一种抑制链球菌和/或预防链球菌感染的疫苗

摘要

本发明公开了一种抑制链球菌和/或预防链球菌感染的疫苗。本发明提供的疫苗，其活性成分由成分甲和成分乙组成；所述成分甲为分选酶、具有所述分选酶的融合蛋白、所述分选酶与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述分选酶与多糖的连接复合物或携带所述分选酶的编码基因的DNA表达载体；所述成分乙为霍乱毒素B亚单位或具有霍乱毒素B亚单位的融合蛋白。本发明提供的疫苗具有高效、广谱、和低价的优越性。同时本发明提供的疫苗采用粘膜免疫的途径，具有无组织损伤、无局部副作用和使用简便的特点，易于推广使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制链球菌和/或预防链球菌感染的疫苗。

背景技术

A型链球菌（Group A Streptococcus pyogenes,以下简称A链菌）,又称A族链球 菌或A群链球菌，可引起多种疾病，轻者包括扁桃体炎、脓疱病、丹毒等各种类型的皮 肤及软组织感染，重者则为严重的侵袭性感染，可危及生命，如肺炎、菌血症、中毒 性休克和急性坏死性肌膜炎（Necrotizing Fasciitis）。后者在12-24小时出现大片组 织坏死导致死亡，死亡率高达60％，幸运者常以截肢为代价，因而以“食人菌”著称， 并有成为生物恐怖武器的可能。A链菌引起人们重视的另一重要原因是它与自身免疫性 疾病有关。反复发作的A链菌性扁桃体炎可导致自身免疫性后遗症，如急性风湿热、风 湿性心脏病、肾小球肾炎以及牛皮癣等。其中风湿性心脏病在世界心血管疾病死亡率 中占首位，因此一直为世界卫生组织和科学家所重视。

世界卫生组织的统计表明全球每年有180万人严重感染A链菌，50多万人因A链菌感 染而死亡，约有1.1亿人表浅感染，6.1亿人扁桃体炎和咽炎，并有1800多万人因A链菌 感染导致自身免疫性疾病。此外，历史上造成人类死亡最多的流感，其死亡原因的90% 是继发细菌性肺炎导致的急性肺损伤，主要的致病菌是肺炎链球菌和A链菌。

目前在国内外都没有A链菌的疫苗。由于A链菌有>150种菌型，并且决定A链菌 血清型的M蛋白与人组织蛋白有相似性，被认为是引起自身免疫性疾病的原因。这些 严重阻碍了A链菌疫苗的研发进程。因此，迫切需要开发安全、有效、广谱、和易于 推广应用的疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制链球菌和/或预防链球菌感染的疫苗。

本发明提供的疫苗，其活性成分由成分甲和成分乙组成；所述成分甲为分选酶 （sortase）、具有所述分选酶的融合蛋白、所述分选酶与佐剂蛋白共轭连接的蛋 白、所述分选酶与多糖的连接复合物或携带所述分选酶的编码基因的DNA表达载 体；所述成分乙为霍乱毒素B亚单位或具有霍乱毒素B亚单位的融合蛋白；所述疫 苗的功能为如下（Ⅰ）或（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）抑制革兰氏阳性致病菌；（Ⅱ） 预防和/或治疗革兰氏阳性致病菌感染；（Ⅲ）预防革兰氏阳性致病菌导致的人粘膜系 统感染；（Ⅳ）降低或防止革兰氏阳性致病菌在人粘膜系统的定居和感染。

