys)连接到双链DNA载体中，从而构建经修饰的曲妥 单抗抗体载体(pHHL002M)。

2.4：用于经修饰的曲妥单抗抗体HR-M2L(Cys)的载体的构建

为了构建编码具有三个氨基酸接头(GGG)嵌插在金属离子结合基序 (CGH)之间的经修饰的曲妥单抗抗体 HR-M2L(Cys)(HR-ACGHAGGGACGHA，HHL002M2L)的载体，接头采用 PCR扩增。以上生产的针对曲妥单抗抗体HR-M2(Cys)的修饰载体用作模板， 正向引物为(5’-GGT GGA GGTGCT TGT GGC CAT GCC TAA GCG)，反向引 物为(3’-AGC ATG GCC ACA GGC GCC)。用限制酶DpnI切割原始模板 HR-M2(Cys)，通过连接酶将得到的编码5-M2L(Cys)的核苷酸连接到双链 DNA载体中，从而构建经修饰的曲妥单抗抗体载体(pHHL002M2L)。

2.5：用于经修饰的曲妥单抗抗体HR-Z(Cys)的载体的构建

为了构建编码具有来自I类锌指蛋白的金属离子结合基序的经修饰的曲 妥单抗抗体HR-Z(Cys)(HR-CDICGRKFARSDERKRHTKIHLRQK，HHL002Z) 载体，使用曲妥单抗载体(pHHL002)作为模板，XhoHH正向引物(5′-GGG  GGG CTC GAG ACC ATG GGT TGG AGC TGT-3′，SEQ ID NO:1)和Z反向 引物(5'-GCA TGC GGC CGC CTT ACT TCT GCC GCA GGT GGA TCT TGG  TAT GCC TTT TTC GCT CGT CGG ATC TAG CAA ATT TGC GTC CAC AAA  TAT CGC ATT TGC CGG GAG ACA GAG A-3')，进行PCR扩增。用限制性酶 XhoI和NotI切割经扩增的核苷酸序列，并与具有XhoI/NotI切割位点的表达 载体pHHL002连接，从而构建半胱氨酸修饰的曲妥单抗抗体载体 (pHHL002Z)。

实例3：曲妥单抗和半胱氨酸修饰的曲妥单抗抗体的表达和纯化

使用中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)，分析曲妥单抗(HHL002)及其半胱氨 酸修饰的抗体(HHL002C、HHL002C2、HHL002M、HHL002M2、HHL002M2L、 HHL002Z)的表达。具体而言，在含10％FBS(胎牛血清)和抗生素的DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Media)中培养CHO-K1细胞。将CHO-K1细胞以 5x10⁶个细胞/ml的浓度接种在100mm培养皿中，然后培养24小时。将800 μl无FBS和抗生素的DMEM与10μg载体混合，在室温下培育1分钟，之 后将所述混合物与20μg的PEI(聚乙二胺，线性，Polysciences Inc(Cat.no: 23966，MW～25,000))混合，并使其在室温下静置大约10-15分钟。同时， 用PBS洗涤细胞，并向其中加入6ml新鲜的DMEM。将在室温下保持了10-15 分钟的所述曲妥单抗或半胱氨酸修饰的曲妥单抗抗体加入培养皿。次日，用 PBS洗涤细胞，并向其中加入无FBS和抗生素的IMDM培养基(Cat.No 12200-028，Gibco，Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)，以确认抗体蛋白 的表达。

上述表达的曲妥单抗和半胱氨酸修饰的曲妥单抗抗体按照以下方式纯 化。具体而言，为了纯化分泌到细胞培养基中的曲妥单抗和半胱氨酸修饰的 曲妥单抗抗体，将培养基离心以去除细胞，将上清液注入用平衡缓冲液平衡 过的HiTrap Protein A HP柱(GE Healthcare，USA)。用平衡缓冲液充分洗涤该 柱，然后用甘氨酸缓冲液(100mM甘氨酸，pH2.8)通过pH改变来洗脱所 述蛋白质。所得到的溶液经磷酸盐缓冲液透析，然后使用Vivaspin20 (Sartorius，USA)浓缩。

