促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基及获得短周期烟草的方法

摘要

本发明公开了促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基及获得短周期烟草的方法，其生根培养基为含0.1mg/L的NAA、pH为5.6～5.8的1/2MS固体培养基，该培养基能够促进转烟草促早花基因NtFT5的烟草生根，生根后能够正常的开花结籽，并将促早花性状通过种子遗传至下一代，播种后成功获得稳定遗传的短周期烟草后代，且烟草的生命周期缩短至2.5个月，能够满足基因功能鉴定及烟草育种研究的需要，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养 基，还涉及利用该培养基获得周期烟草的方法。

背景技术

开花是作物生产中的一个重要的农艺性状，其受自主信号途径、光周期、春化途径及植 物激素赤霉素等信号途径综合影响。在拟南芥中，这些信号途径均通过磷脂酰乙醇胺结合蛋 白家族phosphatidylethanolamine-binding protein(PEBP)family成员发挥调控作用。在众多植物 中，PEBP家族成员之间已进化为相互拮抗的三个亚家族，它们是FLOWERING LOCUS T (FT)、TERMINAL FLOWER 1(TFL1)和MOTHER OF FT AND TFL1(MFT)。FT和MFT成员被 认为主要是促进开花的亚家族。拟南芥中过表达FT成员FT、TSF和MFT成员均能促进拟南芥 早花。

烟草作为一种模式生物，它具有最简单的生长习性和最可靠的转化过程。以烟草作为模式 植物，研究次级代谢产物生物合成途径、植物与细菌互作、植物与病虫害互作、维管组织的 形成以及花发育过程和花色均具有显著优势并已形成了研究特色。在众多植物中，许多关于 功能基因鉴定和顺式作用因子的基因组研究均以烟草为受体植物。然而，烟草生育周期长已 经成为烟草品种培育的主要限制因素。研究发现，拟南芥FT基因能缩短开花时间，还发现 烟草NtFT4，NtFT5也能促进烟草早花，但是现有条件下，此基因转化后植株尽管能在培养 基上早花，但是花朵通常很快凋零，不能形成种子，不能生根，不能获得稳定遗传的短周期 烟草苗。因此，急需一种能够获得稳定遗传的、短周期转基因烟草苗的方法，且获得的转基 因烟草缩短开花时间，能够生根并形成种子。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基； 本发明的目的之二在于提供利用所述培养基获得稳定遗传的、短周期烟草的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、促进转烟草促早花基因NtFT5烟草生根的培养基，所述生根培养基为含0.1mg/L的 NAA、pH为5.6～5.8的1/2MS固体培养基，所述1/2MS为大量元素减半的MS培养基。

优选的，所述生根培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，调节pH 至5.8。

2、利用所述培养基获得短周期烟草的方法，包括如下步骤：

A.以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，烟草cDNA为模板进行PCR扩增， 获得烟草促早花基因NtFT5，将扩增获得的烟草促早花基因NtFT5连入pCXSN载体Xcm I 酶切位点处，得NtFT5-pCXSN重组质粒；将所得NtFT5-pCXSN重组质粒转化农杆菌，得含 有NtFT5-pCXSN重组质粒的工程菌；

B.将步骤A所得工程菌采用叶盘法转化烟草，在含1mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA30g/L蔗 糖，8g/L琼脂，pH为5.8的MS培养基上共培养3天，然后在1mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA， 250mg/L羧苄青霉素，20mg/L潮霉素，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH为5.8的MS培养基上 诱导抗性苗，然后利用PCR筛选含有潮霉素基因的植株，得T0代转NtFT5基因烟草；

C.将步骤B所得T0代转NtFT5基因烟草在所述的培养基上生根培养，生根后移栽至培 养基质中培养至开花、结籽，将获得的种子萌发后获得短周期烟草。

优选的，步骤A中，所述PCR扩增的条件为95℃预变性3min；94℃变性30s，54.0℃退 火45s，72℃延伸40s，循环35次；最后72℃后延伸10min。

