基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法

摘要

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法。本发明提供的基因在作为短链醇耐受靶点上的应用中的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。本发明发现了该基因对短链醇敏感，与微生物对短链醇的耐受相关，可应用于短链醇耐受靶点。将微生物中的该基因敲除掉之后，能够显著提高所得重组菌株在乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或丁二醇中的耐受性。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及基因在作为短链醇耐受靶点上 的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法。

背景技术

随着全球石油供求关系的日益紧张，燃料乙醇作为清洁、可再生能源正 在成为新的燃料替代品。第一代燃料乙醇技术是以含糖质和淀粉质作物作为 原料生产乙醇，因为该第一代燃料乙醇技术所使用的原料需要用到糖质或淀 粉质的农作物，所以存在与人争粮的问题。第二代燃料乙醇技术是以世界上 最丰富的可再生资源木质纤维素为原料生产乙醇，其有效地避免了燃料乙醇 生产与人争粮的问题。

木质纤维素原料经预处理后主要生成葡萄糖和木糖两大单糖，而大多数 的乙醇生产菌株如酵母、运动发酵单胞菌等都不能天然利用木糖，那么如何 利用微生物快速发酵葡萄糖和木糖生产乙醇则成为了当前的研究热点。根据 科研报道，主要研究包括两个方面：(1)通过基因重组技术将表达异源或者 同源乙醇合成路径相关的酶的基因导入能够利用葡萄糖和木糖的微生物受体 细胞中进行发酵生产乙醇；(2)通过基因重组技术将与木糖利用相关途径的 酶的基因导入能够生产乙醇的微生物中。目前，科学家已研究报道了一系列 的重组微生物，可利用葡萄糖和木糖生产乙醇。

然而，当利用重组微生物发酵生产乙醇时，乙醇发酵的成功与否取决于 在发酵过程中对各种环境压力的耐受能力。根据研究报道，发酵过程中不断 增加的乙醇浓度所产生的压力是限制乙醇生产和最终阻止乙醇发酵的重要因 素之一。因此，如何提高重组微生物的乙醇耐受性是第二代燃料乙醇技术迫 切需要解决的问题。通过基因重组手段，改良微生物中的乙醇敏感相关基因 无疑是提高微生物的乙醇耐受性能的一个重要解决方案。因此，寻找微生物 中的乙醇敏感的关键基因靶点，对相关基因改良，对进一步提高乙醇发酵得 率有着非常积极的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的发明目的在于提供了一种基因在作为短链醇耐受靶 点上的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法。本发明发现了该 基因对短链醇敏感，与微生物对短链醇的耐受相关，可应用于短链醇耐受靶 点。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用，该基因具有I 或II所示的核苷酸序列中的任意一个：

I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

II具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个 核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的所示核苷酸序列功能相 同或相似的核苷酸序列。

大肠杆菌虽然不能天然高效合成乙醇，但它具有生长快速、培养简单、 遗传背景清晰、底物利用宽泛、能够利用木糖为单一碳源快速生长等优点， 是异源构建乙醇合成路径的良好宿主。上世纪90年代，Ingram课题组将来自运 动发酵单胞菌中的PET操纵子导入大肠杆菌W中，成功构建筛选了一株高产乙 醇的重组大肠杆菌KO11，它在复杂培养基中的乙醇得率超过100％，是目前报 道的共利用葡萄糖和木糖产乙醇最具潜力的菌株之一。然而，菌株KO11的乙 醇耐受性较差，当乙醇浓度达到35g/L时生长几乎全部被抑制，其乙醇耐受力 较低，严重限制了菌株发酵生产乙醇的产量。本发明通过探究菌株KO11乙醇 耐受能力差的原因，寻找到一个新的乙醇敏感性基因。该基因具有如SEQ ID  NO:1所示的核苷酸序列。该基因在NCBI公布的大肠杆菌KO11基因组上的基 因编号为EKO11_3023，由于该基因编码假设蛋白，具体功能尚不知。在本发 明中，根据本发明鉴定的功能(乙醇敏感性蛋白-ethanol sensitive protein A) 将该基因命名为espA。

实验结果证实，将大肠杆菌KO11中的该基因敲除掉之后，能够显著提高 所得重组菌株在乙醇中的耐受性。在本发明的另外一些实施例中，实验结果 还发现，将微生物中的该基因敲除掉之后，能够显著提高所得重组菌株在异 丙醇或正丁醇中的耐受性。说明该基因与微生物对短链醇的耐受有一定的关 联。

优选地，本发明提供的应用中的短链醇为乙醇、正丙醇、正丙醇、异丙 醇、正丁醇、异丁醇或丁二醇。在本发明的一些实施例中，本发明提供的应 用中的短链醇为乙醇、异丙醇或正丁醇。在本发明的另外一些实施例中，本 发明提供的应用中的短链醇为乙醇。

