一种细叶水团花用组织培养基组合物及快速组培方法

摘要

本发明属于植物离体组织培养技术领域，具体涉及一种细叶水团花用组织培养基组合物及利用该组合物的细叶水团花的快速组织培养方法。该组合物包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基，是在现有的MS培养基基础上改良所得的。本发明同时提供了一种高效的、快速的细叶水团花的组织培养方法，打破了细叶水团花传统繁殖方法的限制，可同时获得大量的细叶水团花再生植株，从而大幅缩短繁殖周期。经过数据统计，本发明所建立的细叶水团花的快繁体系，丛生芽的诱导率达到80%，诱导系数为4~6，增殖系数为8~10，生根率达到100%，形成再生植株的周期为3~4个月，对于细叶水团花的推广种植具有较为重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于植物离体组织培养技术领域，具体涉及一种细叶水团花用组织培养基组合物及利用该组合物的细叶水团花的快速组织培养方法。

背景技术

细叶水团花(Adina rubella )是茜草科(Rubiaceae)水团花属(Adina)的一种落叶小灌木，其枝条细长披散，有赤褐色柔毛。叶对生，厚纸质，无柄，叶片卵状，披针形或卵状椭圆形，表面深绿色，有光泽。头状花序单一或2-3个顶生或腋生；花紫红色。蒴果长卵状楔形。花期6-7月，果期9-10月。细叶水团花的枝条披散，俏丽婀娜。叶片狭长质厚，绿油油而闪闪泛光。花开时紫红球花满吐长蕊，奇丽夺目，适用于池畔、塘边配植，亦宜作花径绿篱，根、花可供药用，茎皮纤维可造纸和做人造棉等。细叶水团花的根干苍劲古朴、叶片细小稠密、色彩靓丽，因而也是制作盆景的好材料。

我国木本观赏植物离体培养工作始于20世纪70年代，但到目前为止，能通过组培快繁的树木种类还只占木本观赏植物总数的10％，其主要原因：一是组织培养过程中存在外植体褐变、试管苗玻璃化和生根难等现象；二是研究对象范围小，可借鉴和应用的技术很有限（木本观赏植物组织培养技术，李青林 ，邹永田 ，刘广林 ，黄晓光，河北农业科学，2010，14(6)：38—41，51），加之不同科属植物生长环境与生长特性的差异、所需的基本培养基与激素配比的差异、所需植物外植体的差异等等因素，迄今为止, 木本植物组培技术还难以找到可普遍遵循的规律。

木本植物组培技术在林业科研生产中的应用与其它植物一样，主要体现在植物的快速繁殖、植物脱毒、新品种培育和种质资源的保存等方面，不论在科研或生产中的应用，都应建立在成熟的植物组培技术基础上。组培快繁技术、组培脱毒技术已在草本植物中广泛推广应用，但木本植物组培快繁技术的产业化应用，尤其是规模化生产应用还为数不多。这其中主要因素是木本植物组培技术要求高，掌握难度大（木本植物组织培养技术在林业科研与生产中的应用与局限，吴丽君，福建林业科技，2003，30（1）：67-69，74），脱毒困难。

细叶水团花属于木本植物，其现行的繁殖方法主要是播种和扦插，到目前为止，用于细叶水团花的组培快繁技术与植株再生方法还未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种细叶水团花用组织培养基组合物及利用该组织培养基的细叶水团花组织培养方法。

本发明所采取的技术方案如下。

一种细叶水团花用组织培养基组合物，该组合物包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；

所述诱导培养基用于诱导细叶水团花发芽，以配制1L培养基为例，组分为：MS培养基的1号母液10mL+ MS培养基的2号母液10mL+ MS培养基的3号母液10mL+ MS培养基的4号母液10mL+肌醇100.0mg+VB₁ 10.0 mg+VB₆ 1.0mg+烟酸1.0 mg+椰汁20 mL +次氯酸钠5~15 mg +6-BA 3.0~6.0mg+NAA 1.0~3.0mg+琼脂8~11g+蔗糖10~25g+杀菌剂，水补足1L，pH值为5.5~5.8；

