米诺环素用于妊娠期间应激所致的后代神经精神损伤的保护作用

摘要

本发明涉及医药技术领域，是米诺环素的一种新用途。经动物实验证明米诺环素具有神经保护作用，是一种较有发展前途的神经保护药物，因此可以用其制备治疗因母亲妊娠期间遭遇应激所致的神经精神类疾病或症状的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是米诺环素在神经保护方面的新用途，属于药物开发领域。 

背景技术

在多种精神疾病(psychiatric disorder)或称心理疾病(mental illness)如精神分裂症、自闭症、抑郁症等的发病过程中，常见中枢炎症引起的神经损伤。这里的神经损伤，是指中枢神经系统，主要是大脑的神经细胞受损。神经细胞是高等动物神经系统的结构单位和功能单位，包括神经元和胶质细胞。在大脑，一旦神经细胞受损，就可能导致精神类疾病的发生。因此，神经保护成为开发多种新型精神类疾病药物的靶点。 

目前，大部分的抗精神病药物都是以阻断脑内多巴胺受体，如多巴胺D2受体、5-羟色胺受体、肾上腺素能受体等，而发挥抗精神病作用。但这类抗精神病药物仅对部分患者有效，同时由于其药理作用广泛，不仅能作用于中枢系统，还对心脏和血液系统产生影响。因此，寻找一种靶点专一，作用强的药物成为此领域的一个新的研究方向。 

米诺环素(minocycline)，又称二甲胺四环素，是一种四环素类的衍生物。它是一种高度亲脂性的分子，可以穿透血脑屏障。药理学研究表明：米诺环素具有抗菌作用，抗菌谱与四环素相似。目前米诺环素主要用于治疗痤疮和其它皮肤感染，而关于米诺环素的神经保护作用尚有待开发。 

发明内容

本发明的目的在于提供米诺环素的一种新用途。 

经过动物实验发现米诺环素具有较好的神经保护作用，是一种较有发展前途的治疗精神类疾病的药物，尤其针对孕期大脑发育异常所致的精神疾病。 

具体实施方式

实验例1.米诺环素对妊娠大鼠应激所致的子代幼鼠神经元增殖和存活具有改善作用 

实验方法： 

妊期动物受应激后，子代容易出现精神分裂症、自闭症和抑郁症等精神疾病。本实验采用孕鼠睡眠剥夺的应激模型，对妊娠晚期18天的孕鼠进行小平台睡眠剥夺72小时，然后观 察其子代幼鼠神经元增殖和存活的变化。取刚断奶子代大脑进行冠状切片，对子代大脑海马区域的神经元增殖和存活(神经发生)进行检测。大脑神经发生主要用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和双皮质素(DCX)的染色来表示。用BrdU和DCX的抗体对切片进行双染色，然后用荧光显微镜统计海马区域BrdU和DCX双阳性细胞的数量变化。荧光显微镜为Olympus BX51，统计图片所用软件为ImageJ，version 1.45j。 

在实验中，20只幼鼠分为非应激-生理盐水、应激-生理盐水、非应激-米诺环素和应激-米诺环素四个实验组，每组5只动物。在幼鼠断奶时(即为21天大的时候)进行腹腔注射生理盐水或者米诺环素(50mg/kg)，前两天每天早晚各注射一次，然后接下来的三天每天早上注射一次。注射完后，进行灌注取脑切片，然后进行BrdU和DCX荧光染色，统计海马区域BrdU和DCX双阳性细胞的数量。 

实验结果： 

米诺环素对睡眠剥夺应激模型孕鼠的子代大脑海马区神经发生的影响如表1所示。实验结果显示，与非应激-生理盐水组相比，在应激-生理盐水组中，BrdU和DCX双阳性细胞减少。数据统计分析表明与应激-生理盐水组相比，米诺环素处理的应激孕鼠的子代，BrdU和DCX双阳性细胞显著增加了[F(3,18)＝135.50，p<0.01]，可以恢复到接近非应激-生理盐水组的水平。说明米诺环素对应激孕鼠的子代的神经损伤有修复作用，具有保护效应。 

表1 米诺环素对孕期应激大鼠的子代海马区神经发生的影响 

数据采用mean±SEM表示，^**p<0.01vs.非应激-生理盐水组，^##p<0.01vs.应激-生理盐水组。 

实施例2.米诺环素抑制应激孕鼠的子代小胶质细胞过度增殖，发挥神经保护作用 

实验方法： 

小胶质细胞是脑内的免疫细胞，来源于髓样前体细胞，在胚胎发育早期通过血管渗入到中枢神经系统中。大鼠小胶质细胞是在胚胎12-14天时出现的，随后数量大量增加，直到妊娠晚期，出生以后小胶质细胞逐渐停止增殖。当受外界环境刺激以后，小胶质细胞会迅速被激活并增殖。一旦在胚胎期过度激活，小胶质细胞将呈这种激惹状态，并且影响神经元存活，这种状态可一直持续到成年。小胶质细胞的激活和炎症细胞因子的分泌对于神经元的增殖、分化、存活和迁移起到重要的调节作用。Iba1(离子钙连接的配体蛋白)，可用来标记小胶质细胞。荧光显微镜和统计软件同实验例1。 

