一种燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法及其应用

摘要

本发明属于植物生物技术领域，具体公开了一种燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，利用一个SSR(Simple Sequence Repeats，简单重复序列)分子标记在不同倍性燕麦属植物中大小与拷贝数不同的特性，结合PCR扩增技术和凝胶电泳技术，通过扩增产物片段数目的不同，快速鉴定出燕麦属植物的染色体倍性。本发明的优点为能够在事先不清楚燕麦属植物倍性的条件下，快速地鉴定出该植物的倍性，燕麦属植物皆可适用于本方法。

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种燕麦属植物染色体 倍性快速鉴定的方法及其应用。

背景技术

燕麦广泛分布于世界各地，是重要的粮食和饲草饲料作物。燕麦 营养丰富，与小麦、水稻、玉米等作物相比，燕麦籽粒中的蛋白质、 不饱和脂肪酸、维生素、矿物质元素等营养指标均位居前列，此外， 燕麦中还含有丰富的可溶性膳食纤维。国内外大量研究证明燕麦能够 降血脂和胆固醇且无副作用，具有调节人体免疫功能，增强抵抗力和 抑制糖尿病等作用[Ripsin CM,Keenan JM,Jacobs DR,Elmer PJ, Welch RR,Van Horn L,Liu K,Turnbull WH,Thye FW,Kestin M, Hegsted M,Davidson DM,Davidson MH,Dugan LD, Demark-Wahnefried W,Beling S.Oat products and lipid lowering.J Am  Med Assoc.1992,267(24):3317-3325]，是谷物中最好的全价营养食品 之一。

在植物学分类上，燕麦属于禾本科燕麦属草本植物，前人通过对 燕麦不同种进行远缘杂交并对亲本及杂种染色体进行观察分析，将燕 麦属植物分为二倍体、四倍体和六倍体3个种群，约30个种[郑殿升. 中国燕麦的多样性.植物遗传资源学报.2010,11(3):249-252]。栽培种 普通燕麦(Avena sativa)为六倍体，而野燕麦多为二倍体和四倍体， 分布广泛，并且有些野生种和栽培种十分相似，单从形态上难以区分， 对栽培燕麦的种子生产和品种纯度有着不良影响。

另一方面，单倍体及其加倍后的多倍体在植物细胞学、作物遗传 及育种研究上具有重要作用，可加速育种进程，提高选育效益，因而 倍性育种是现代育种的一个重要组成部分。倍性鉴定是倍性育种及其 应用的重要环节，如何应用最简便、有效且尽可能早期鉴定出植株的 倍性水平，可以大大减少育种的工作量及盲目性，降低成本，加速育 种进程，在农作物倍性育种中具有重要意义[陶抵辉，李小红，王利 群，周杰良，陈涌，霍稳根.植物染色体倍性鉴定方法研究进展.生 命科学研究.2009,13(5):453-458]。

目前对生物染色体倍性鉴定的方法主要有两大类型：直接鉴定法 和间接鉴定法[李懋学，张杶方.植物染色体研究技术.东北林业大学 出版社.1991]。

直接法是利用一定时期一定部位的组织细胞对进行染色体染色、 计数，是最直接、最准确的倍性鉴定方法。其流程包括：培养材料→ 取材预处理→细胞固定→细胞解离→染色剂染色，最后通过显微镜下 观察对染色体进行计数。虽然染色体计数为最直接、最准确的倍性鉴 定方法，但其制片要达到理想的计数结果技术要求高，对某些植物有 一定难度。制片过程中的各种处理方式方法、步骤影响因素多，要达 到理想真实结果需进行大量深入的研究和总结。