优选地，本发明提供的应用具体为作为短链醇筛选标记基因。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的应用具体为作为短链醇筛选标 记基因时，可将该基因作为反向筛选标记，将此基因作为质粒筛选标记，用 短链醇作为筛选压，反向筛选。这和抗性筛选相反，即不生长的重组微生物 含有目标质粒。也可以将该基因作为正向筛选标记，将此基因导入质粒中， 同时将酶切位点设计在这个基因内部，所设酶切位点不改变基因翻译之后所 得的氨基酸序列，将后续目标基因插入此酶切位点而使其失活，用短链醇作 为筛选压，短链醇抗性高的菌株中的质粒即含有目标基因。用该基因作为短 链醇筛选标记基因时，区别于其它常用抗性基因标记基因。以质粒为例，现 有的以抗性基因作为标记基因的质粒的多克隆位点与抗性基因标记各自独 立，抗生素压力只能筛选质粒是否转化成功，不能说明质粒是否含有目标插 入基因，需要蓝白斑筛选辅助验证目标基因的插入，且该方法存在较高的假 阳性且验证较为繁琐；而用本发明中的短链醇敏感基因作为标记，将克隆位 点和短链醇耐受筛选标记合二为一，单用短链醇压力筛选，短链醇耐受性提 高的即为插入有目标基因的质粒，可以简化筛选步骤并提高目标基因插入验 证的正确率。

优选地，本发明提供的应用具体为提高微生物短链醇耐受性。在本发明 的一些实施例中，本发明提供的应用中所述针对的微生物为大肠杆菌或沙门 氏菌。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的应用中所针对的微生物 为大肠杆菌时，具体为大肠杆菌W或其衍生菌株。在本发明的另外一些实施 例中，本发明提供的应用中所针对的微生物为大肠杆菌W衍生菌株时，具体 为大肠杆菌KO11。

本发明还提供了一种提高微生物短链醇耐受性的方法，包括：

取微生物，敲除短链醇敏感基因，获得重组微生物；

该短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个：

I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

II具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个 核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列功能相 同或相似的核苷酸序列。

优选地，本发明提供的方法中的微生物为大肠杆菌或沙门氏菌。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中的微生物为大肠杆菌时， 具体为大肠杆菌W或其衍生菌株。在本发明的另外一些实施例中，本发明提 供的方法中的微生物为大肠杆菌W衍生菌株时，具体为大肠杆菌KO11。

优选地，本发明提供的方法中，步骤2中的同源重组所用重组系统为Red 重组系统。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，当大肠杆菌为大肠杆 菌W或其衍生菌株时，包括以下步骤：

步骤1：构建获得包含筛选标记基因和短链醇敏感基因的上、下游同源序 列的基因敲除盒；

步骤2：将步骤1所得基因敲除盒导入大肠杆菌中，通过同源重组，敲除 大肠杆菌中的短链醇敏感基因；

该短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个：

I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

II具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个 核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的核苷酸序列功能相同或 相似的核苷酸序列。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，步骤1中的筛选标记 基因为抗生素筛选标记基因。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的 方法中，步骤1中的抗生素筛选标记基因具体为卡那霉素抗性基因、氨苄青 霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。筛选标记基因的作用是作为筛选表型。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，步骤1中的基因 敲除盒包括筛选标记基因、短链醇敏感基因的上、下游同源序列，在基因敲 除盒中的排列顺序为：从5’-3’依次为短链醇敏感基因的上游同源序列、筛选 标记基因、短链醇下游同源序列。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，当大肠杆菌为大肠杆 菌KO11或其衍生菌株时，包括以下步骤：

步骤1：获得具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的上游引物；具有SEQ  ID NO:3所示的核苷酸序列下游引物；

步骤2：取步骤1所得上游引物和下游引物，以质粒pKD13为模板，扩 增得到含卡那霉素抗性基因筛选标记的短链醇敏感基因敲除盒；

步骤3：取含有Red重组酶基因的质粒导入大肠杆菌中，得重组大肠杆菌；

步骤4：取步骤2所得基因敲除盒，导入步骤3所得重组大肠杆菌中，通 过同源重组，敲除大肠杆菌中的短链醇敏感基因。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，敲除短链醇敏感基因 所用的基因敲除盒具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，当大肠杆菌为大 肠杆菌W或其衍生菌株时，步骤3中的质粒具体为质粒pKD46。

本发明还提供了一种短链醇耐受性高的重组微生物，该重组微生物为： 基因敲除微生物中的短链醇敏感基因，该短链醇敏感基因具有I或II所示的 核苷酸序列中的任意一个：

I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

II具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个 核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的核苷酸序列功能相同或 相似的核苷酸序列。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物中的微生物为大肠 杆菌或沙门氏菌。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中的大肠杆菌 为大肠杆菌W或其衍生菌株。在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组 微生物为大肠杆菌时，大肠杆菌W的衍生菌株具体为大肠杆菌KO11。在本发 明的一些实施例中，本发明提供的重组微生物为大肠杆菌W或大肠杆菌KO11。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中的大肠杆菌 为大肠杆菌W或其衍生菌株时，获得该重组微生物的方法包括如下步骤：