优选的，步骤A中，所述农杆菌为LBA4404。

本发明的有益效果在于：本发明针对烟草转促早花基因FLOWERING LOCUS T(FT)后， 难以生根结子、无法获得稳定遗传的短周期烟苗后代的情况，在生根培养基及培养方法上进 行了系统研究和优化，所得培养基生根率高，试管苗移栽成活率高，能产生可育性种子，成 功获得稳定遗传的短周期烟苗后代，转NtFT5基因烟苗的生命周期缩短至2.5个月，能够满 足基因功能鉴定及烟草育种研究的需要，具有良好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为NtFT5-pCXSN重组质粒示意图。

图2为转NtFT5基因烟草抗性苗。

图3为转NtFT5基因烟草在D3培养基中培养后生根情况。

图4转NtFT5基因烟草生根后移栽至泥炭栽培基质(品氏)中成功开花。

图5为NtFT5基因烟草T1代长势良好。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、烟草促早花基因(FLOWERING LOCUS T)NtFT5转基因载体构建

根据在Genbank烟草GSS数据库中(FH969747.1)序列设计扩增烟草NtFT5基因编码区 的引物，上游引物NtFT5-F为：5’-atgccaagagaacgtgaacc-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物NtFT5-R 为：5’-tcaatcggcagaccttctac-3’(SEQ ID NO.2)；然后以烟草叶片cDNA为模板，以SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示序列为引物，进行PCR扩增。PCR扩增体系为25μL，各组分体积如下： cDNA 1.0μL，NtFT5-F 1.0μL，NtFT5-R 1.0μL，Green Master Mix酶12.5μL，ddH₂O  9.5μL，然后按如下程序进行PCR扩增：95℃预变性3min；94℃变性30s，54.0℃退火45s， 72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸10min。

将PCR扩增产物按照Transgen公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit说明书进行回收 并纯化，获得纯化后的NtFT5扩增产物。

将pCXSN载体(pCXSN载体公开于Chen,S.,et al.,A versatile zero background T-vector  system for gene cloning and functional genomics.Plant Physiol,2009.150(3):p.1111-1121.质粒含 自杀基因ccdB，经Xcm I酶切产生末端T，可与带A末端的目的基因通过TA克隆策略，获 得含有目的基因的过表达载体)用NEB公司的Xcm I进行酶切，酶切体系如下：pCXSN质 粒1.4μg，Xcm I 1.0μL，NEB buffer 25.0μL，ddH₂O加至50μL，然后在37℃条件下酶切3 小时。酶切后将pCXSN载体线性片段进行回收，然后与回收的纯化的NtFT5扩增产物按摩 尔比为6:1～7:1连接，连接体系如下：

连接条件：25℃条件下连接3小时。

将连接产物加入-80℃取出刚融化的DH5α感受态，冰浴30min，然后42℃热激45s，冰 浴2min后加入300μL LB培养基，于37℃200rpm摇床培养1小时；培养后将菌液离心后 弃上清，将菌体涂至含50mg/L Kan的LB抗性平板上，于37℃恒温箱倒置培养过夜。

次日，挑单菌落至20μL ddH₂O中，采用菌落PCR对阳性克隆进行鉴定。PCR引物为：

NtFT5-F：5′-atgccaagagaacgtgaacc-3′(SEQ ID NO.1)；

NOS-R：5′-taaatgtataattgcgggactc-3′(SEQ ID NO.3)；

PCR体系如下：模板4.0μL，NtFT5-F 0.5μL，NOS-R 0.5μL，Green Master Mix 酶5μL；

PCR反应程序为：95℃预变性10min；94℃变性30s，52.0℃退火45s，72℃延伸50s， 循环28次；最后72℃延伸10min。

由于NOS-R引物距离目的基因插入位点下游200bp，因此，当扩增片段PCR产物长度比 NtFT5基因片段大约200bp时，则认定为初步筛选到正向连接的阳性克隆。将初步筛选到的 阳性菌液，取4.0μL至6mL LB(含Kan)液体培养基过夜培养，然后取500μL菌液送华大 测序。500μL待保存永久菌，5mL菌液离心收集沉淀存于-20℃。测序结果表明，NtFT5的 核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，且NtFT5基因片段连入了pCXSN载体，得NtFT5- pCXSN重组质粒，结构如图1所示。

