一种用于甘蔗叶部真菌病害菌株致病性鉴定的感染方法

摘要

本发明涉及甘蔗病害检验技术领域，提出一种用于甘蔗叶部真菌病害菌株致病性评价的感染方法，包括步骤有：菌株的准备、叶片的采集及预处理、感染叶片的准备、感染、培养、菌株的致病性评价，其特征在于：感染叶片的准备步骤是：把叶片剪成4～8cm的长段，用纸巾包住叶片的两端，放入灭过菌的培养皿内，并往叶片两端的纸巾滴加灭过菌的清水；感染步骤是：用扎孔器对培养皿中的叶片沿叶中脉两侧扎孔，用灭过菌的镊子夹菌丝块放到叶片扎有孔的位置上作为试验培养皿；本发明具有以下突出的实质性特点和显著进步：（1）感染需要的甘蔗叶片和菌丝块少；（2）感染后蔗叶可以控温及双重控湿，保证了病原菌发病对高温高湿的要求；（3）感染后有致病性的菌株发病显著、灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明涉及甘蔗病害检验技术领域，具体是一种适用于甘蔗叶部真菌病害菌株致病性评价的感染方法。 

背景技术

近年来，随着蔗糖业的发展，甘蔗种植呈现出品种单一化以及大面积连年种植的状况越来越明显，伴随而来的病害问题也日益突出，尤其是甘蔗叶部病害。据不完全统计，发生在甘蔗叶片上的病害（统称为叶部病害）接近30多种，其中绝大部分是真菌性病害。由于病原菌的逐年积累，甘蔗叶部病害的发生在这几年显得尤为突出，发病植株的光合作用受到影响，使得蔗株生长受阻，节间变短，严重时造成大幅减产。而且，根据我们近年的田间调查发现，甘蔗叶部病害的发生往往是多种病原菌的复合侵染，这就导致病状难以识别，给病原菌的分离鉴定也增加了难度，从而不利于对症下药。 

传统的病原菌分离鉴定，需要把分离到的菌株感染到原来的寄主植物上，使其发病，然后才能确定病原。由于甘蔗属于体型较高大的作物，在田间人工感染时很难控制其温度和湿度，在感染菌株较多时更是需要耗费较大的人力和物力。而适宜的温度和湿度是病害发病的必需条件，如果不能控制温湿度，就无法保证感染结果的真实性、稳定性和准确性。因而急需研究建立一种鉴定结果稳定、可控温控湿、快速简便的感染方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一种使感染鉴定结果稳定、可控制温湿度、操作性强、感染效率高、适合对批量菌株同时感染的方法。 

本发明的目的通过以下技术方案来实现： 

一种用于甘蔗叶部真菌病害菌株致病性鉴定的感染方法，包括以下步骤。

1）、菌株的准备：用常规方法从甘蔗叶部病斑分离菌株，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上对菌株进行第一次纯化，获得直径约2～4厘米的菌落。 

2）、叶片的采集及预处理：采集蔗株的+2、+3或+4张叶，叶宽度要求至少2cm，把采集的干净叶片插到水中，使叶片不萎蔫。 

3）、感染叶片的准备：从步骤2）的水中取出叶片并去掉基部和尾部，把叶片剪成4～8 cm的长段，用纸巾包住叶片的两端，放入灭过菌的培养皿内，往叶片两端的纸巾滴灭过菌的清水，直至纸巾湿透为止。 

4）、感染：用经过灭菌的扎孔器，对步骤3）的培养皿中的叶片沿叶中脉两侧的大致中间位置扎孔，孔距1.5～2 cm，将其中1个培养皿盖上培养皿盖子成为对比培养皿，对其它培养皿，用灭过菌的镊子夹一块步骤1）准备的菌丝块，放到叶片扎有孔的位置上，盖上培养皿的盖子成为试验培养皿。 