步骤1：构建获得包含筛选标记基因和短链醇敏感基因的上下游同源序列 的基因敲除盒；

步骤2：将步骤1所得基因敲除盒导入大肠杆菌中，通过同源重组，敲除 大肠杆菌中的短链醇敏感基因；

该短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个：

I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

II具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个 核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列功能相 同或相似的核苷酸序列。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组微生物中的大肠杆菌 为大肠杆菌W或其衍生菌株时，获得该重组微生物的方法包括以下步骤：

步骤1：获得具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的上游引物；具有SEQ  ID NO:3所示的核苷酸序列下游引物；

步骤2：取步骤1所得上游引物和下游引物，以质粒pKD13为模板，扩 增得到含卡那霉素抗性基因筛选标记的短链醇敏感基因敲除盒；

步骤3：取含有Red重组酶基因的质粒导入大肠杆菌中，得重组大肠杆菌；

步骤4：取步骤2所得基因敲除盒，导入步骤3所得重组大肠杆菌中，通 过同源重组，敲除大肠杆菌中的短链醇敏感基因。

本发明提供了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提 高微生物短链醇耐受性的方法。本发明提供的应用为一种基因在作为短链醇 耐受靶点上的应用，该基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或具有 SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列 获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的核苷酸序列功能相同或相似的核苷 酸序列。本发明发现了该基因对短链醇敏感，与微生物对短链醇的耐受相关， 可应用于短链醇耐受靶点。在本发明的一些实施例中，实验结果证实，将微 生物中该基因敲除掉之后，能够显著提高所得重组微生物在乙醇中的耐受性， 所得重组微生物对乙醇的耐受性得到显著提高，P＜0.05。在本发明的另外一 些实施例中，实验结果证实，将微生物中的该基因敲除掉之后，还能够显著 提高所得重组菌株在异丙醇或正丁醇中的耐受性。在本发明的另外一些实施 例中，通过以该基因为靶点，敲除该基因之后，获得了短链醇耐受性高的重 组微生物。

生物保藏说明

菌株K011△espA：分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli于2014年 09月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9647。

附图说明

图1示实施例1中大肠杆菌E5对乙醇的耐受性能，其中图1-A为大肠杆菌 E5、大肠杆菌KO11在添加不同浓度(0-60g/L)乙醇的含2％葡萄糖的LB培养 基中进行生长测试结果；图1-B为极高浓度乙醇(100g/L)添加对大肠杆菌E5、 大肠杆菌KO11的生长影响；

图2示实施例1中大肠杆菌KO11敲除36.6Kb序列后所得重组菌株的正确 性验证结果；

图3示实施例1中大肠杆菌D37K、大肠杆菌KO11、大肠杆菌E5，分别在 添加5％(v/v)乙醇的含2％葡萄糖的LB培养基的生长测试结果；

图4示实施例1中从36.6Kb缺失片段中寻找乙醇响应靶基因的过程，以及 过程中的基因敲除菌株的生长测试结果；

图5示实施例1中大肠杆菌K011△espA的构建过程中各个菌株的菌落 PCR验证结果；

图6示实施例1中大肠杆菌K011△espA对乙醇耐受性的验证实验结果；

图7示实施例1中大肠杆菌K011△espA对异丙醇耐受性的验证实验结果；

图8示实施例1中大肠杆菌K011△espA对正丁醇耐受性的验证实验结果；

图9示实施例2中大肠杆菌W△espA的构建过程中各个菌株的菌落PCR验 证结果；

图10示实施例2中大肠杆菌W△espA对乙醇耐受性的生长测试实验结 果；

图11示实施例3中espA基因表达盒的构建中重组质粒的正确性验证结果；

图12示实施例3中大肠杆菌MG1655(pET-espA)、大肠杆菌BL21(DE3) (pET-espA)对乙醇耐受性的生长测试实验结果。

具体实施方式

本发明公开了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提 高微生物短链醇耐受性的方法本领域技术人员可以参考本文内容，实现其应 用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显 而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法已经通过较佳的实 施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本 文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的基因在短链醇耐受上的应用、利用该基因提高微生物短链 醇耐受性的方法中的试剂和原料均可由市场购得。

为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面 结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1短链醇敏感基因的功能的确定

实验材料：

大肠杆菌KO11：购买自美国菌种保藏中心(ATCC)，菌株编号为ATCC (55124)；

质粒：pKD13质粒购买于耶鲁大学的大肠杆菌遗传保藏中心(CGSC)； pKD46质粒购买于耶鲁大学的大肠杆菌遗传保藏中心(CGSC)；pCP20质粒购 买于耶鲁大学的大肠杆菌遗传保藏中心(CGSC)。

10％(v/v)甘油：10mL甘油和90mL去离子水混合制得。

添加不同种类抗生素的LB培养基(抗生素种类为氨苄青霉素、卡那霉素)。

按照需求配置各个培养基，培养基中各个物质的浓度为：10g/L蛋白胨、 5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠，100μg/m L氨苄青霉素或50μg/m L卡那霉素。

添加不同浓度乙醇的含2％葡萄糖的LB培养基(乙醇含量为0-60g/L、 100g/L)：

按照需求配置各个培养基，培养基中各个物质的浓度为：20g/L葡萄糖、 10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠、0-60g/L或100g/L的乙醇。