所述分选酶可为分选酶A、分选酶B、分选酶C、分选酶D或分选酶E。

所述分选酶为从革兰氏阳性菌中提取的分选酶、大肠杆菌表达的分选酶、酵母表 达的分选酶或哺乳动物细胞表达的分选酶。

所述分选酶为大肠杆菌表达的重组蛋白、酵母表达的重组蛋白或哺乳动物细胞表 达的重组蛋白形式的分选酶。

所述酵母表达为酿酒酵母、汉逊酵母或毕氏酵母等酵母表达系统。

所述分选酶可源自A型链球菌但不限于A型链球菌。

细菌分选酶A具有高度同源性，普遍存在于革兰氏阳性菌的细胞壁中，具有将细 菌毒力因子连接到细菌表面的功能。已发现的分选酶除了分选酶A以外，还有分选酶 B、C、D和E，它们有与分选酶A相似的功能，但同源性和所连接的蛋白种类远远低于 分选酶A。病原微生物表面分子的持续变异是疫苗研究面临的最大挑战，选择病原菌 的共有分子是疫苗设计的重要策略。分选酶A的同源性无疑是广谱链球菌疫苗的理想 选择。所述分选酶A具体可为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列3自N末端第 22至189位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。所述“具有所述分选酶 的融合蛋白”具体可为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列3所示的氨基酸序列 组成的蛋白质；（d）将（c）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 具有相同活性的由其衍生的蛋白质。

所述多糖为A型链球菌的多糖、B型链球菌的荚膜多糖或肺炎球菌的荚膜多糖。

所述霍乱毒素B亚单位可为源自霍乱弧菌的霍乱毒素B亚单位。所述霍乱毒素 B亚单位可以以单体或多聚体的形式存在。所述霍乱毒素B亚单位具体可为如下（e） 或（f）：（e）由序列表中序列4所述氨基酸序列组成的蛋白质；（f）将（e）经过一个 或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。

所述成分甲和所述成分乙的质量配比为20:1-2。

所述革兰氏阳性致病菌可为链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、粪肠球菌或 炭疽杆菌。所述链球菌可为A型链球菌、B型链球菌、C型链球菌、G型链球菌、肺 炎链球菌、猪链球菌或马链球菌。所述的A型链球菌具体可为A型链球菌M1型、A 型链球菌M12型、A型链球菌M28型或A型链球菌M49型。

所述人粘膜系统可为呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统或皮肤。

所述疫苗的使用方式包括鼻腔吸入、口服、皮下注射、皮内注射、生殖道注入或 肛内注入。

本发明提供的疫苗的推荐使用方法：成分甲的蛋白用量为20-30μg/次，成分乙 的蛋白用量为1-2μg/次，免疫次数为3-5次，间隔一周。免疫方式为鼻腔吸入。

本发明还保护以上任一所述成分甲和以上任一所述成分乙在制备抑制疫苗中的应 用；所述疫苗的功能为如下（Ⅰ）或（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）抑制革兰氏阳性 致病菌；（Ⅱ）预防和/或治疗革兰氏阳性致病菌感染；（Ⅲ）预防革兰氏阳性致病菌导 致的人粘膜系统感染；（Ⅳ）降低或防止革兰氏阳性致病菌在人粘膜系统的定居和感染。

所述成分甲和所述成分乙的质量配比为20:1-2。

所述革兰氏阳性致病菌可为链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、粪肠球菌或 炭疽杆菌。所述链球菌可为A型链球菌、B型链球菌、C型链球菌、G型链球菌、肺 炎链球菌、猪链球菌或马链球菌。所述的A型链球菌具体可为A型链球菌M1型、A 型链球菌M12型、A型链球菌M28型或A型链球菌M49型。