间接法包括形态指标鉴定法，流式细胞分析法，杂交鉴定法，分 子鉴定法等。形态指标法利用不同倍性的种间形态差异来区分倍性， 这种方法受环境影响大且依赖鉴定人员的实践经验。流式细胞分析法 利用流式细胞仪检测细胞DNA含量判定倍性，快速准确方便，不受 外界环境影响，但需要有较昂贵的专门设备，并且维护人员需较高的 专业水平以及仪器操作复杂。杂交鉴定法通过与已知倍性的种杂交， 通过后代存活率及育性判定物种倍性，更加费时费力。分子鉴定法指 利用RFLP[Saiki RK,Scharf S,Faloona F,Mullis KB,Erlich HA, Arnheim N.Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences  and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science. 1985,230(4732):1350-1354]、AFLP[Vos P,Hogers R,Bleeker M, Reijans M,van de Lee T,Hornes M,Frijters A,Pot J,Peleman J,Kuiper  M.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Res. 1995,23(21):4407-4414]、RAPD[Williams JG,Kubelik AR,Livak KJ, Rafalski JA,Tingey SV.DNA polymorphisms amplified by arbitrary  primers are useful as genetic markers.Nucleic Acids Res.1990, 18(22):6531-6535]、SSR[Jarne,P and Lagoda,PJ.Microsatellites,from  molecules to populations and back.Trends Ecol Evol.1996,11(10): 424-429]等分子标记技术对物种进行倍性鉴定的方法。前人利用 AFLP标记对不同倍性西瓜分子遗传变异进行了比较，鉴定出了2倍 体、3倍体和4倍体西瓜的特异标记[刘文革,王鸣,阎志红.西瓜二 倍体及同源多倍体遗传差异的AFLP分析.果树学报.2004, 21(1):46-49]；而利用RAPD标记对金鱼草的研究也表明不同倍性金 鱼草基因组DNA存在有分子差异[吴福川，胡秀，郑思乡.不同倍性 金鱼草基因组DNA随机扩增多态性研究.云南农业大学学报.2005, 20(4):482-485]。这些研究表明不同倍性的种间基因组DNA存在分子 差异，可以通过现代分子生物学技术将其区分开来。

综上所述，作为倍性鉴定的直接方法，染色体制片法虽然直观可 信，但操作过程比较繁琐，工作量大，费时费力且需要较高的细胞学 操作技术，难以大规模量化，所以人们一直在探索简便、快速、准确 鉴定染色体倍性的方法。现代生物技术的发展能根据不同倍性种间基 因组DNA的不同，利用分子标记鉴别出这些差异，从而达到倍性鉴 定的目的，但在燕麦中尚无此类研究的报道，因而发展一种能够快速 鉴定燕麦属植物倍性的方法对于燕麦种质资源的鉴定利用、分子育 种、品种纯度检测以及燕麦属植物的起源进化研究具有十分重要的意 义。

发明内容

本发明依据不同倍性燕麦属植物以特异引物对进行PCR扩增后 电泳得到的扩增产物大小与拷贝数不同的特性，提供一种燕麦属植物 染色体倍性快速鉴定的方法及其应用。

本发明的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，其为利用SSR 分子标记的特异引物对，对燕麦属植物的DNA样品进行PCR扩增和 电泳，通过电泳条带显示的扩增产物片段数目的不同，鉴定出燕麦属 植物样品的染色体倍性；

所述特异引物对的核苷酸序列为：

上游引物：5'-AGCGTCTGCTTCAAAATCTGTT-3'(如SEQ ID  NO.1所示)

下游引物：5'-TTTCTTCCTGCCGCGTTAAGTT-3'(如SEQ ID NO. 2所示)。

所述PCR扩增，其反应体系如下：

反应体系总体积为50μl。

所述PCR扩增，其反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性 20sec，55℃复性30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。

所述电泳为凝胶电泳，优选为聚丙烯酰胺凝胶电泳。

所述DNA样品为基因组DNA样品。

所述鉴定出燕麦属植物样品的染色体倍性，其标准为：按照电泳 条带显示的扩增产物片段的数量鉴定，数量为一条的是二倍体，数量 为两条的是四倍体，数量为三条的是六倍体。

本发明还提供用于所述燕麦属植物染色体倍性快速鉴定方法的 特异引物对，其核苷酸序列为：

上游引物：5'-AGCGTCTGCTTCAAAATCTGTT-3'(如SEQ ID  NO.1所示)

下游引物：5'-TTTCTTCCTGCCGCGTTAAGTT-3'(如SEQ ID NO. 2所示)。

本发明还提供所述燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法在燕 麦属植物中的应用。

本发明的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，利用一个SSR (Simple Sequence Repeats，简单重复序列)分子标记在不同倍性燕 麦属植物中大小与拷贝数不同的特性，结合PCR扩增技术和凝胶电 泳技术，通过扩增产物片段大小及数目的不同，快速鉴定出燕麦属植 物的染色体倍性。本发明的优点为能够在事先不清楚燕麦属植物倍性 的条件下，快速地鉴定出该植物的倍性，燕麦属植物皆可适用于本方 法。