所述增殖培养基用于促进发芽后细叶水团花成苗，以配制1L培养基为例，组分为：MS培养基的1~6号母液各10mL+6-BA 0.8~2.0mg+NAA 0.05~0.4mg+琼脂8~11g+蔗糖20~40g+杀菌剂，水补足1L，pH值为5.5~5.8；

所述生根培养基用于促进成苗后细叶水团花生根，以配制1L培养基为例，组分为：MS培养基的1、3号母液各5mL+ MS培养基的2、4、5、6号母液各10mL+NAA 0.1~0.5mg+琼脂8~11g+蔗糖20~40g，水补足1L，pH值为5.5~5.8。

所述细叶水团花用组织培养基组合物，较为配方组分如下：

所述诱导培养基组分为： MS培养基的1号母液10mL+ MS培养基的2号母液10mL+ MS培养基的3号母液10mL+ MS培养基的4号母液10mL+肌醇100.0mg+VB₁ 10.0 mg+VB₆ 1.0mg+烟酸1.0 mg+椰汁20 mL +次氯酸钠15 mg +6-BA 6.0mg+NAA 3.0mg+琼脂11g+蔗糖25g+杀菌剂，水补足1L，pH值为5.5；

所述增殖培养基组分为：MS培养基的1~6号母液各10mL+6-BA 2.0mg+NAA 0.4mg+琼脂11g+蔗糖40g+杀菌剂，水补足1L，pH值为5.5；

所述生根培养基组分为： MS培养基的1、3号母液各5mL+ MS培养基的2、4、5、6号母液各10mL+NAA0.5mg+琼脂11g+蔗糖40g，水补足1L，pH值为5.5。

所述细叶水团花用组织培养基组合物中诱导培养基和增殖培养基中所述杀菌剂为：益培隆A剂333μL+B剂14.5 mg。

利用所述细叶水团花用组织培养基组合物的细叶水团花的组织培养方法，包括以下步骤：

（1）以细叶水团花当年生茎段为外植体，将外植体消毒灭菌后，用诱导培养基诱导形成丛生芽；培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000~3000Lux，培养时间为30~40d；

（2）将步骤（1）中的丛生芽分株用增殖培养基进行增殖培养形成丛生苗；培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000~3000Lux，培养时间为25~30d；

（3）将步骤（2）中丛生苗用生根培养基诱导形成生根苗；培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000~3000Lux，培养时间为25~30d；

（4）将步骤（3）中生根后的再生苗进行炼苗，25±2℃条件下生长7d，然后用流水洗去再生苗根部的培养基，根部杀菌移栽，即可得到再生植株。

步骤（1）中所述消毒灭菌包括以下步骤：

（1）将外植体流水冲洗10~12小时；

（2）在超净工作台上用75%的酒精表面灭菌50s，灭菌蒸馏水冲洗1~2次；

（3）用0.1%的氯化汞处理10min，灭菌蒸馏水冲洗2~3次；

（4）用10%次氯酸钠灭菌10~15min，灭菌蒸馏水冲洗4~5次，无菌滤纸吸去多余水分后用于接种。

步骤（4）所述杀菌采用1‰的高锰酸钾溶液。

步骤（4）所述移栽采用的栽培基质为消毒后的东北草炭和蛭石组成的栽培基质，以质量比计，其中东北草炭︰蛭石=2︰1。

通过多次试验、配比组合，本发明在现有的MS培养基基础上，提供了一种用于细叶水团花的组织培养基组合物，以此组合物为基础，本发明同时提供了一种高效的、快速的细叶水团花的组织培养方法，打破了细叶水团花传统繁殖方法的限制，可同时获得大量的细叶水团花再生植株，从而大幅缩短繁殖周期。经过数据统计，本发明所建立的细叶水团花的快繁体系，丛生芽的诱导率达到80%，诱导系数为4~6，增殖系数为8~10，生根率达到100%，形成再生植株的周期为3~4个月，相较于现有的细叶水团花的繁殖方式，对于细叶水团花的推广种植具有较为重要的应用价值。