所述人粘膜系统可为呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统或皮肤。

本发明人经过长期深入研究发现A型链球菌经呼吸道粘膜免疫后产生以Th17为主 的免疫反应，并对此菌的再次感染有显著保护作用。Th17细胞是近年来新发现的一类T 细胞，粘膜免疫后产生的免疫记忆Th17细胞能迅速迁移到感染的粘膜部位，在抗粘膜 细菌感染起重要作用。与B细胞提供的免疫不同，T细胞提供的免疫具有耐受抗原变异 的特点，能提供对同种异型细菌的交叉免疫保护，是新型疫苗构建的理论基础。Th17 细胞活化后释放的细胞因子IL-17激活中性粒细胞和巨噬细胞吞噬，有效地杀死进入机 体的病原菌。发明人已证明A链菌的粘膜免疫保护依赖于Th17细胞的活化。因此激活 Th17免疫反应是粘膜感染细菌A链菌疫苗的目标和重要评价依据。亚单位疫苗的弱点之 一是常需要连接在载体上以获得较好的免疫原性。粘膜佐剂不仅能促进Th17细胞的活 化，还促进疫苗亚单位在粘膜部位被抗原加工细胞摄取，显著增强其免疫原性和免疫 效果，同时避免肌肉或皮下免疫因佐剂会引起的局部组织反应。分选酶经粘膜免疫能 有效的降低或防止链球菌在人粘膜系统的定居和感染率。

本发明提供的疫苗的使用方式包括鼻腔吸入、口服、皮下注射、皮内注射、生殖 道注入、肛内注入等。本发明提供的疫苗可用于各种革兰氏阳性细菌导致的粘膜系统 （呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统或皮肤）感染的预防和治疗。

本发明利用分选酶A在链球菌中的普遍性和同源性、粘膜免疫佐剂增强抗原免疫 原性和粘膜途径免疫诱导Th17活化的特性设计了合理的疫苗配方，显著提高了Th17 细胞和活化和IL-17细胞因子的水平，可以达到阻止病原菌定居和迅速清除病原菌的 作用，且对不同血清型A链菌均具有保护效果，具有高效、广谱、和低价的优越性。 同时本发明提供的疫苗采用粘膜免疫的途径，具有无组织损伤、无局部副作用和使用 简便的特点，易于推广使用。

附图说明

图1为制备分选酶A基因过程中的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为制备分选酶A过程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3为实施例2的结果（鼻腔吸入分选酶A和CTB蛋白后对A型链球菌感染的免 疫保护）。

图4为实施例3的结果（分选酶A和CTB蛋白粘膜免疫诱导以Th17细胞为主的免 疫反应）。

图5为实施例4的结果（分选酶A和CTB免疫诱导小鼠产生对A型链球菌的Th17 免疫记忆反应）。

图6为实施例5的结果（在细菌感染小鼠之前应用抗体中和IL-17A可以显著降低 免疫小鼠清除细菌的能力）。

图7为实施例6的结果（给予分选酶A和CTB后，无抗体小鼠的Th17细胞明显增 高，但无抗体测出，并显示获得了与野生型小鼠相似的免疫保护）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

A型链球菌M1型：来源于明尼苏达州立大学微生物系，参考文献：Wang B,Dileepan  T,Briscoe S,Hyland KA,Kang J,Khoruts A,Cleary PP.Induction of TGF-beta1  and TGF-beta1-dependent predominant Th17differentiation by group A  streptococcal infection.Proc Natl Acad Sci U S A.2010;107(13):5937-42.。

A型链球菌M12型：参考文献：Retnoningrum DS,Podbielski A,Cleary PP.Type  M12protein from Streptococcus pyogenes is a receptor for IgG3.J Immunol.1993 Mar15;150(6):2332-40.。

A型链球菌M28型：参考文献：Green NM,Zhang S,Porcella SF,Nagiec MJ,Barbian  KD,Beres SB,LeFebvre RB,Musser JM.Genome sequence of a serotype M28strain  of group a streptococcus:potential new insights into puerperal sepsis and  bacterial disease specificity.J Infect Dis.2005Sep1;192(5):760-70.。

A型链球菌M49型：参考文献：Haanes EJ,Cleary PP.Identification of a  divergent M protein gene and an M protein-related gene family in Streptococcus  pyogenes serotype49.J.Bacteriol.1989Dec;171(12):6397-408.。