5）、培养：把若干个步骤4）的装有叶片的对比培养皿和试验培养皿放到一陶瓷盘或塑料箱里，并在上面覆盖湿毛巾后再放到温度为27～29℃的培养箱里培养；48小时后，去掉湿毛巾、陶瓷盘或塑料盘和试验培养皿中的菌丝块，再放到培养箱里继续培养，培养期间每2～3天往叶片两端的纸巾滴加灭过菌的清水，使纸巾保湿。 

6）、菌株的致病性评价：步骤5）的继续培养5～7天后，检查发病情况，如对比培养皿中叶片无病斑，再根据试验培养皿中叶片病斑的有无，判断菌株有无致病性。 

本发明具有以下突出的实质性特点和显著进步： 

（1）只需要少量的甘蔗叶片和菌丝块，即可满足感染鉴定需要，工作量少；

（2）感染后蔗叶置于培养皿内并覆盖湿毛巾放在恒温培养箱内培养，可以控温及双重控湿，保证了病原菌发病对高温高湿的要求；

（3）感染后具有致病性的菌株发病显著、灵敏度高，可以有效区分有致病性和没有致病性的菌株；

（4）经过本发明的感染筛选，快速筛掉了一些没有致病性的菌株，同时对有致病性菌株的发病情况也有了初步的了解，大大减轻了下一步的田间工作量，也增添了田间感染的成功机率。

附图说明

图1是利用本发明的方法试验得到的甘蔗叶部有致病性菌株的照片。 

图2是利用本发明的方法试验得到的甘蔗叶部无致病性菌株的照片。 

具体实施方式

 下面用具体实施例对本发明作进一步说明： 

一种用于甘蔗叶部真菌病害菌株致病性鉴定的感染方法，包括以下步骤。

1）、菌株的准备：用常规方法分离甘蔗叶部病斑菌株，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上对菌株进行第一次纯化，获得直径约2～4厘米的菌落，用灭过菌的刀片把菌落切成约3毫米的菌丝块，用于下一步的感染（上述全部操作均在无菌超净台内完成）。 

2）、叶片的采集和预处理：从田间采集健康蔗株的第二或第三张叶，叶片要求无病斑，无病虫，宽度超过2cm，采回室内的叶片立刻用清水冲洗干净，擦干，喷70%酒精进行消毒后，后把叶片插到水中，使叶片不萎蔫。 

3）、感染叶片的准备：从步骤2的水中取出叶片并去掉基部和尾部，把叶片剪成6 cm的长段，用4～6层纸巾包住叶片的两端至少1 cm，放到灭过菌的直径为9 cm的培养皿内，往叶片两端的纸巾滴灭过菌的清水，直至纸巾湿透为止，以利于叶片保湿。 

4）、感染：用自制的且经过灭菌的多针式扎孔器，沿着叶中脉两侧（与中脉相隔1～2毫米）每隔约2厘米轻扎一下（以扎处隐约可见小孔即可），将其中1个培养皿盖上培养皿盖子成为对比培养皿，对其它培养皿，再用灭过菌的镊子夹一块步骤1）准备的菌丝块，放到扎有孔的位置上，盖上培养皿的盖子成为试验培养皿。 

5）、培养：把多个步骤4）装有叶片的对比培养皿和试验培养皿放到一陶瓷盘里，并在上面覆盖湿毛巾，再把陶瓷盘放到温度为28℃左右的培养箱里培养；48小时后，去掉湿毛巾、陶瓷盘和试验培养皿中的菌丝块，把装有叶片的对比培养皿和试验培养皿放在培养箱里继续培养，培养期间每2天往叶片两端的纸巾滴加灭过菌的清水，使纸巾保湿。 

6）、致病性菌株的评价：步骤5）的继续培养5天后，检查发病情况。对比培养皿中叶片无病斑（如图2），根据试验培养皿中叶片病斑的有无，可判断菌株有无致病性，有致病性的菌株会产生病斑（如图1），没有致病性的菌株则不会产生病斑。