实例4：变体抗体和药物缀合物的的生产

4.1：基于曲妥单抗的变体抗体与药物(多柔比星)的缀合物的生产

一般而言，如果蛋白质的半胱氨酸残基不参与分子内二硫键，则所述蛋 白质通常通过分子间二硫键形成二聚体。然而，如图2所示，如通过 SDS-PAGE和Western印记分析所确定，本发明中生产的HR-Cys是以完整的 单体抗体存在。另外，在所述蛋白质中具有游离巯基基团的半胱氨酸残基能 够与细胞内谷胱甘肽或半胱氨酸形成二硫键。由于这种原因，为了破坏二硫 键，在与药物-第二接头结合后，需要用诸如DTT(二硫苏糖醇)或TCEP(三 (2-羧乙基)膦)之类的还原剂处理的步骤，但即使在室温下震荡也能够实现充 分的结合反应。

本实验中使用的经第二接头缀合的药物是被称为DOXO-EMCH的多柔 比星的(6-马来酰亚氨基己酰基)腙衍生物。将诸如DOXO-EMCH之类的具有 马来酰亚胺基团的化合物附接到蛋白质的巯基基团的方法在文献[Klussman 等人(2004)，Bioconjugate Chemistry15(4):765-773，第766页；Emmanuel 等人(2010)Chemistry&Biology2010(17):213-227]中有详细描述。

将本发明中纯化的HR-Cys与DOXO-EMCH以1:10的摩尔比混合并在 室温下震荡4小时。然后，使用脱盐柱去除剩余的DOXO-EMCH，通过超滤 洗涤剩余物质三次，从而制成HR-Cys-多柔比星缀合物(HR-Cys-DOX)。通过 UV-VIS分光光度法确认所制成的缀合物，如图3所示。从基于所述蛋白质 和药物的特征吸光度系数的计算，可以看出每个HR-Cys分子结合大约两分 子的DOXO-EMCH。

4.2：曲妥单抗基修饰的抗体和药物(MMAE)缀合物的制造

本发明中，将已知细胞毒性比多柔比星高得多的MMAE缀合于 HR-Cys-GLy-Cys，以制造赫赛汀-MMAE缀合物(HR-Cys2-MMAE)。单甲基 奥里斯他汀E(见下面化学式2)，即奥里斯他汀的可缀合衍生物，通过能够 被细胞中的蛋白酶降解的缬氨酸-citurulline和自降解的间隔臂对苯胺苯甲酸 (PABA)连接到巯基特异性的马来酰亚胺基团。这被称为MC(马来酰亚胺基己 酸)-VC(缬氨酸-citurulline)-PAB-MMAE，其合成方法是已经公知的(美国专 利第6214345号；美国专利第7745394号)。奥里斯他汀，一种高细胞毒性化 合物，已知在细胞增殖抑制测试中具有200-300pM的IC50值。

化学式2：MC-vc-PAB-甲基奥里斯他汀E

本发明中，将2-10当量的还原剂TCEP加入到经修饰的曲妥单抗抗体中， 并在4℃下反应30分钟以还原巯基基团，之后，向其中加入2-10当量的 MC-vc-PAB-MMAE并在室温下反应大约2-4小时。通过加入过量的半胱氨 酸终止反应，通过离心-过滤和在磷酸盐缓冲液中透析去除未反应的 MC-vc-PAB-MMAE和TCEP，从而获得纯化的曲妥单抗变体 -MC-vc-PAB-MMAE。

为了确认所制成的曲妥单抗变体-MC-vc-PAB-MMAE的选择性结合特异 性，对所制成的HR-M2(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE进行肽图谱绘制 (ProteinWorks Co.，Ltd.，Daejeon，Korea)。肽图谱的结果表明， MC-vc-PAB-MMAE被引入到在重链C末端作为药物结合位点的肽半胱氨酸 残基。没有观察到由重链或轻链的链内或链间二硫键导致的药物与半胱氨酸 的结合。这表明本发明中设计的抗体变体被有效地合成，其能够显著地提高 抗体-药物缀合物的均匀性，同时具有对重链C末端的药物结合特异性。