霍乱弧菌：参考文献Rolfs A,Montor WR,Yoon SS,Hu Y,Bhullar B,Kelley  F,McCarron S,Jepson DA,Shen B,Taycher E,Mohr SE,Zuo D,Williamson J, Mekalanos J,Labaer.Production and sequence validation of a complete full  length ORF collection for the pathogenic bacterium Vibrio cholerae.J.Proc Natl  Acad Sci U S A.2008March18;105(11):4364–4369.。

载体pET28a(+)：Novagen公司,Cat.No.69846-3。大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS： 购自北京康为试剂生物技术有限公司,产品编号:CW0810A。BALB/c小鼠：购自Charles  River；STRAIN CODE：028。无抗体小鼠：此种小鼠没有B细胞，不能产生抗体；购自 美国杰克森实验（Jackson Labs），品系号002288。

CTB蛋白（霍乱毒素B亚单位）：购自Sigma公司，货号C9903，如序列表的序列4 所示。使用时，用PBS缓冲液(pH为7.4)溶解，得到CTB蛋白溶液。

实施例1、分选酶A的制备

1、以A型链球菌M1型的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1。

F1：5’-CTTACATATGGTCTTGCAAGCACAAATGG-3’；

R1：5’-ATGTTCTCGAGCTAGGTAGATACTTGGTTATAAGA-3’。

2、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切载体pET28a(+)，回收约6000bp的载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-SrtA。根 据测序结果，对重组质粒pET28a-SrtA进行结果描述如下：在载体pET28a(+)的NdeI和 XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列1自5’末端第244-750位核苷酸所示的双链DNA 分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列2所示的融合基因， 表达序列表的序列3所示的融合蛋白。

5、将重组质粒pET28a-SrtA导入大肠杆菌BL21gold(DE3)plysS，得到重组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、 220rpm振荡培养至OD_560nm=0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/ml，37℃、220rpm 振荡培养4小时。

7、取步骤6的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH7.4的PBS 缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎（功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次）， 然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于GE公司Ni Sepharose6Fast Flow，先用溶液Ⅰ (pH为7.4，溶剂为水，含20mM Na₂HPO₄和500mM NaCl)进行10个柱体积的洗脱以去除 杂蛋白，然后用溶液Ⅱ（pH为7.4，溶剂为水，含200mM咪唑、20mM Na₂HPO₄和500mM NaCl）进行2个柱体积的洗脱以获得目的蛋白，收集采用溶液Ⅱ洗脱时的过柱后溶液， 将其命名为分选酶A溶液。

每升步骤6的培养体系可获得90%纯度以上的蛋白50毫克。

制备分选酶A蛋白过程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图2。图2中，泳道1为蛋白分 子量标准，泳道2为步骤7得到的上清液，泳道3为采用溶液Ⅰ洗脱时的过柱后溶液，泳 道4为分选酶A蛋白。

实施例2、鼻腔吸入分选酶A和CTB蛋白后对A型链球菌感染的免疫保护

一、将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为两组，分组处理如下：

PBS组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液；

分选酶A/CTB组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是将 实施例1制备的分选酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次给予20μg分选 酶A和1μg CTB蛋白)。

实验第21天，用活菌（A型链球菌M1型、A型链球菌M12型、A型链球菌M28型或A型 链球菌M49型）通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒（菌液的浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只 小鼠滴注10μl）。攻毒18小时后处死小鼠，分离鼻相关淋巴组织(Nasal Associated  Lymphoid Tissue,简称NALT),制成单细胞悬液，用血平板培养检测NALT中的A型链球 菌活菌数。

结果见图3A-D，每个黑点代表1只小鼠（纵坐标指的是每只小鼠的整个NALT中A链 菌的CFU数量）。A型链球菌M1型攻击后，分选酶A/CTB组小鼠NALT中的活菌数明显比PBS 组少，表明本发明提供的疫苗经呼吸道粘膜免疫能有效地清除A型链球菌M1型的感染。 A型链球菌M12型、A型链球菌M28型或A型链球菌M49型攻击后，分选酶A/CTB组小鼠NALT 中的活菌数均明显比与PBS组少，表明本发明提供的疫苗对不同血清型的A型链球菌感 染均有抑制作用，可以有效保护动物。