添加不同体积浓度的乙醇的含2％葡萄糖的LB培养基：

按照需求配置各个培养基，培养基中各个物质的浓度为：20g/L葡萄糖、 10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠、不同体积浓度的乙醇。

各个引物：由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

实验方法：

(1)乙醇耐受性大肠杆菌的获得

以乙醇生产菌株大肠杆菌KO11为原始菌株，通过随机突变筛选得到乙醇 耐受能力提高的突变大肠杆菌，标记为大肠杆菌E5。

取大肠杆菌E5、大肠杆菌KO11，在添加不同浓度(0-60g/L)乙醇的含2％ 葡萄糖的LB培养基培养，培养24h后，测定OD₆₀₀，进行生长测试。实验结果 如图1-A所示，其中1代表大肠杆菌E5、2代表原始菌株KO11。从实验结果可 知，原始大肠杆菌KO11的生长对乙醇压力非常敏感，在乙醇浓度达到35g/L 时，生长即停滞；而突变大肠杆菌E5的生长随着乙醇压力的升高变化相当平 缓，在55g/L的较高乙醇压力下才表现为生长停滞。

另外，利用极高浓度乙醇(100g/L)添加对大肠杆菌E5、大肠杆菌KO11 进行短时间(1分钟，5分钟，10分钟，15分钟)处理以比较细胞存活率。实 验结果见图1-B，其中曲线1为大肠杆菌E5，曲线2为大肠杆菌KO11。从实验 结果可知，在乙醇处理1分钟后，大肠杆菌E5有近70％的存活率，而大肠杆菌 KO11只剩不到20％的存活率；乙醇处理15分钟之后，大肠杆菌E5仍维持27％ 的存活率，而大肠杆菌KO11几乎全部致死。这些结果充分说明突变大肠杆菌 E5具备较高的乙醇耐受能力。

(2)与乙醇耐受性相关联的基因的确定

为了进一步研究突变大肠杆菌E5在基因组水平上发生了哪些突变，本发 明提取大肠杆菌E5基因组DNA并进行基于离子流(Ion-Torrent)平台的基因 组重测序。将大肠杆菌E5的测序结果与NCBI上公布的大肠杆菌KO11的基因 组(GeneBank：CP002516.1)序列比对发现：大肠杆菌E5基因组上存在一段 长为36.6Kb的大片段DNA缺失，该缺失位于基因EKO11_2989(ybjL)和 EKO11_3039(ybjK)之间，且刚好是一段属于Rybb*W(P2)的完整的原噬菌体 序列。现有技术还没有报道关于这段基因序列中乙醇耐受性相关的靶点。

为确认该段缺失是否赋予突变菌株乙醇耐受的表型，通过基因敲除手段， 敲除大肠杆菌KO11基因组中的上述36.6Kb的片段，然后考察基因敲除后所得 重组菌株对乙醇的耐受能力。具体操作如下：

以大肠杆菌KO11基因组为模板，PCR扩增基因敲除上下游同源臂；以质 粒pKD13为模板扩增卡那霉素抗性基因；并用OE-PCR方法将左右同源臂和抗 性基因连接构建敲除盒。扩增各个片段所用模板和引物的对应关系见表1。

表136.6Kb的片段敲除试剂盒的构建中各个引物与扩增片段的对应关系

将含有Red重组酶基因的质粒pKD46通过热激转化转入大肠杆菌KO11 中，通过含氨苄青霉素抗性的LB平板于30℃培养筛选，能够在含氨苄青霉素 抗性的LB平板上生长的转化子为导入质粒的重组菌株，挑取转化子过夜培养 后提取质粒测序验证重组菌株的正确性，验证结果为质粒pKD46已转入大肠 杆菌KO11，将所得重组大肠杆菌标记为大肠杆菌KO11(pKD46)。

取所得敲除盒通过电激转化转入诱导Red重组酶表达的大肠杆菌KO11 (pKD46)感受态细胞中，通过同源重组实现整段36.6Kb序列在大肠杆菌KO11 菌株中的敲除，采用卡那霉素抗性筛选方法筛选基因敲除菌株；

制备诱导Red重组酶表达的大肠杆菌KO11(pKD46)感受态细胞的具体 方法为：将大肠杆菌KO11(pKD46)甘油菌按体积比1:1000接种至含氨苄青 霉素的5mL LB培养基中30℃、220rpm培养过夜。将过夜培养物按初始OD₆₀₀为0.1接种于含氨苄青霉素的5mL LB培养基中，并加入L-阿拉伯糖(终浓度为 10mM)诱导Red重组酶的表达，30℃、220rpm培养至对数期(OD₆₀₀约为0.6)， 然后收集全部菌体，5000rpm离心2分钟后弃上清；用去离子水重悬细胞后， 5000rpm离心2分钟后弃上清，重复该步骤一次；取50uL 10％(v/v)甘油重悬 得到KO11(pKD46)感受态细胞。