附图说明

图1为本发明实施例3对不同倍性燕麦属植物DNA扩增产物的电泳 结果照片。

图2为本发明实施例4燕麦二倍体植物的细胞染色体照片及核型图。

图3为本发明实施例4燕麦四倍体植物的细胞染色体照片及核型图。

图4为本发明实施例4燕麦六倍体植物的细胞染色体照片及核型图。

其中，图1中PCR产物电泳条带序号代表的依次为M:20bp  ladder Takara；1-3:A.strigosa；4-6:A.hispanica；7-9:A.brevis；10-12: A.nudabrevis；13-15:A.maroccana；16-18:A.murphy；19-21:A.magna； 22-24:A.sativa；25-27:A.fatua；28-30:A.sterilis；31-33:A.chinensis。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述 实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中， 燕麦属植物材料均取自国家作物种质库，所用的液氮购自北京绿氧天 罡科技开发有限公司、CTAB缓冲液购自北京鼎国昌盛生物技术有限 责任公司、氯仿购自北京化学试剂公司(分析纯)、异戊醇购自北京 化学试剂公司(分析纯)、异丙醇购自北京化学试剂公司(分析纯)、 乙醇购自北京化学试剂公司(分析纯)、无菌水购自大连宝生物工程 有限公司、TE缓冲液购自大连宝生物工程有限公司、PCR Buffer购 自大连宝生物工程有限公司、dNTP购自大连宝生物工程有限公司、 Tag酶购自大连宝生物工程有限公司、ddH₂O购自大连宝生物工程有 限公司、特异引物对由上海invitrogen生物技术有限公司合成、TBE 缓冲液购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司、Acr-Bis购自北京 鼎国昌盛生物技术有限责任公司、四甲基二乙胺(TEMED)购自北 京鼎国昌盛生物技术有限责任公司、过硫酸铵(APS)购自北京鼎国 昌盛生物技术有限责任公司、琼脂糖购自北京鼎国昌盛生物技术有限 责任公司(分析纯)、冰醋酸购自北京化学试剂公司(分析纯)、AgNO₃购自北京化学试剂公司(分析纯)、NaOH购自北京化学试剂公司(分 析纯)、甲醛购自北京化学试剂公司(分析纯)。

实施例1燕麦属植物基因组DNA的提取

本实施例以燕麦属植物A.strigosa(砂燕麦)、A.hispanica(西班 牙燕麦)、A.brevis(短燕麦)、A.nudabrevis(小粒裸燕麦)、A.maroccana (马罗卡燕麦)、A.murphy(墨菲燕麦)、A.magna(大燕麦)、A.sativa (普通栽培燕麦)、A.fatua(普通野燕麦)、A.sterilis(野红燕麦) 和A.chinensis(莜麦)作为实验对象。

以上述燕麦属植物的幼嫩叶片分别作为材料，利用CTAB法提取 燕麦DNA，具体方法如下：取材料0.1g，加液氮后迅速研磨。将研 磨好的材料转入1.5ml离心管中，立即加入600μl预热的2×CTAB 缓冲液，颠倒混匀，65℃下保温10-20min，其中不时摇动。加入等 体积的氯仿/异戊醇(体积比1/1，下同)，轻缓颠倒混匀，室温下12,000 r/min离心10-20min。取上清转至另一离心管中，加入等体积氯仿/ 异戊醇，轻缓颠倒混匀，室温下12,000r/min离心10-20min。取上清， 加入等体积异丙醇，-20℃下放置30min。3,500-4,000r/min离心5-10 min，去上清，体积百分含量70％的乙醇溶液洗沉淀，干燥后，加入 30μl TE缓冲液溶解沉淀(可以无菌水替代)。

实施例2对燕麦属植物基因组DNA的PCR扩增

对实施例1中提取的各种燕麦基因组DNA进行PCR扩增，方法 如下：

取一支干净无菌的0.2ml离心管，向其中加入以下试剂：ddH₂O， 36μl；10×PCR Buffer，5μl；dNTP(10mM each)，1μl；特异引物对 的上游引物(SP1)/下游引物(SP2)，2μl；燕麦基因组DNA，0.1-1μg； Taq酶，1μl。