二、将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为两组，分组处理如下：

PBS组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液；

分选酶A20μg/CTB1μg组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗 液(疫苗液是将实施例1制备的分选酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次 给予20μg分选酶A和1μg CTB蛋白)；

分选酶A20μg/CTB2μg组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗 液(疫苗液是将实施例1制备的分选酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次 给予20μg分选酶A和2μg CTB蛋白)。

实验第21天，用活菌（A型链球菌M1型）通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒（菌液的浓 度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）。攻毒18小时后处死小鼠，分离NALT,制 成单细胞悬液，用血平板培养检测NALT中的A型链球菌活菌数。

结果见图3E，每个黑点代表1只小鼠（纵坐标指的是每只小鼠的整个NALT中A链菌 的CFU数量）。分选酶A与CTB的比列在20：1与20：2之间均有免疫保护效果，其间 无显著差异（P=0.43）。

实施例3、分选酶A和CTB蛋白粘膜免疫诱导以Th17细胞为主的免疫反应

Th17细胞在粘膜免疫保护中起主要作用，本实施例的目的为验证分选酶A和CTB 蛋白诱导Th17细胞活化的效应。

将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为四组，分组处理如下：

PBS组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液；

分选酶A组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入实施例1制备的分选 酶A溶液（每只小鼠每次给予20μg分选酶A）；

CTB组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入CTB蛋白溶液（每只小鼠 每次给予1μg CTB蛋白）；

分选酶A/CTB组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗液 是将实施例1制备的分选酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次给予20 μg分选酶A和1μg CTB蛋白)。

实验第21-24天，分离NALT。通过流式细胞仪检测小鼠NALT中各类T细胞的变 化，见图4A（各组均为6只小鼠的平均值）。与PBS组相比，疫苗液免疫后Th17细胞 的数量显著增加，而分选酶A或者CTB蛋白单独免疫后Th17细胞的数量均没有明显变 化。Th1细胞的数量在分选酶A和CTB蛋白单独或共同免疫的小鼠中都与PBS组相似， 即保持在基础水平。说明分选酶A和CTB蛋白共同免疫诱导以Th17细胞为主的T细胞 免疫反应。

CD4⁺细胞中的细胞因子IL-17在分选酶和CTB免疫后大量表达，而Th1细胞的标 志性因子IFN-γ虽比对照有明显增高，但远远低于增高的IL-17。这些数据表明，分 选酶A和CTB联合免疫能活化Th17细胞和IL-17细胞因子的表达。

实验第21-24天，用A型链球菌M1型通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒（菌液的浓度 为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）。攻毒18小时后处死小鼠，分离NALT,制 成单细胞悬液，用血平板培养检测NALT中的A型链球菌活菌数。见图4B，每个黑点 代表1只小鼠（纵坐标指的是每只小鼠的整个NALT中A链菌的CFU数量）。分选酶A/CTB 组活菌数明显比PBS组降低，而分选酶A或CTB蛋白单独免疫的小鼠与PBS组相比没 有差别。即NALT中活菌数的存留与Th17细胞的变化相符，说明有效的免疫保护与Th17 细胞的活化相关。攻毒18小时后RT-PCR检测NALT中Th17细胞的标志性细胞因子的 表达量，以GAPDH的表达量为内参。见图4C。

用于通过RT-PCR鉴定IL-17a mRNA的引物如下：

    上游引物：CGCAAAAGTGAGCTCCAGA；

    下游引物：TGAGCTTCCCAGATCACAGA。

用于通过RT-PCR鉴定IFN-γmRNA的引物如下：

    上游引物：GCGTCATTGAATCACACCTG；

    下游引物：GAGCTCATTGAATGCTTGGC。

用于通过RT-PCR鉴定GAPDH mRNA的引物如下：

    上游引物：CATGGCCTTCCGTGTTCCTA；

    下游引物：GCGGCACGTCAGATCCA。

实施例4、分选酶A和CTB免疫诱导小鼠产生对A型链球菌的Th17免疫记忆反应

本实施例为证明疫苗配方免疫能建立对A型链球菌的Th17记忆反应。

一、将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为四组，分组处理如下：

PBS组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液；

分选酶A组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入实施例1制备的分选 酶A溶液（每只小鼠每次给予20μg分选酶A）；