附图说明

图1为将外植体接种于诱导培养基后诱导萌发的丛生芽；

图2为将丛生芽用增殖培养基扩增培养的丛生苗；

图3为将丛生苗用生根培养基诱导形成的生根苗。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

介绍具体实施例前，对本发明中所用的主要仪器设备和试剂简要介绍如下，未说明部分以本领域常用设备或试剂为准。

主要仪器设备有：

GXZ-430D智能光照培养箱，宁波东南仪器有限公司制造；

HIRAYAMA高压灭菌锅，株式会社平山制作所；

METTLER TOLEDO PH计，上海捷辰仪器有限公司。

主要试剂有：

NAA，天津光复精细化工研究所；

6-BA，南?京?金?合?力?化?工?科?技?有?限?公?司；

益培隆，上海宇涵生物科技有限公司；

次氯酸钠，辽阳市白塔日用化学有限公司；

氯化汞，瑞德凯化工科技有限公司。

本发明中所述MS培养基1~6号母液，以本领域常规方法配制，具体而言，以1L基础MS培养基所需物质计算，各型号母液中所包括的物质如下：

1号母液：KNO₃ 190g，NH₄NO₃ 165g，MgSO₄ 37g；

2号母液：CaCl₂·2H₂O 44g；

3号母液：KH₂PO₄ 17g；

4号母液： Na₂.EDTA 3.73g,FeSO₄.7H₂O 2.78g;

5号母液：KI 0.083g，H₃BO₃ 0.62g，MnSO₄·H₂O 1.69g，ZnSO₄·7H₂O  0.86g，Na₂MoO₄ 0.0025g，CuSO₄·5H₂O  0.0025g，CoCl₂·6H₂O  0.0025g；

6号母液：肌醇 10g，烟酸0.05g，甘氨酸 0.2g，盐酸吡哆辛 0.05g，盐酸噻胺 0.01g。

实施例1

本实施例所用的细叶水团花用组织培养基组合物，包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；

所述诱导培养基用于诱导细叶水团花发芽，以配制1L组织培养基为例，组分为：MS培养基的1号母液10mL+ MS培养基的2号母液10mL+ MS培养基的3号母液10mL+ MS培养基的4号母液10mL+肌醇100.0mg+VB₁ 10.0 mg+VB₆ 1.0mg+烟酸1.0 mg+椰汁20 mL +次氯酸钠5 mg +6-BA 3.0mg+NAA 1.0mg+琼脂8g+蔗糖10g+杀菌剂，水补足1L，pH值为5.8；杀菌剂为：益培隆A剂333μL+B剂14.5 mg；

所述增殖培养基用于促进发芽后细叶水团花成苗，以配制1L组织培养基为例，组分为： MS培养基的1~6号母液各10mL+6-BA 0.8mg+NAA 0.05mg+琼脂8g+蔗糖20g+杀菌剂，水补足1L，pH值为5.8；杀菌剂为：益培隆A剂333μL+B剂14.5 mg；

所述生根培养基用于促进成苗后细叶水团花生根，以配制1L组织培养基为例，组分为：MS培养基的1、3号母液各5mL+ MS培养基的2、4、5、6母液各10mL+NAA 0.1mg+琼脂8g+蔗糖20g，水补足1L，pH值为5.8。

利用上述细叶水团花用组织培养基组合物的细叶水团花的组织培养方法，包括以下步骤：

（1）以细叶水团花当年生茎段为外植体，将外植体消毒灭菌后，用诱导培养基诱导形成丛生芽；

所述外植体消毒灭菌包括以下步骤：

A．将外植体流水冲洗10小时；

B．在超净工作台上用75%的酒精表面灭菌50s，灭菌蒸馏水冲洗1次；

C．用0.1%的氯化汞处理10min，灭菌蒸馏水冲洗2次；

D．用10%次氯酸钠灭菌10min，灭菌蒸馏水冲洗4次，无菌滤纸吸去多余水分后用于接种；

培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度3000Lux，培养诱导形成丛生芽时间为40d。

丛生芽诱导效果如图1所示。对其中10瓶（每瓶接种6个）统计计算，结果显示，丛生芽的诱导率为70%，诱导系数为2~3，发芽效果较好且较为稳定。

（2）将步骤（1）中的丛生芽分株用增殖培养基进行增殖培养形成丛生苗；培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度3000Lux，培养时间为30d。