特异引物对的核苷酸序列为：

上游引物(SP1)：5'-AGCGTCTGCTTCAAAATCTGTT-3'(如SEQ  ID NO.1所示)

下游引物(SP2)：5'-TTTCTTCCTGCCGCGTTAAGTT-3'(如SEQ  ID NO.2所示)。

按如下反应条件进行扩增：94℃5min；94℃20sec,55℃30sec, 72℃1min,35cycles；72℃7min。

实施例3扩增结果的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

对实施例2得到的扩增产物进行电泳检测，具体方法如下：

胶的制备：取100ml烧杯，向其中加入ddH₂O 18ml，5×TBE 6ml， 40％Acr-Bis 6ml，TEMED 30μl，10％APS 300μl，混合均匀备用。 将玻璃板装配好，用质量百分比10％的琼脂糖封底，待琼脂糖凝住， 把配好的胶沿缝隙轻轻灌进两玻璃板间，防止出现气泡。插入梳子静 置半个小时以待胶凝结。

电泳：将制好的板拔去梳子后，组装到电泳槽上，上、下槽缓冲 液为1.0×TBE。在扩增样品中加入3μl loading buffer，混匀，吸入2.5μl 的样加入点样孔中，恒电压220V电泳120min。电泳结束后，小心分 开两块玻璃板，将胶剥离下来，等待银染。

显影：将剥离下的胶放入在塑料盒中，加入200ml ddH₂O漂洗胶 块后倒弃，加入90ml ddH₂O、10ml乙醇和500μl冰醋酸固定，轻摇 3-5min，加入1ml的质量百分含量20％AgNO₃溶液染色7-10min，倒 掉染色液，用ddH₂O快速洗2次，倒掉ddH₂O。在塑料盒中加入100ml 的质量百分含量3％NaOH溶液和500μl甲醛显影，轻摇直至条带显 示清楚，倒掉显影液，加入ddH₂O清洗，取出胶平铺照相。

电泳结果见图1，其中PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带序号代表的 依次是：M:20bp ladder Takara；1-3:A.strigosa；4-6:A.hispanica；7-9: A.brevis；10-12:A.nudabrevis；13-15:A.maroccana；16-18:A.murphy； 19-21:A.magna；22-24:A.sativa；25-27:A.fatua；28-30:A.sterilis；31-33: A.chinensis。

可从电泳结果中判读出A.strigosa、A.hispanica、A.brevis和 A.nudabrevis有一条清晰的条带，为二倍体，A.maroccana、A.murphy 和A.magna有两条清晰的条带，为四倍体，A.sativa、A.fatua、A.sterilis 和A.chinensis有三条清晰的条带，为六倍体。

实施例4燕麦属植物染色体倍性的观察鉴定

参考刘伟等的方法[刘伟，张宗文，吴斌.加拿大引进的二倍体燕 麦种质的核型鉴定.植物遗传资源学报.2013,14(1):141-145]，对实施 例1-3所涉及的燕麦属植物的染色体倍性进行观察鉴定，具体方法如 下：

取籽粒饱满的燕麦种子放在洁净的培养皿中，加水浸没种子，置 于23℃恒温培养箱中培养直到露白，将露白种子放在洁净的垫有已 灭菌浸水滤纸的培养皿中，置于4℃冰箱48h，然后置于23℃恒温培 养箱中长根，待根长至1.0-2.0cm时，剪取新生粗壮根尖于冰水中预 处理48h，接着将根尖转入卡诺氏固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1， V/V)中在4℃下进行固定24h，然后用1mol/L盐酸在60℃下解离 10min，最后用改良的苯酚品红进行染色10min，进行常规压片，制 好的片子在光学显微镜下观察并拍照，具体见图2、图3、图4： A.strigosa、A.hispanica、A.brevis和A.nudabrevis为二倍体， A.maroccana、A.murphy和A.magna为四倍体，A.sativa、A.fatua、 A.sterilis和A.chinensis为六倍体。

结果显示，实施例1-3的方法鉴定得到的燕麦属植物染色体倍性 与使用实施例4的方法鉴定得到的结果相一致，说明实施例1-3的方 法可准确鉴定燕麦属植物染色体倍性，且其具有所得到的条带清晰、 判断方法简单的优点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。