获得重组菌株后，利用菌落PCR方法验证所得重组菌株的正确性，菌落 PCR验证所用的引物分别为：上游引物为具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序 列、下游引物为具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，若敲除成功扩增片段约 为3100bp，若不成功则扩增不出条带。菌落PCR验证结果如图2所示，其中泳 道1为大肠杆菌KO11扩增对照片段、泳道2为敲除成功的正确菌落扩增片段、 M为1Kb DNA Marker。菌落PCR验证结果与理论相一致，将泳道2所对应的重 组菌株进行测序，测序结果正确。从实验结果可知，成功获得了基因敲除菌 株，并将该敲除菌株命名为大肠杆菌D37K。

取大肠杆菌D37K、大肠杆菌KO11、大肠杆菌E5，分别在添加5％(v/v) 乙醇的含2％葡萄糖的LB培养基中培养，培养12h后，测定OD₆₀₀，进行生长测 试。测试结果见图3，其中1为大肠杆菌E5，2为大肠杆菌D37K，3为大肠杆菌 KO11。从测试结果可知，相比大肠杆菌KO11，大肠杆菌D37K和大肠杆菌E5 表现出显著的生长态势，这说明该段序列的删除确实有利于提高菌株的乙醇 耐受能力。

为了进一步找出36.6Kb序列中赋予乙醇耐受表型的关键基因靶点，本发 明将这36.6Kb分成四段逐一敲除，同时对敲除菌株进行乙醇耐受能力的测试。 对于有显著乙醇耐受能力的敲除菌株，则继续对该敲除片段分解分段逐次敲 除，依此类推，如图4所示，最后找到一个与乙醇耐受相关联的基因。图4为 从36.6Kb缺失片段中寻找乙醇响应靶基因的过程，以及过程中的基因敲除菌 株的生长测试结果。

该基因在NCBI公布的大肠杆菌KO11基因组上的基因编号为 EKO11_3023，该基因具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，现有报道中该基因 编码假设蛋白，具体功能尚不知，我们根据本发明鉴定的功能(乙醇敏感性 蛋白-ethanol sensitive protein A)将该基因命名为espA。将基因espA的核酸序 列及其蛋白序列进行blast，结果发现，该基因只存在于大肠杆菌W及其衍生菌 株(如大肠杆菌KO11等)、致病型E.coli UMNK88以及沙门氏菌的某些亚种， 但不存在于广泛使用的大肠杆菌K-12或大肠杆菌B及其衍生株中。本发明中， 将单个敲除espA的大肠杆菌KO11标记为大肠杆菌K011△espA。

(3)大肠杆菌K011△espA的构建方法和对短链醇的耐受性能的验证：

大肠杆菌K011△espA的构建方法：

将含有Red重组酶基因的质粒pKD46通过热激转化转入大肠杆菌KO11 中，通过含氨苄青霉素抗性的LB平板于30℃培养筛选，能够在含氨苄青霉素 抗性的LB平板上生长的转化子为导入质粒的重组菌株，挑取转化子过夜培养 后提取质粒测序验证重组菌株的正确性，验证结果为质粒pKD46已转入大肠 杆菌KO11，将所得重组大肠杆菌标记为大肠杆菌KO11(pKD46)。

设计espA基因敲除上游引物(具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列)、下 游引物(具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列)，以质粒pKD13为模板PCR扩 增含卡那霉素抗性基因筛选标记的敲除片段，然后琼脂糖凝胶电泳回收基因 敲除片段，即得espA基因敲除盒，基因敲除盒具有SEQ ID NO:10所示的核苷 酸序列。

取所得espA基因敲除盒通过电激转化到诱导Red重组酶表达的大肠杆菌 KO11(pKD46)感受态细胞中，通过含卡那霉素抗性的LB平板于37℃培养筛 选在含卡那霉素抗性的LB平板上生长的转化子，并挑取转化子进行菌落PCR 验证基因是否敲除成功，验证结果见图5，说明获得了敲除了espA基因的重组 菌株；同时，将该敲除了espA基因的重组菌株在含氨苄青霉素抗性的LB平板 上30℃划线培养，若无菌落生长表示重组菌株中不再含有质粒pKD46，若仍 有菌落生长表示重组菌株仍含有质粒pKD46，需要将菌株在LB培养基中37℃ 培养直至将其在含氨苄青霉素抗性的LB平板上30℃划线培养时无菌落生长。 敲除了espA基因的重组菌株的划线结果为无菌落生长说明重组菌株中不含有 质粒pKD46。然后，将质粒pCP20热激转化到验证正确的敲除了espA基因且不 含pKD46的的重组菌株，通过含氨苄青霉素抗性的LB平板于30℃培养筛选， 能够在含氨苄青霉素抗性的LB平板上生长的转化子为导入质粒的重组菌株， 挑取正确转化子，于含氨苄青霉素的5mL LB培养基中30℃培养过夜后，按体 积比1:100转接至5mL LB培养基中42℃培养12h后，再转接至5mL LB培养基中 42℃培养12h，以弹去卡那霉素抗性基因。之后在无抗生素的LB平板上划线培 养，挑取单菌落进行菌落PCR验证和测序，验证结果见图5。