4.3：使用含马来酰亚胺的荧光染料Alexa488对经修饰的曲妥单抗抗体的选择性缀合性质的分析

为了检查药物是否选择性地缀合于被引入到曲妥单抗重链C末端的半胱 氨酸残基，将用巯基特异性马来酰亚胺基团取代的荧光染料Alexa488 与每个经修饰的曲妥单抗抗体反应。当蛋白质的半胱氨酸残基不形成分子内 二硫键时，所述蛋白质通常通过分子间二硫键形成二聚体。然而，如图2所 示，如通过SDS-PAGE和Western印记分析所确定，本发明中制造的HR-Cys 作为完整的单体抗体存在。另外，具有游离巯基的半胱氨酸残基能够与细胞 内谷胱甘肽或半胱氨酸形成二硫键。由于这种原因，为了破坏二硫键，在与 药物-第二接头结合后，需要用诸如DTT(二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙 基)膦)之类的还原剂处理的步骤，但即使在室温下震荡也能够实现充分的结 合反应。2-4当量的还原剂不仅能够还原被引入到重链C末端的半胱氨酸残 基，也能够还原重链和轻链每条的链内二硫键和将重链与轻链相连接的链间 二硫键。因而，荧光染料能够结合于任何通过还原剂还原的半胱氨酸残基。 结合于链间或链内二硫键的药物能够降低抗体-药物缀合物的均匀性，且具有 相对较大尺寸的结合药物非常容易降低抗体蛋白本身的结构稳定性和抗原特 异性，并且由于这种原因，其在生物药品制造中的功效能够被显著降低。

将2-4当量的TCEP加入经修饰的曲妥单抗抗体，在4℃下反应大约30 分钟以还原巯基。在该过程中，在表达过程期间利用二硫键作为二聚体存在 的抗体变体或者以氧化剂结合形式存在的半胱氨酸的巯基官能团被恢复成能 够结合马来酰亚胺基团的还原形式。在还原反应之后，应当通过诸如离心- 过滤之类的方式去除与马来酰亚胺基团反应的还原剂如DTT，但是不涉及马 来酰亚胺基团与巯基基团之间的缀合反应的TCEP并不必须去除。将2-10当 量的Alexa488加入经修饰的曲妥单抗抗体，在室温下搅拌反应大约 2-4小时。通过加入过量的半胱氨酸终止反应，通过离心-过滤去除未反应的 染料和还原剂。磷酸盐缓冲液透析所得到的物质，从而获得经修饰的曲妥单 抗抗体-Alexa488染料缀合物。

通过SDS-PAGE凝胶电泳分离上述经修饰的曲妥单抗抗体-Alexa488染 料缀合物，然后通过荧光图像分析仪(Fluorescencen Image Ananlyzer， Typoon9410，Amersharm Bioscience Ltd.)分析结合于重链和轻链每条上的染 料的量。荧光图像分析结果表明，在HR-Cys和HR-Cys-Gly-Cys抗体变体的 情况下，结合于重链的染料的量大于结合于轻链的染料的量。同样，在 HR-M(Cys)、HR-M2(Cys)、HR-M2L(Cys)和HR-Z(Cys)的情况下，结合于重 链的染料的量大于结合于轻链的染料的量。如图4中可见，在HR-M2(Cys) 抗体变体的情况下，结合于重链的荧光染料的强度是结合于轻链的染料强度 的大约6倍高。该荧光强度方面的差异表明，结合于重链的染料的量比结合 于轻链的染料的量高得多，意味着马来酰亚胺基团对重链的选择性显著更高。

实例5：金属离子结合基序的金属离子结合亲和性的测定

如上面所提到，金属离子结合于具有金属离子结合基序CGH的肽，并 抑制或减速半胱氨酸残基的氧化，从而防止由半胱氨酸过度氧化引起的磺化 反应。半胱氨酸残基的氧化能够通过两条反应途径发生。一条反应途径中， 二硫键能够通过巯基-巯基键合形成，另一条反应途径中，半胱氨酸也能够通 过与空气中的过量氧气反应而被氧化，从而生成作为中间产物的次磺酸 (R-S-OH)。在这种情况下，二硫化物的形成是不可逆反应，其中二硫键能够 还原成巯基，但通过与氧气反应导致次磺酸的形成是不可逆的过程。当二硫 化物和次磺酸长期暴露于氧气时，它们都通过不可逆反应被氧化成磺酸 (R-SO₃H)。由于这种次磺酸或磺酸对马来酰亚胺不具有反应性，到次磺酸或 磺酸的氧化降低了抗体变体与马来酰亚胺的反应性，因而能够大大影响缀合 产量和抗体-药物缀合物的均匀性。