实施例2、制备含NtFT5-pCXSN重组质粒的工程菌

将NtFT5-pCXSN重组质粒转化-80℃取出的农杆菌LBA4404感受态，具体如下：将 100～200ng NtFT5-pCXSN重组质粒加入感受态中，混匀，冰浴30min后，液氮浴1min，然 后于37℃条件下热激5min，加入800μL YEB培养基，于28℃200rpm培养4至6h；培养 后离心去800μL上清，剩余菌液悬浮后均匀涂布于YEB固体平板中(含100mg/L的Kan， 20mg/L的Str和40mg/L的Rif)，28℃暗培养36至48h，得含NtFT5-pCXSN重组质粒的工 程菌。

实施例3、转NtFT5基因烟草的获得

(1)叶盘法遗传转化烟草

取含NtFT5-pCXSN重组质粒的工程菌菌液，加至50mL YEB液体培养基中(含Kan、 Rif、Str)，28℃、200rpm条件下暗培养至对数生长期；转化材料选择生长2月左右的红花大 金元无菌苗(无菌苗培养基为：MS+30g/L蔗糖+8g/L Agar，pH 5.8)，转化前3日将生长 到2月左右无菌苗，避开边缘和主脉，将叶片用打孔器处理成直径0.5cm的叶盘，接种于含 1mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，30g/L蔗糖和8g/L Agar，pH为5.8的MS培养基上于28℃预 培养3天。然后将生长至对数生长期的含NtFT5-pCXSN重组质粒的工程菌于4000rpm离心 15分钟，弃上清，收集菌体，菌体用30mL MS液体培养基重悬。叶片用无菌镊子转移至重 悬菌液中，侵染10min，无菌滤纸吸干菌液，叶片转移至含1mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA， 30g/L蔗糖和8g/L Agar，pH为5.8的MS培养基上于28℃条件下暗培养3天。

(2)转基因植株的筛选

将暗培养的叶片用含500mg/L羧苄青霉素的无菌水洗涤4次，转移到含1mg/L 6-BA， 0.1mg/L NAA，250mg/L羧苄青霉素，20mg/L潮霉素，30g/L蔗糖，8g/L Agar，pH为5.8 的MS培养基上筛选培养，每两周继代一次，获得分化出来的抗性苗，结果如图2所示。然 后将分化出来的抗性苗扩增Hpt基因筛选阳性转基因植株，扩增Hpt基因的引物如下：

Hpt-F：5′-ctgctccatacaagccaaccac-3′(SEQ ID NO.5)；

Hpt-R：5′-gaaaaagcctgaactcaccgc-3′(SEQ ID NO.6)。

经检测共获得25株T0代转NtFT基因烟草。

(3)转基因植株的生根培养

为保证转基因阳性植株能顺利继代收种，将转基因阳性植株移至D1，D2，D3和D4四 种生根培养基中进行生根培养，统计生根情况，结果如表1所示。

生根培养基D1：1/2MS+30g/L蔗糖+7.5g/L Agar，pH 5.8；

生根培养基D2：1/2MS+250mg/L羧苄青霉素+20mg/L潮霉素+30g/L蔗糖+7.5g/L Agar，pH 5.8；

生根培养基D3：1/2MS+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L Agar，pH 5.8；

生根培养基D4：1/2MS+0.1mg/L NAA+250mg/L羧苄青霉素+20mg/L潮霉素+30g/L 蔗糖+7.5g/L Agar，pH 5.8。

表1、阳性转基因植株生根统计结果

结果显示，转基因阳性苗D3和D4四种生根培养基中都能生根，但是在D4生根培养基 中的生根率低，低于10％。另外，T₀代转基因阳性苗在D1，D2和D4 3种生根培养基上虽然 能够正常形成花蕾、开花，但由于花期较短，很难结籽。而在D3生根培养基上培养的T₀代 转基因阳性苗不但生根率高(图3)，移栽至培养基质中还可以成功开花(图4)并结籽，而 且获得的种子经播种后能萌发(图5)，且生长周期缩短至2.5个月。上述研究表明，本发明 通过优化生根培养基配方，能诱导转基因阳性植株生根，收T₀代转基因阳性植株的种子后， 能过获得稳定遗传的短周期烟草品系，该方法为烟草的遗传育种提供了基础。

上述实施例中MS培养基是1962年Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的培养基， 是植物组织培养中的常用培养基；1/2MS培养基是在MS培养基中大量元素减半的培养基。 生根培养基D4，是发明人针对烟草转促早花基因FLOWERING LOCUS T(FT)后优化获得的 培养基配方。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。