菌落PCR验证所用的引物分别为：上游引物为具有SEQ ID NO:11所示的 核苷酸序列、下游引物为具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，若敲除成功 扩增片段约为2000bp，若敲除成功且卡那抗性基因弹出，则扩增片段为800bp， 若不成功则扩增片段为原始长度约2500bp。菌落PCR验证结果如图5所示，其 中泳道1为大肠杆菌KO11扩增对照片段、泳道2为含卡那霉素抗性基因的正确 菌落扩增片段、泳道3为敲除成功且弹出卡那霉素抗性基因的正确菌落扩增片 段、M为Trans2KplusII DNA Marker。菌落PCR验证结果与理论相一致，将泳 道3所对应的重组菌株进行测序，测序结果正确。实验结果证实，所得重组菌 株成功敲除了espA基因，将PCR验证正确且测序正确的菌株命名为大肠杆菌 K011△espA。

将所得大肠杆菌K011△espA进行生物保藏，生物保藏信息为：菌株K011 △espA：分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli于2014年09月11日保藏 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地 址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号 为CGMCC No.9647。

取大肠杆菌K011△espA，进行乙醇耐受性验证，具体方法如下：

将大肠杆菌K011△espA菌种按体积比1:1000接种至5mL LB培养基中37 ℃，220rpm培养过夜，将过夜培养物按初始OD₆₀₀为0.04，分别接种于添加3％、 4％、5％(v/v)乙醇的含2％葡萄糖的100mL LB培养基中(分别标记为实验组1、 实验组2、实验组3)，35℃，150rpm培养，分别于3小时、6小时、9小时、12 小时时取样，测OD₆₀₀。

大肠杆菌KO11作为对照组，培养方法为：

将大肠杆菌KO11菌种按体积比1:1000接种至5mL LB培养基中37℃， 220rpm培养过夜，将过夜培养物按初始OD₆₀₀为0.04接种于添加3％(v/v)乙醇的 含2％葡萄糖的100mL LB培养基中(标记为对照组)，35℃，150rpm培养，分 别于3小时、6小时、9小时、12小时时测OD₆₀₀。

实验结果见图6，其中曲线1为对照组、曲线2为实验组1(即乙醇添加3％)、 曲线3为实验组2(即乙醇添加4％)、曲线4为实验组3(即乙醇添加5％)。从 实验结果可知，相比大肠杆菌KO11，大肠杆菌K011△espA对乙醇耐受性得 到显著提高，差异显著，P＜0.05，其在5％(v/v)乙醇浓度下仍然比大肠杆 菌KO11在3％(v/v)乙醇浓度下的生长有优势。

取大肠杆菌K011△espA，进行异丙醇耐受性验证，具体方法如下：

将大肠杆菌K011△espA菌种按体积比1:1000接种至5mL LB培养基中37 ℃，220rpm培养过夜，将过夜培养物按初始OD₆₀₀为0.04，接种于添加4％异丙 醇的含2％葡萄糖的100mL LB培养基中(标记为实验组)，35℃，150rpm培养 12小时后测OD₆₀₀。以大肠杆菌KO11作为对照组，培养方法相同。

实验结果见图7，其中1为实验组，2为对照组。从实验结果可知，相比， 大肠杆菌KO11，大肠杆菌K011△espA对异丙醇耐受性得到显著提高，差异显 著，P＜0.05，说明espA基因为对异丙醇有敏感响应的基因。

取大肠杆菌K011△espA，进行正丁醇耐受性验证，具体方法如下：

将大肠杆菌K011△espA菌种按体积比1:1000接种至5mL LB培养基中37 ℃，220rpm培养过夜，将过夜培养物按初始OD₆₀₀为0.04，接种于添加0.9％正 丁醇的含2％葡萄糖的100mL LB培养基中(标记为实验组)，35℃，150rpm 培养12小时后测OD₆₀₀。以大肠杆菌KO11作为对照组，培养方法相同。

实验结果见图8，其中1为实验组，2为对照组。从实验结果可知，相比， 大肠杆菌KO11，大肠杆菌K011△espA对正丁醇耐受性得到显著提高，差异 显著，P＜0.05，说明espA基因为对正丁醇有敏感响应的基因。

综上所述，espA是对短链醇有敏感响应的基因，该基因具有SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列，该基因可用于短链醇耐受靶点，例如作为短链醇筛选标 记基因，或者通过基因工程手段以该基因为靶点以提高微生物对短链醇的耐 受性。本领域技术人员可以合理地推出，该基因的同源基因，即具有SEQ ID  NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核 苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，也 为对短链醇有敏感响应的基因，可用于短链醇耐受靶点。

实施例2短链醇敏感基因缺失菌株的构建及短链醇耐受性能研究

实验材料：

大肠杆菌W：购买自美国菌种保藏中心(ATCC)，菌株编号为ATCC(9637)；

实验方法：

将含有Red重组酶基因的质粒pKD46通过电激转化转入大肠杆菌W中，通 过含氨苄青霉素抗性的LB平板于30℃培养筛选，能够在含氨苄青霉素抗性的 LB平板上生长的转化子为导入质粒的重组菌株，挑取单菌落过夜培养后提取 质粒测序验证重组菌株的正确性，验证结果为质粒pKD46已转入大肠杆菌W， 将所得重组大肠杆菌标记为大肠杆菌W(pKD46)。