如上所述，已经报道了含有合成的基序CGH的肽与金属离子结合并抑 制半胱氨酸的磺化，所述基序衍生于频繁发现于体内的金属离子结合基序 GGH，(Van Horn等人(2003)J.Biol.Inorg.Chem.8:601-610)。在表达过程期 间分泌到细胞外基质之后，具有金属离子结合肽基序的抗体蛋白能够与细胞 培养基中中痕量的金属离子结合，并有效地抑制半胱氨酸的磺化。为了测定 具有这种金属离子结合肽基序的抗体变体的金属离子结合能力，利用 Fura-2(Invitrogen，F-1200)，即一种公知的金属离子螯合剂，来测定结合亲和 性。通过该测定，HR-M2(Cys)具有大约20nM的电离常数(K_d)，意味着其与 金属离子形成了非常牢固的键。另外，为了检查具有金属离子结合基序的抗 体变体是否结合于金属离子且保护半胱氨酸残基，测定了烷基化速率。观察 到抗体变体与锌金属离子形成了非常牢固的键，因而与没有金属离子相比， 将半胱氨酸的烷基化抑制了多达24小时。镍离子不像锌离子那样牢固地与 CGH基序结合，意味着抑制半胱氨酸烷基化的效果低于锌离子的效果。然而， 当与无金属离子的缓冲液相比较时，镍离子降低了半胱氨酸的烷基化速率。 当加入强金属离子螯合剂EDTA以从HR-M2(Cys)中去除锌离子时，观察到 半胱氨酸的烷基化迅速发生，如同在没有外源添加金属离子的情形一样。

实例6：针对细胞增殖抑制的体外测试

6.1：变体抗体和多柔比星缀合物的细胞增殖抑制测试

用含10％FBS的DMEM/F12培养基稀释BT-474细胞，并将100μl经稀 释的细胞悬液以1x10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔板的每个孔中。接种之 后，将孔板在5％CO₂的孵育箱中于37℃培育24小时。在培养基中稀释赫赛 汀、赫赛汀与多柔比星的1:2混合物、上面实例中制备的HR-Cys-DOX和多 柔比星中的每一种，然后将100μl每种稀释液以1000nM、100nM、10nM、 1nM和0.1nM的各种浓度加入所述板的各个孔中。并且，将培养基(不具 有药物)加入另一些孔中用于阴性对照。培育大约5天之后，向每个孔中加 入20μl单溶液96孔细胞增殖检测试剂(CellTiter96-AQueous One Solution  reagent)[基于MTS的测试，通过由MTS形成的紫色甲瓒(formazan)的量来测 定细胞增殖，所述由MTS形成的紫色甲瓒是由于活细胞脱氢酶所导致]，接 着在孵育箱中于37℃培育2小时。向每个孔中加入20μl的10％SDS溶液以 停止反应，接着充分混合以诱导细胞裂解。通过分光光度计测定每个孔的吸 光度，图5图示出了基于吸光度的活力(％)。结果表明，低浓度使用的 HR-Cys-DOX的细胞生长抑制效果与赫赛汀以及赫赛汀与多柔比星的1:2混 合物的细胞生长抑制效果类似，且高浓度下的HR-Cys-DOX表现出与多柔比 星类似的细胞毒性。这些结果表明，即使多柔比星通过第二接头结合于赫赛 汀，HR-Cys-DOX也保留了赫赛汀和性质功能并充分地表现出多柔比星的特 征性细胞毒性。