本实验采用孕鼠睡眠剥夺的应激模型，对妊娠晚期18天的孕鼠进行小平台睡眠剥夺72小时，然后观察米诺环素对其子代幼鼠小胶质细胞增殖的影响。在实验中，将20只幼鼠分为非应激-生理盐水、应激-生理盐水、非应激-米诺环素和应激-米诺环素四个实验组，每组5只动物。在幼鼠断奶时(即为21天大的时候)进行腹腔注射生理盐水或者米诺环素(50mg/kg)，前两天每天早晚各注射一次，然后接下来的三天每天早上注射一次。注射完后，进行灌注取脑切片，然后进行Iba1免疫荧光染色，统计海马区域Iba1阳性细胞的数量。 

实验结果： 

米诺环素对应激孕鼠的子代大脑中小胶质细胞过度增殖的影响如表2所示。实验结果显示，在应激-生理盐水组中，Iba1阳性细胞数量减少。统计分析表明与应激-生理盐水组相比，在应激-米诺环素处理组中，Iba1阳性细胞显著增加了[F(3,18)＝31.232，p<0.01]，并恢复到接近非应激-生理盐水组的水平。说明米诺环素对应激孕鼠的子代的小胶质细胞过度增殖有抑制作用，具有神经保护效应。 

表2 米诺环素抑制应激孕鼠的子代小胶质细胞过度增殖 

数据采用mean±SEM表示，^**p<0.01vs.非应激-生理盐水组，^##p<0.01vs.应激-生理盐水组。 

实施例3.米诺环素降低应激孕鼠的子代大脑促炎症细胞因子的表达 

实验方法： 

促炎症细胞因子是一系列可以促进炎症的细胞因子的总称。本实验采用孕鼠睡眠剥夺的应激模型，对妊娠晚期18天的孕鼠进行小平台睡眠剥夺72小时，然后观察米诺环素对其子代幼鼠大脑促炎症细胞因子表达的影响。在实验中，将32只幼鼠分为非应激-生理盐水、应激-生理盐水、非应激-米诺环素和应激-米诺环素四个实验组，每组8只动物。在幼鼠断奶时(出生后21天)给予腹腔注射生理盐水或者米诺环素(50mg/kg)，前两天每天早晚各注射一次，然后接下来的三天每天早上注射一次。注射完后，采集子代大鼠的脑组织，分离提取海马区域mRNA，进行荧光定量检测IL-1β，IL-6，TNF-α，CD68，和iNOS的表达。所用仪器为Bio-Rad CFX 96。 

实验结果： 

米诺环素对应激孕鼠的子代大脑中促炎症细胞因子的影响如表3所示。实验结果显示，在应激生理盐水组中，IL-1β，IL-6，TNF-α，CD68，和iNOS的表达均增加。统计分析表明 与应激-生理盐水组相比，米诺环素处理的应激孕鼠的子代，促炎症细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α，CD68，和iNOS的表达均降低[IL-1β：F(3,26)＝4.57，p<0.01；IL-6：F(3,26)＝8.46，p<0.01；TNF-α：F(3,26)＝9.01，p<0.01；CD68：F(3,26)＝7.57，p<0.01；iNOS：F(3,26)＝6.20，p<0.01]。实验结果表明米诺环素可以降低应激孕鼠的子代的促炎症细胞因子的表达，抑制炎症过程，起到神经保护的作用。 

表3 米诺环素降低应激孕鼠的子代大脑促炎症细胞因子的分泌 

数据采用mean±SEM表示，^*p<0.05，^**p<0.01vs.非应激-生理盐水组，^#p<0.05，^##p<0.01vs.应激-生理盐水组。 

实施例4.米诺环素增加应激孕鼠的子代大脑抗炎症细胞因子的表达 

实验方法： 

抗炎症细胞因子是一系列具有抗炎症活性的细胞因子的总称。本实验采用孕鼠睡眠剥夺的应激模型，对妊娠晚期18天的孕鼠进行小平台睡眠剥夺72小时，然后观察米诺环素对其子代幼鼠大脑抗炎症细胞因子表达的影响。在实验中，将32只幼鼠分为非应激-生理盐水、应激-生理盐水、非应激-米诺环素和应激-米诺环素4组，每组8只动物。在幼鼠断奶时(即出生后21天)进行腹腔注射生理盐水或者米诺环素(50mg/kg)，前两天每天早晚各注射一次，然后接下来的三天每天早上注射一次。注射完后，采集子代大鼠的脑组织，分离提取海马区域mRNA，进行荧光定量检测IL-4，IL-10，CD206，Arg1和Ym1的表达。所用仪器为Bio-Rad CFX 96。 

实验结果： 

米诺环素对应激孕鼠的子代大脑抗炎症细胞因子的影响如表4所示。实验结果显示，在应激生理盐水组中，IL-4，IL-10，CD206，Arg1和Ym1的表达均降低。统计分析表明与应激-生理盐水组相比，米诺环素处理的应激孕鼠的子代，IL-4，IL-10，CD206，Arg1和Ym1的表达均增加[IL-4：F(3,26)＝11.21，p<0.01；IL-10：F(3,26)＝11.86，p<0.01；CD206：F(3,26)＝8.39，p<0.01；Arg1：F(3,26)＝6.96，p<0.01；Ym1：F(3,26)＝18.90，p<0.01]。实验结果表明米诺环素可以提高应激孕鼠的子代中的抗炎症细胞因子的表达，抑制炎症过程，起到神经保护的作用。 

表4 米诺环素增加应激孕鼠的子代大脑抗炎症细胞因子的分泌 

数据采用mean±SEM表示，^*p<0.05，^**p<0.01vs.非应激-生理盐水组，^#p<0.05，^##p<0.01vs.应激-生理盐水组。