设计espA基因敲除上游引物(具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列)、下 游引物(具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列)，以质粒pKD13为模板PCR扩 增含卡那霉素抗性基因筛选标记的敲除片段，然后琼脂糖凝胶电泳回收基因 敲除片段，即得espA基因敲除盒，基因敲除盒具有SEQ ID NO:10所示的核苷 酸序列。

取所得espA基因敲除盒，通过电激转化到诱导Red重组酶表达的大肠杆菌 W(pKD46)感受态细胞中，通过含卡那霉素抗性的LB平板于37℃培养筛选 在含卡那霉素抗性的LB平板上生长的转化子，并挑取转化子进行菌落PCR验 证基因是否敲除成功，菌落PCR见图9。同时，将验证正确的敲除了espA基因 的重组菌株在含氨苄青霉素抗性的LB平板上30℃划线培养，若无菌落生长表 示重组菌株中不再含有质粒pKD46，若仍有菌落生长表示重组菌株仍含有质 粒pKD46，需要将菌株在LB培养基中37℃培养直至将其在含氨苄青霉素抗性 的LB平板上30℃划线培养时无菌落生长。敲除了espA基因的重组菌株的划线 结果为无菌落生长说明重组菌株中不含有质粒pKD46。然后，将质粒pCP20 热激转化到验证正确的敲除了espA基因且不含pKD46的的重组菌株，通过含氨 苄青霉素抗性的LB平板于30℃培养筛选，能够在含氨苄青霉素抗性的LB平板 上生长的转化子为导入质粒的重组菌株，挑取正确转化子，于含氨苄青霉素 的5mL LB培养基中30℃培养过夜后，按体积比1:100转接至5mL LB培养基中 42℃培养12h后，再转接至5mL LB培养基中42℃培养12h，以弹去卡那霉素抗 性基因。之后在无抗生素的LB平板上划线培养，挑取单菌落进行菌落PCR验 证和测序。

制备诱导Red重组酶表达的大肠杆菌KO11(pKD46)感受态细胞的具体 方法为：将大肠杆菌KO11(pKD46)甘油菌按体积比1:1000接种至含氨苄青 霉素的5mL LB培养基中30℃、220rpm培养过夜。将过夜培养物按初始OD₆₀₀为0.1接种于含氨苄青霉素的5mL LB培养基中，并加入L-阿拉伯糖(终浓度为 10mM)诱导Red重组酶的表达，30℃、220rpm培养至对数期(OD₆₀₀约为0.6)， 然后收集全部菌体，5000rpm离心2分钟后弃上清；用去离子水重悬细胞后， 5000rpm离心2分钟后弃上清，重复该步骤一次；取50uL 10％(v/v)甘油重悬 得到KO11(pKD46)感受态细胞。

菌落PCR验证所用的引物分别为：上游引物为具有SEQ ID NO:11所示的 核苷酸序列、下游引物为具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，若敲除成功 扩增片段约为2000bp，若敲除成功且卡那抗性基因弹出，则扩增片段为800bp， 若不成功则扩增片段为原始长度约2500bp。菌落PCR验证结果如图9所示，其 中泳道1为大肠杆菌W扩增对照片段、泳道2为含卡那霉素抗性基因的正确菌 落扩增片段、泳道3为敲除成功且弹出卡那霉素抗性基因的正确菌落扩增片 段、M为Trans2KplusII DNA Marker。将泳道3所对应的重组菌株进行测序，测 序结果正确。实验结果证实，所得重组菌株成功敲除了espA基因，将PCR验证 正确且测序正确的菌株命名为大肠杆菌W△espA。

将大肠杆菌W△espA菌种按体积比1:1000接种至5mL LB培养基中37℃， 220rpm培养过夜，将过夜培养物按初始OD₆₀₀为0.04，接种于添加2.5％乙醇的 含2％葡萄糖的100mL LB培养基中(标记为实验组)，35℃，150rpm培养，分 别于3小时、6小时、9小时、12小时时取样，测OD₆₀₀。以大肠杆菌W作为对照 组，培养方法相同，分别于3小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时 时取样，测OD₆₀₀。

实验结果见图10，其中1为实验组，2为对照组。从实验结果可知，大肠 杆菌W△espA的生长明显优于大肠杆菌W，说明大肠杆菌W△espA对乙醇耐 受性得到显著提高，差异显著，P＜0.05。说明敲除espA基因能够提高大肠杆 菌W对乙醇的耐受性。