CTB组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入CTB蛋白溶液（每只小鼠 每次给予1μg CTB蛋白）；

分选酶A/CTB组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗液 是将实施例1制备的分选酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次给予20 μg分选酶A和1μg CTB蛋白)。

实验第21-24天，用A型链球菌M1型通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒（菌液的浓度为 2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）。攻毒72小时后处死小鼠，分离NALT并检测 感染后Th17细胞的数量。结果见图5A（各组均为8只小鼠的平均值）。CD4⁺IFN-γ⁺T细 胞数在各组中没有明显变化，CD4⁺IL-17⁺T细胞仅在分选酶A/CTB组小鼠中明显升高， 表明本发明提供的疫苗配方建立了对A型链球菌的Th17的免疫记忆反应。

二、将4-6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为六组，分组处理如下：

PBS/PBS组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液，实验第24天 用PBS缓冲液通过鼻腔滴注小鼠（每只小鼠滴注10μl）；

PBS/分选酶A组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液，实验第 24天用实施例1制备的分选酶A溶液通过鼻腔滴注小鼠（每只小鼠每次给予20μg分选 酶A，每只小鼠滴注10μl）；

PBS/M1组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液，实验第24天用 A型链球菌M1型通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒（菌液的浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只 小鼠滴注10μl）；

分选酶A/CTB/M1组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是 将实施例1制备的分选酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次给予20μg分 选酶A和1μg CTB蛋白)，实验第24天用A型链球菌M1型通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒 （菌液的浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）；

分选酶A/CTB/M28组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗液 是将实施例1制备的分选酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次给予20μg 分选酶A和1μg CTB蛋白)，实验第24天用A型链球菌M28型通过鼻腔滴注对小鼠进行攻 毒（菌液的浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）；

分选酶A/CTB/M49组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗液 是将实施例1制备的分选酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次给予20μg 分选酶A和1μg CTB蛋白)，实验第24天用A型链球菌M49型通过鼻腔滴注对小鼠进行攻 毒（菌液的浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）。

攻毒72小时后处死小鼠，分离NALT并检测Th17细胞的数量。结果见图5B（各组均 为8只小鼠的平均值）和图5C。Th17记忆反应不仅能被M1菌株，也能被不同血清型的A 型链球菌诱导。分选酶A/CTB免疫小鼠在M28、M49和M1攻击后CD4⁺IL-17⁺T细胞数显 著增加，但在没有进行分选酶A/CTB免疫的小鼠中没有明显变化。这些结果说明分选酶 A/CTB免疫后活化的Th17细胞能在不同血清型的A型链球菌感染时扩增，发挥免疫保护 作用。

实施例5、在细菌感染小鼠之前应用抗体中和IL-17A可以显著降低免疫小鼠清除细 菌的能力

IL-17中和抗体：购自BioXCell公司，产品目录号为17F3。同型对照抗体：购自 BioXCell公司，产品目录号为MOPC-21。IL-17A是Th17细胞产生的主要细胞因子。为证 明本发明提供的疫苗配方通过活化Th17细胞提供免疫保护和考虑到IL-17A^-/^-缺陷小 鼠有其它可能的免疫缺损，本实施例中采用了中和抗体体内阻断的方法。

PBS组：取4-6周龄的雌性BALB/c小鼠，实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴 入PBS缓冲液，实验第15天、第17天、第19天和第21天分别腹腔注射PBS缓冲液，实验 第21天用A型链球菌M1型或A型链球菌M28型通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒（菌液的浓度 为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl），攻毒18小时后分离NALT,制成单细胞悬 液，用血平板培养检测NALT中的A型链球菌活菌数。