6.2：变体抗体和MMAE缀合物的细胞增殖抑制测试

将SK-BR3细胞在含10％FBS的DMEM/F12培养基中稀释，并将100μl 的细胞稀释悬液以1x10⁴个细胞/孔的密度加入96孔板的每个孔中。然后， 将孔板在5％CO₂的孵育箱中于37℃培育24小时。在培养基中稀释赫赛汀 和上面实例中制备的赫赛汀变体抗体-MC-vc-PAB-MMAE缀合物中的每一 种，然后以66.7nM、33.3nM、6.7nM、3.3nM、0.67nM、0.33nM、0.067nM 和0.0067nM的各种浓度加入所述板的各个孔中。另外，将培养基(不具有 药物)加入对照孔中用于阴性对照。培育5天之后，向每个孔中加入20μl 单溶液96孔细胞增殖检测试剂[基于MTS的测试，通过由MTS形成的紫色 甲瓒的量来测定细胞增殖，所述由MTS形成的紫色甲瓒是由于活细胞脱氢 酶所导致]，接着在孵育箱中于37℃培育2小时。通过分光光度计测定490nm 下每个孔的吸光度以确定细胞活力(％)。结果，与亲本抗体赫赛汀相比较， HR-Cys-MC-vc-PAB-MMAE、HR-Cys-Gly-Cys-MC-vc-PAB-MMAE、 HR-M2(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE、HR-M(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE、 HR-M2L(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE和HR-Z(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE均表现 出优异的细胞增殖抑制能力。如图6所示，HR-M2(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE 的IC50值比亲本抗体赫赛汀低至少五倍(取最高值与最低值之间的中间值作 为赫赛汀的IC50，因为在赫赛汀的情况下活力不会降低到50％或更低)。并 且，对于所述抗体-药物缀合物而言，在高浓度下细胞活力减少了大约85％， 但对于亲本抗体赫赛汀而言仅降低了大约40％。这些结果表明，与亲本抗体 相比较，所述抗体药物缀合物具有非常高的细胞毒性和非常低的IC50值。

实例7：半胱天冬酶3/7活化体外测试

用含10％FBS的RPMI1640培养基稀释SK-BR3细胞，并将100μl的 细胞稀释悬液以1x10⁴个细胞/孔的密度加入到96孔板的每个孔中。然后， 将96孔板在5％CO₂的孵育箱中于37℃培育24小时。在培养基中稀释上 面实例中制备的赫赛汀和修饰抗体-药物缀合物中的每一种，然后以66.7nM、 33.3nM、6.7nM、3.3nM、0.67nM、0.33nM、0.067nM和0.0067nM的各 种浓度加入所述板的各个孔中。同样，将培养基(不具有药物)加入对照孔 中用于阴性对照。培育48小时之后，向每个孔中加入100μl的Caspase-Glo 3/7反应剂[Caspase-Glo3/7测试；测定通过细胞中形成的半胱天冬酶3/7活 性对半胱天冬酶底物的降解得到的发光，其中细胞凋亡通过所述半胱天冬酶 途径诱导]，接着在室温下培育30分钟。通过照度计测定发光。

如图7所示，在用亲本抗体赫赛汀处理过的细胞中，没有观察到或者观 察到很少半胱天冬酶活性，但在用HR-Cys2-MMAE处理过的细胞中，3/8活 性随着HR-Cys2-MMAE浓度的增加而增加。这些结果意味着，不像赫赛汀， 从递送到细胞中的HR-Cys2-MMAE释放的MMAE药物通过半胱天冬酶途 径诱导了细胞凋亡。

另外，如图8所示，在用赫赛汀处理过的细胞中，很少或者没有半胱天 冬酶活性出现，但在用HR-M2(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE处理过的细胞中， 半胱天冬酶活性随着HR-M2(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE浓度的增加而增加。 这些结果意味着，不像赫赛汀，从递送到细胞中的 HR-M2(Cys)-MC-vc-PAB-MMAE释放的MMAE药物通过半胱天冬酶途径诱 导了细胞凋亡。

工业实用性

如上面所述，由于其对抗原的高度特异性，本发明的修饰抗体和包括它 的修饰抗体-药物缀合物能够准确地将药物递送到靶细胞，因而能够提高药物 的治疗效果。另外，其能够提高药物特别是抗癌剂的可用性，所述抗癌药物 尽管具有高功效，但由于其毒性而使用受到限制。