实施例3短链醇敏感基因对大肠杆菌的短链醇耐受性能的影响

实验材料：

大肠杆菌MG1655(大肠杆菌K-12衍生株)：购买于耶鲁大学的大肠杆菌 遗传保藏中心(CGSC)；

大肠杆菌BL21(DE3)(大肠杆菌B衍生株)：购买于北京全式金生物技术 有限公司；

大肠杆菌DH5α感受态细胞购买于北京全式金生物技术有限公司

质粒pET-28a购买自美国Addgene公司，货号为69864-3。

实验方法：

为了进一步研究基因espA的表达对原本就不存在基因espA的大肠杆菌 MG1655和大肠杆菌BL21(DE3)的乙醇耐受能力的影响，将espA基因表达盒分 别导入大肠杆菌MG1655和大肠杆菌BL21(DE3)中，之后考察所得重组菌株的 乙醇耐受能力。

含espA基因表达盒的载体的构建：

设计espA基因扩增上游引物、下游引物，上游引物具有SEQ ID NO:13所 示的核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，以大肠杆 菌KO11基因组为模板PCR扩增基因espA的启动子区域、ORF框和终止子区域， 该片段具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，通过EcoRI和XbaI两个酶切位点 双酶切PCR扩增产物，同时用EcoRI和XbaI两个酶切位点双酶切质粒pET-28a 作为连接载体，经过琼脂糖凝胶电泳回收后进行连接，然后热激转化到大肠 杆菌DH5α感受态细胞中，然后通过卡那霉素抗性筛选转化子，挑取单菌落 进行菌落PCR验证重组质粒的正确性并测序。菌落PCR验证所用的引物分别 为：上游引物为具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列、下游引物为具有SEQ ID  NO:14所示的核苷酸序列，若目标基因插入质粒则扩增片段约为2500bp，否则 扩增不出条带。菌落PCR验证结果如图11所示，其中泳道1为未插入目标基因 的对照质粒扩增片段、泳道2为插入目标基因质粒的正确菌落扩增片段、M为 Trans2KplusII DNA Marker。菌落PCR验证结果与理论相一致，将泳道2所对应 的重组菌株进行测序，测序结果正确。将所得重组质粒标记为质粒pET(espA)。

重组菌株的构建：

将所得质粒pET(espA)通过热激转化导入大肠杆菌MG1655中，通过卡 那霉素抗性筛选获得转化子，挑取单菌落过夜培养后提取质粒验证重组菌株 的正确性，验证结果为质粒pET(espA)已转入大肠杆菌MG1655，将所得重 组大肠杆菌标记为大肠杆菌MG1655(pET-espA)。

将所得质粒pET(espA)通过热激转化导入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过 卡那霉素抗性筛选获得转化子，挑取单菌落过夜培养后提取质粒验证重组菌 株的正确性，验证结果为质粒pET(espA)已转入大肠杆菌BL21(DE3)，将所 得重组大肠杆菌标记为大肠杆菌BL21(DE3)(pET-espA)。

将pET-28a质粒通过热激转化导入大肠杆菌MG1655中，通过卡那霉素抗 性筛选获得转化子，挑取转化子提取质粒验证重组菌株的正确性，验证结果 为质粒pET-28a已转入大肠杆菌MG1655，将所得重组大肠杆菌标记为大肠杆 菌MG1655(pET)。将pET-28a质粒通过热激转化导入大肠杆菌BL21(DE3) 中，通过卡那霉素抗性筛选获得转化子，挑取转化子提取质粒验证重组菌株 的正确性，验证结果为质粒pET-28a已转入大肠杆菌BL21(DE3)，将所得重组 大肠杆菌标记为大肠杆菌BL21(DE3)(pET)。

取大肠杆菌MG1655(pET-espA)、大肠杆菌BL21(DE3)(pET-espA) 测试菌株在2.5％(v/v)乙醇压力下的生长情况，分别以大肠杆菌MG1655 (pET)、大肠杆菌BL21(DE3)(pET)作为对照，具体操作为：

将大肠杆菌菌种按体积比1:1000接种至5mL LB培养基中37℃，220rpm培 养过夜，将过夜培养物按初始OD₆₀₀为0.04，接种于添加2.5％乙醇的含2％葡萄 糖的100mL LB培养基中，35℃，150rpm培养，定点取样，测OD₆₀₀，统计各 个菌株的生长情况。

实验结果见图12，其中，曲线1代表大肠杆菌MG1655(pET-espA)，曲 线1’代表大肠杆菌MG1655(pET)；曲线2代表大肠杆菌BL21(DE3) (pET-espA)，曲线2’代表大肠杆菌BL21(DE3)(pET)。从图中可知，携带 质粒pET(espA)大肠杆菌MG1655(pET-espA)的生长相比携带空质粒pET-28a 的大肠杆菌MG1655(pET)的生长有9个小时的延滞，说明对基因espA的表达 能够削弱大肠杆菌MG1655的乙醇耐受能力。从图中也可知，携带质粒pET (espA)大肠杆菌BL21(DE3)(pET-espA)的生长相比携带空质粒pET-28a的 大肠杆菌BL21(DE3)(pET)的生长有9个小时的延滞，说明对基因espA的表 达能够削弱大肠杆菌BL21(DE3)的乙醇耐受能力。

以上实验结果进一步证实了基因espA是乙醇敏感性基因，是短链醇敏感 基因，该基因可用于短链醇耐受上。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指 出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要 求的保护范围内。