IL-17中和抗体组：取4-6周龄的雌性BALB/c小鼠，实验第1天、第7天和第14天分 别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是将实施例1制备的分选酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到 的，每只小鼠每次给予20μg分选酶A和1μg CTB蛋白)，实验第15天、第17天、第19 天和第21天分别腹腔注射IL-17中和抗体（每只小鼠每次给予100μg IL-17中和抗体）， 实验第21天用A型链球菌M1型或A型链球菌M28型通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒（菌液的 浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl），攻毒18小时后分离NALT,制成单细 胞悬液，用血平板培养检测NALT中的A型链球菌活菌数。

同型对照抗体组：用等体积和等浓度的同型对照抗体代替IL-17中和抗体，其它同 IL-17中和抗体组。

结果见图6（每个黑点代表1只小鼠，纵坐标指的是每只小鼠的整个NALT中A链菌的 CFU数量）。分别用A链菌M1型（图6A）和M28型菌株（图6B）攻击后，免疫分选酶A/CTB 和注射同型对照抗体的小鼠的NALT中的活菌数显著低于免疫分选酶A/CTB和注射IL-17 中和抗体的小鼠，免疫分选酶A/CTB和注射IL-17中和抗体的小鼠的NALT中的活菌数与 未免疫分选酶A/CTB且未注射IL-17中和抗体的小鼠无明显差别。结果证明分选酶A/CTB 诱导的IL-17A在抗不同血清型GAS粘膜感染中有重要作用。

实施例6、给予分选酶A和CTB后，无抗体小鼠的Th17细胞明显增高，但无抗体测出， 并显示获得了与野生型小鼠相似的免疫保护

PBS组：取4-6周龄的雌性BALB/c小鼠（Wt）或4-6周龄的无抗体小鼠（μMT），实 验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入PBS缓冲液，实验第21天用A型链球菌M1型通 过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒（菌液的浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）， 攻毒18小时后分离NALT,制成单细胞悬液，用血平板培养检测NALT中的A型链球菌活菌 数、取血和口鼻洗液并分别通过ELISA检测分选酶A特异性抗体。攻毒72小时后，分离 NALT,制成单细胞悬液，检测Th17细胞。

分选酶A/CTB组：取4-6周龄的雌性BALB/c小鼠（Wt）或4-6周龄的无抗体小鼠（μMT）， 实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是将实施例1制备的分选酶A 溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次给予20μg分选酶A和1μg CTB蛋白)， 实验第21天用A型链球菌M1型通过鼻腔滴注对小鼠进行攻毒（菌液的浓度为2×10⁸CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl），攻毒18小时后分离NALT,制成单细胞悬液，用血 平板培养检测NALT中的A型链球菌活菌数、取血和口鼻洗液并分别通过ELISA检测分选 酶A特异性抗体。攻毒72小时后，分离NALT,制成单细胞悬液，检测Th17细胞。

NALT中的A型链球菌活菌数结果见图7A（每个黑点代表1只小鼠，纵坐标指的是每 只小鼠的整个NALT中A链菌的CFU数量），Th17细胞反应结果见图7B（各组均为8只小鼠 的平均值）。结果显示，μMT小鼠表现出与野生型小鼠相似的保护能力，并伴有升高 的Th17细胞。

ELISA检测的分选酶抗体结果见图7C和7D（各组均为8只小鼠的平均值）。免疫分 选酶A和CTB的BALB/c小鼠的血清型抗体和分泌型抗体都明显升高，而在免疫的μMT小 鼠未检出。这些结果表明，分选酶A/CTB能诱导抗体和Th17免疫反应，但抗体在分选酶 A介导的免疫保护中不起作用。

综合上述结果，Th17细胞是提供免疫保护的主要免疫力。