丛生苗诱导效果如图2所示。对其中30瓶（每瓶接种4个）统计计算，结果显示，增殖系数可达5~7，增殖效果明显。

（3）将步骤（2）中丛生苗用生根培养基诱导形成生根苗；培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度3000Lux，培养时间为30d。

根系生长效果如图3所示。对其中30瓶（每瓶接种8个）统计计算，结果显示，生根率可达95%，生根效果较好。

（4）将步骤（3）中生根后的再生苗进行炼苗，25±2℃条件下生长7d，然后用流水洗去再生苗根部的培养基，1‰的高锰酸钾溶液根部杀菌，移栽，栽培基质为消毒后的东北草炭和蛭石组成的栽培基质，以质量比计，其中东北草炭︰蛭石=2︰1，即可得到再生植株。

实施例2

本实施例所用的细叶水团花用组织培养基组合物，包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；

所述诱导培养基用于诱导细叶水团花发芽，以配制1L组织培养基为例，组分为MS培养基的1号母液10mL+ MS培养基的2号母液10mL+ MS培养基的3号母液10mL+ MS培养基的4号母液10mL+肌醇100.0mg+VB₁ 10.0 mg+VB₆ 1.0mg+烟酸1.0 mg+椰汁20 mL +次氯酸钠15 mg +6-BA 6.0mg+NAA 3.0mg+琼脂11g+蔗糖25g+杀菌剂，水补足1L，pH值为5.5；杀菌剂为：益培隆A剂333μL+B剂14.5 mg；

所述增殖培养基用于促进发芽后细叶水团花成苗，以配制1L组织培养基为例，组分为： MS培养基的1~6号母液各10mL+6-BA 2.0mg+NAA 0.4mg+琼脂11g+蔗糖40g+杀菌剂，水补足1L，pH值为5.5；杀菌剂为：益培隆A剂333μL+B剂14.5 mg；

所述生根培养基用于促进成苗后细叶水团花生根，以配制1L组织培养基为例，组分为： MS培养基的1、3号母液各5mL+ MS培养基的2、4、5、6号母液各10mL +NAA0.5mg+琼脂11g+蔗糖40g，水补足1L，pH值为5.5。

利用上述细叶水团花用组织培养基组合物的细叶水团花的组织培养方法，包括以下步骤：

（1）以细叶水团花当年生茎段为外植体，将外植体消毒灭菌后，用诱导培养基诱导形成丛生芽；

所述外植体消毒灭菌包括以下步骤：

A．将外植体流水冲洗12小时；

B．在超净工作台上用75%的酒精表面灭菌50s，灭菌蒸馏水冲洗2次；

C．用0.1%的氯化汞处理10min，灭菌蒸馏水冲洗2次；

D．用10%次氯酸钠灭菌15min，灭菌蒸馏水冲洗5次，无菌滤纸吸去多余水分后用于接种；

培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Lux，培养诱导形成丛生芽时间为30d。

此次对其中10瓶（每瓶接种6个）统计计算，结果显示，丛生芽的诱导率为80%，诱导系数为4~6，发芽效果较好且较为稳定。

（2）将步骤（1）中的丛生芽分株用增殖培养基进行增殖培养形成丛生苗；培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Lux，培养时间为25d。

对其中30瓶（每瓶接种4个）统计计算，结果显示，结果显示，增殖系数可达8~10，增殖效果明显。

（3）将步骤（2）中丛生苗用生根培养基诱导形成生根苗；培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Lux，培养时间为25d。

对其中30瓶（每瓶接种8个）统计计算，结果显示，生根率可达100%，生根效果较好且较为稳定。

（4）将步骤（3）中生根后的再生苗进行炼苗，25±2℃条件下生长7d，然后用流水洗去再生苗根部的培养基，1‰的高锰酸钾溶液根部灭菌，移栽，栽培基质为消毒后的东北草炭和蛭石组成的栽培基质，以质量比计，其中东北草炭︰蛭石=2︰1，即可得到再生植株。